[0001] 本发明涉及医疗分析装置和细胞分析方法，其可以捕获存在于血液或生物流体中的特定细胞(例如存在于血液或生物流体中的癌细胞)。

[0002] 当癌细胞形成时，已知其在适当的时候会出现在血液或生物流体中。血液中的这种癌细胞称为“循环肿瘤细胞(CTCs)”。因此，可以预期检测循环肿瘤细胞来例如确认癌症治疗效果，预测预后寿命，预测给药前抗癌药物的效果，或通过癌细胞的遗传分析测试治疗方法。

[0003] 然而，存在的问题在于，由于循环肿瘤细胞的数量非常少(数个到数百个细胞/1mL血液)，所以这样的癌细胞难以捕获。

[0004] 例如，CellSearch System被称为用于捕获循环肿瘤细胞的技术。这种利用抗原抗体反应(EpCAM抗体捕获)的技术只能捕获表达EpCAM的癌细胞，并且可捕获的癌细胞的类型受到限制。

[0005] 引用列表

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：JP 2005-523981T

[0031] 本发明涉及具有孔部的医疗分析装置。该孔部具有至少部分地形成在其内表面上的亲水性聚合物层，并且所述亲水性聚合物层具有吸附在其上的纤连蛋白。

[0032] 由于亲水性聚合物层不是简单的至少部分地形成在孔部的内表面上，而是纤连蛋白进一步吸附到亲水性聚合物层上，因此亲水性聚合物显示出能显著提高粘附(吸附)特定细胞如癌细胞的能力。因此，捕获特定细胞如癌细胞的能力大大提高，同时降低捕获其它细胞如血小板的能力。结果是，实现当蛋白质以高水平存在时不可能产生的选择性捕获特定细胞的效果。

[0033] 具体地说，由于生物流体中出现的肿瘤细胞(例如癌细胞)如循环肿瘤细胞(数个至数百个细胞/1毫升血液)的数量非常少，所以重要的是在采样的生物流体中捕获尽可能多的肿瘤细胞去分析它们。在本发明中，由于亲水性聚合物层不是简单地形成，而是能促进粘附(吸附)肿瘤细胞的纤连蛋白被进一步吸附到亲水性聚合物层的表面上，因此生物流体如血液中更多的肿瘤细胞或其它特定细胞可通过使生物流体与亲水性聚合物层接触而吸附或附着到亲水性聚合物层上。然后，可以预期，例如为了确认癌症治疗效果，计数吸附的特定细胞如肿瘤细胞的数量，以确定血液或生物流体中的特定细胞的数量。此外，可以培养所捕获的特定细胞，然后用于确定药物如抗癌药物的效果。这使得我们能够在给药之前确定药物如抗癌药物的离体效果，还有助于筛选药物如抗癌药物。

[0034] 以下参考附图描述本发明的优选实施方式的实施例。

[0035] 图1A和1B所示的医疗分析装置1(多孔板1)是其中孔11以所谓的矩阵形式排列的用于捕获特定细胞例如癌细胞的装置。多孔板1具有多个具有圆形开口的孔11。孔11是向其中注入血液、生物流体或其它的凹槽，可以用于确认在注入的血液或生物流体中特定细胞的存在或不存在，计数特定细胞，培养特定细胞，确定药物的效果，和筛选药物。

[0036] 虽然图1A和1B示出了具有以4行×6列排列的24个孔11的24孔板作为例子，但是多孔板1具有至少两个孔11就足够了，并且多孔板1可以具有任何数量的孔11。除了24孔板之外的实例包括其中孔11的数量为6、96、384等的通用多孔板。

[0037] 至于孔11的数量，也可以是单孔2(医疗分析装置2)(图1C)。

[0038] 多孔板1或单孔2的材料应当是高度透明的，以用于在细胞分析时观察，其实例包括丙烯酸树脂(聚丙烯酸树脂)如聚甲基丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，环烯烃树脂(聚环烯烃)，碳酸酯树脂(聚碳酸酯)，苯乙烯树脂(聚苯乙烯)，聚酯树脂如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚二甲基硅氧烷和玻璃(例如硼硅酸盐玻璃，钠钙玻璃)。该材料应该是高亲水性的，以用于亲水性聚合物涂覆，并且优选的是聚丙烯酸树脂和钠钙玻璃。

[0039] 每个孔11是在多孔板1或单孔2的表面开口的非通孔。血液或生物流体通过相应的开口注入孔11中。如果确认了特定细胞例如癌细胞的存在，也可以注射用于培养特定细胞的培养液。

[0040] 每个孔11的开口的直径R和深度D没有特别限制，可以是常规的多孔板1的直径R和深度D。虽然如图1所示，每个孔11的内侧表面基本上垂直于多孔板1或单孔2的相对侧，但每个孔11的内侧表面可以倾向于从开口向底部变细。或者，内侧表面可以倾向于从开口向底部扩张。

[0041] 尽管如图1所示，孔11是圆形开口，但是孔11的开口可以是任何形状，例如四边形。

[0042] 多孔板1可以适当地是其中多个孔11是可分离的多孔板。由于具有