[0001] 本发明关于一种适合应用于增加发酵产品、功能性食品或乳制品的风味，并具有调节免疫和发炎症状的功能乳杆菌，特别是关于副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)K56(以下有时简称为K56)。

[0002] 目前发展中国家或发达国家，免疫失调症状或是免疫相关疾病，例如过敏(例如气喘、慢性鼻炎或是异位性皮肤炎(atopic dermatitis))或是发炎症状有越来越普及的趋势。使用类固醇是现行最常使用于治疗免疫症状或疾病的方法，但是却有容易诱发副作用的缺点，甚至有致死的风险。因此人们希望能在不引发副作用的前提下寻求更安全方便的方法来减轻或是预防过敏和免疫疾病。

[0003] 目前普遍已知乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)是存在一般环境中且对人体健康具有多重益处的一群菌种，然而，乳酸杆菌中却只有少数能被定义为所谓的“益生菌(Probiotics)”，原因在于，益生菌需要具备有能抗酸、抗胆盐、可以通过肠道并稳定生存于肠道中的特性，且对人体有健康助益。

[0004] 现在的健康产业正努力开发具有多功能且能作为食品添加物以提升产品价值的乳酸菌株。乳酸杆菌已有很长的食用历史，属于公认安全(G.R.A.S,Generally Regarded as Safe)的菌属，在适当条件培养下通常能产生良好的风味，有些菌株甚至能表现出绝佳的产酸能力以及优异的免疫调节功效，大幅提升产品价值。然而，由于不同菌株的特性与能力，乳酸菌的效果是可变的。因此，仍有必要发展具优异免疫调节和抗发炎活性的乳酸菌。

[0025] 本发明关于一种副干酪乳杆菌副干酪亚种K56(亦简称K56)，其十分适合应用于增加发酵产品、功能性食品或乳制品的风味，并具有调节免疫和发炎症状的功能。为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文仅以例示为目的，举出较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。发明所属技术领域中技术人员不违背本发明的技术原理及精神下，可轻易完成的改变或修饰，均属本发明所主张的范围。

[0026] 以下实施例的试验结果的数据皆以平均值±平均数标准误差(Means±SEM)表示。统计分析使用单向方差分析(One-way analysis of variance(One-way ANOVA))，并以Tukey多重比较检定(Tukey's Multiple Comparison Test)作为后测比较组间差异。当p<
0.05(*)或<0.01(**)或<0.001(***)时，表示控制组和其他组别间的差异被认为具有统计学意义；当p<0.05(#)或<0.01(##)或<0.001(###)时，表示对照组(即图3的PHA组、图4的LPS组及图5、6、7、8的OVA组)和其他组别间的差异被认为具有统计学意义。

[0027] 实施例1：16s rRNA和pheS基因序列鉴定

[0028] K56分离自台湾孩童的粪便，分离株K56以MRS培养基于37℃下培养一天后，抽取其基因组DNA。为了确认分离株K56在微生物分类上的地位，使用16S rRNA和pheS基因引物(如表1所示)对取自分离株K56基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，并定序增殖后的核苷酸片段。

[0029] 表1、16S rRNA和pheS基因引物序列

[0030]

[0031] 经定序的分离株K56核苷酸片段利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库中的比对软件将16S rRNA及pheS基因片段与厚壁菌门(Firmicutes)所属菌株的典型16S rRNA及pheS基因片段进行手动比对。进行比对时，厚壁菌门所属菌株的典型16S rRNA及pheS基因片段皆取自NCBI线上数据库。分析比对结果如下表2及3所示。

[0032] 表2为利用16S rRNA基因引物进行增殖的序列比对结果。分离株K56的16S rRNA基因序列相同于另两株副干酪乳杆菌副干酪亚种的菌株(D79212、AB181950)，但和其他几株乳杆菌属的菌株有些序列上的差异。因此，分离株K56可以确认为副干酪乳杆菌。

[0033] 表2.16S rRNA序列的比对结果

[0034]

[0035] 为进一步辨识K56的身份，利用pheS基因引物增殖的序列进行进一步序列比对，其中，因菌种库编号的不同，表2所述的D79212(16S rRNA)与表3所述的AM087710(pheS)编号虽相异但为同一株菌，而表2所述的AB181950(16S rRNA)与表3所述的AM087711(pheS)编号虽相异但亦为同一株菌。

[0036] 表3、pheS序列的比对结果

[0037]

[0038]

[0039] 如表3所示，分离株K56与副干酪乳杆菌副干酪亚种(L.paracasei subsp.paracasei)(AM087710)和副干酪乳杆菌坚韧亚种(L.paracasei subsp.tolerans)(AM087711)近似度虽分别高达92.0％和91.6％，但仍非完全相同，且与其他种类的乳酸菌近似度明显较低，因此可以判定分离株K56为一种新的副干酪乳杆菌副干酪亚种。

[0040] 实施例2：副干酪乳杆菌K56的发酵能力测试

[0041] 为了进一步确认分离株K56的亚种，利用API 50CHL快速鉴定套组(bioMerieux,France)测试分离株K56对各种不同碳水化合物基质的发酵能力，结果如表4所示。API 50CHL快速鉴定套组的发酵能力分析结果显示，分离株K56的生化特性高度近似于副干酪乳杆菌副干酪亚种，因此，可以推测分离株K56确实为副干酪乳杆菌副干酪亚种，但是在乳酸杆菌属中仍属于新菌种。

[0042] 经过鉴定确认分离株K56所属菌种后，副干酪乳杆菌副干酪亚种K56根据布达佩斯协定(Budapest Treaty)，于2013年6月27日寄存于德国布伦瑞克D-38124英豪丰大街7B的德国微生物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(Inhoffenstr.7 B,D-38124 Braunschweig,Germany)，并由国际寄存单位给予DSMZ寄存编号为DSM27447。

[0043] 表4、副干酪乳杆菌副干酪亚种K56对各种不同碳水化合物基质的发酵能力[0044]

[0045] 实施例3：副干酪乳杆菌副干酪亚种K56的产酸能力测试

[0046] 将培养于MRS培养基(Man,Rogoa,Sharpe培养基)中的副干酪乳杆菌副干酪亚种K56取出，并转移至以脱脂牛奶为基础的培养液，在37℃下培养24小时、48及72小时，取出发酵后的培养液(发酵液)，检测培养液(发酵液)的酸碱值并进行酸滴定试验。

[0047] 在以下实施例的描述中，“代田菌”表示待测菌株为分离自著名乳酸菌饮料养乐多的干酪乳杆菌代田株(Shirota)。代田菌已知具有良好的免疫调节能力。

[0048] 在酸滴定试验中，每5公克发酵后的培养液混合于20毫升的纯水，并以浓度0.1N的氢氧化钠进行滴定，以计算待测菌株的产酸量。乳酸菌产酸量计算公式如下：

[0049] 产酸量(％)＝0.1N氢氧化钠体积(毫升)×F×0.009/发酵后的培养液重量(公克)×100

[0050] 请参考图1，图1说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌于生长过程中环境酸碱值的变化。经过48小时的培养后，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56展现了绝佳的酸化能力，其增加发酵液酸度的能力和代田菌不相上下。

[0051] 请参考图2，图2说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌的产酸表达。经过48小时的培养后，副干酪乳杆菌副干酪亚种K56展现绝佳的产酸能力，产酸速率和代田菌十分接近。

[0052] 因此，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56的优异产酸效能使其十分具有商业应用的潜力。

[0053] 实施例4：制备副干酪乳杆菌副干酪亚种K56

[0054] 将副干酪乳杆菌副干酪亚种K56接种于MRS液体培养基里，并且在37℃厌氧培养48小时。K56活菌的制备，是将经培养后的K56用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两次，然后于PBS中再悬浮至所欲的最终浓度(如1010CFU/mL)。经热去活化的K56的制备，则是依所欲浓度，如将1010CFU/mL的K56在100℃热去活化20分钟，而后储存在-20℃冰箱备用。

[0055] 实施例5：体外免疫调节反应试验

[0056] 人类周边血液单核细胞(Human Peripheral Blood Mononuclear Cells，hPBMCs)包括了多种免疫细胞和少量的自然杀手细胞(natural killer cell)，广泛应用于研究免疫反应和细胞因子(cytokines)的分泌，可用以评估乳酸菌的免疫调节能力。

[0057] 目前已知辅助T细胞(helper T cell)中的Th1细胞可以分泌干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，并且刺激B细胞分泌免疫球蛋白G(IgG)，而Th2细胞则可以分泌介白素-4(Interleukin-4，IL-4)、IL-5、IL-13和刺激B细胞分泌免疫球蛋白E(IgE)。在正常状况下，Th1细胞和Th2细胞具有相互拮抗的作用，当Th1细胞增加时，IFN-γ会抑制Th2细胞的过度表达并且降低Th2细胞的免疫反应。此外，由Th2细胞分泌的细胞激素也会抑制Th1细胞的活化以减少Th1细胞的免疫反应。而过敏原会促进Th2细胞的反应及增加IgE的分泌而引发过敏。

[0058] 此外，调节T细胞(regulatory T cell，Treg)、辅助T细胞和B细胞则会分泌IL-10，IL-10有助于抑制发炎反应并调节免疫反应。

[0059] 因此，藉由检测IFN-γ和IL-10的含量可以评估并比较不同乳酸菌的免疫调节功能，以鉴别出具有免疫调节潜力且能适度增加Th1细胞反应或减少Th2细胞反应的理想乳酸菌株。

[0060] 本试验利用人类周边血液单核球细胞模式来测试本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56的免疫调节能力。

[0061] 本试验中的人类周边血液单核细胞分离自健康捐赠者的静脉血液，方法如后。将静脉血加到肝素抗凝管中后，加入Ficoll-PaqueTM PLUS单核细胞分离液混合均匀，并由棕黄层(buffy coat)取得人类周边血液单核细胞。使用Turk试剂进行细胞计数后，利用RPMI-1640细胞培养液清洗细胞并将细胞浓度调整至2×106细胞/ml备用。在96孔细胞培养盘中，每孔加入2×105个人类周边血液单核细胞，及108CFU经热去活化处理的副干酪乳杆菌副干酪亚种K56、代田菌或可以增加T细胞活性及促进增生的植物血球凝集素
(phytohaemagglutinin，PHA)。将培养盘置于含10％二氧化碳的培养箱中，以37℃培养48小时后，收集细胞培养上清液，以酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定IFN-γ及IL-10的含量。

[0062] 请参考图3A和图3B，图3A说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌促进hPBMC细胞分泌IFN-γ的能力。图3B说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌促进hPBMC细胞分泌IL-10的能力。由图中可看出，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56具有促进hPBMC分泌IFN-γ及IL-10的能力，且K56促进细胞分泌IFN-γ及IL-10的能力与知名的商业用乳酸菌株代田菌相近。由此可预期，副干酪乳杆菌副干酪亚种K56确实具有调节免疫反应的潜力。

[0063] 实施例6：体外抗发炎反应试验

[0064] 目前脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)被认为是用来诱发发炎反应的重要因子之一，因为脂多糖可以促进转录因子NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)活化，进而增加诱导型一氧化氮合成酶(inducible Nitric Oxide synthase，iNOS)和环氧合酶-2(cycloxgenase-2，COX2)的表达，以产生一氧化氮和前列腺素(Prostaglndin E2，PGE2)，并引发发炎反应。

[0065] 因此，iNOS和COX2的表达量可以作为乳酸菌抗发炎反应的检测指标。转基因巨噬细胞株RAW 264.7-iNOS及RAW264.7-COX2是分别将iNOS与COX2基因的操控子区段接于荧光素酶(luciferase)基因前面，再转殖入巨噬细胞中所构建成的细胞评估系统。当iNOS和COX2受到基质的作用而启动时，荧光素酶即会被表达而产生荧光反应。

[0066] 两细胞株RAW264.7-iNOS及RAW264.7-COX2分别培养于12孔盘(5×105细胞/孔)24小时后，以新鲜DMEM细胞培养液前处理一小时，再加入LPS(1μg/mL)刺激三小时。之后移除细胞培养液，每一孔槽分别加入悬浮于DMEM细胞培养液、浓度为1×107CFU/mL(细胞数：菌数＝1：20)的K56或代田菌的热去活化菌体，培养24小时后，移除细胞培养液，并且加入被动裂解液(passive lysis buffer)反应30分钟，收集上清液，进行荧光素酶冷光分析。

[0067] 请参照图4A和图4B，图4A说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌在巨噬细胞受脂多糖刺激后，抑制细胞表达iNOS的能力。图4B说明本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56和代田菌在巨噬细胞受脂多糖刺激后，抑制细胞表达COX2的能力。由图中可看出，LPS确实可以明显增加iNOS和COX2的表达，然而，本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56却可以有效的抑制iNOS和COX2的表达，具有减缓或消除发炎反应的作用。

[0068] 实施例7：动物模式中抗过敏气喘调节功能

[0069] 本实施例中，以BALB/c小鼠模式来测试本发明副干酪乳杆菌副干酪亚种K56的抗过敏气喘能力。将BALB/c小鼠分为3组，每组五只，分别喂食水(控制组、OVA组)及热去活化9
的副干酪乳杆菌副干酪亚种K56(浓度为10CFU/200μl)。

[0070] 在第0天和第14天，除了控制组之外各组小鼠，以腹腔注射OVA(浓度为20μg OVA/2mg氢氧化铝(aluminum hydroxide)/200μl PBS)以引发小鼠的全身性过敏反应。

[0071] 在第0、15和22天，对小鼠进行采血，并检测血液中总免疫球蛋白E(IgE)的含量，以确认小鼠是否已被致敏。对于已致敏的小鼠，于第28天、第29天、第30天，鼻腔滴入100μg OVA/40μL PBS，诱发小鼠呼吸道过敏反应。第31天，再以雾化的甲基胆碱(methacholine)刺激小鼠气管平滑肌收缩，并利用全体腔呼吸测量系统(barometric  whole-body plethysmography，Buxco Electronics,Inc.,Troy,NY)侦测呼吸道阻力(airway 
hyperresponsiveness,AHR)变化，以评估小鼠气喘程度。第32天牺牲小鼠采集肺冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、血清等，以进行后续分析。

[0072] 请参考图5，图5说明对小鼠施以不同浓度的雾化甲基胆碱后，呼吸道的收缩程度。随着甲基胆碱浓度增加(6.25、12.5、25mg/ml)，控制组小鼠呼吸道仅呈现轻微程度的收缩状态，OVA组小鼠呼吸道收缩程度非常明显，而副干酪乳杆菌副干酪亚种K56明显可改善OVA致敏小鼠气喘程度。

[0073] BALF含有多种的细胞激素，比较致敏前后的细胞激素浓度变化，有助于厘清乳酸菌对于改善气喘症状，以及调节呼吸道黏膜免疫平衡的功效。

[0074] 请参考图6A、6B和6C，图6A说明小鼠BALF中Th2类型细胞激素IL-4的含量。图6B说明小鼠BALF中Th2类型细胞激素IL-5的含量。图6C说明小鼠BALF中Th2类型细胞激素IL-13的含量。由图中可看出，副干酪乳杆菌副干酪亚种K56具有优异的能力可以降低致敏气喘小鼠的Th2类型细胞激素(IL-4、IL-5和L-13)的表达，以降低Th2细胞的活性，而达到抑制过敏反应的功效。

[0075] 请参考图7所示，图7说明小鼠BALF中促发炎细胞激素(proinflammatory cytokine)肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量。由图中可看出，相对于喂食OVA的组别，喂食副干酪菌K56可以明显降低TNF-α的分泌，显示K56有助改善致敏气喘小鼠因气喘而伴随的呼吸道发炎反应。

[0076] 目前已知Th2细胞的过度表达是促进B细胞释出免疫球蛋白E(IgE)的重要因素，请参考图8，图8说明小鼠血清OVA特异性IgE(OVA-IgE)表达量。由图中可看出，喂食副干酪乳杆菌副干酪亚种K56的小鼠，其血清中OVA特异性IgE的浓度明显低于OVA组，显示K56具备改善过敏反应的功效。

[0077] 综上所述，在小鼠模式中，AHR测试结果、BALF分析结果、OVA特异性IgE表达结果都显示副干酪乳杆菌副干酪亚种K56具有卓越的能力可以改善过敏及气喘症状。而特异性抗过敏调节试验也显示出副干酪乳杆菌副干酪亚种K56对于免疫调节都可以呈现出良好的成效，因此副干酪乳杆菌副干酪亚种K56确实为极具潜力的益生菌，可以作为乳制品、饮品或是乳品的添加物，并发挥改善过敏症状和调节免疫力的功能。此外，副干酪乳杆菌副干酪亚种K56也可以和一生物可相容的赋形剂相混合，以制备成溶液、悬浮液、乳剂、粉末、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、或胶囊的剂型，供一般应用或医药使用。

[0078] 上述实施例仅为例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明的范围。任何该领域技术人员均可在不违背本发明的技术原理及精神下，对实施例作修改与变化。因此本发明的权利保护范围应如权利要求书所述。

[0079] 生物材料寄存

[0080] 国外寄存资讯【请依寄存国家、机构、日期、号码顺序注记】

[0081] 德国、德国微生物保藏中心、2013年6月27日寄存、寄存编号为DSM27447。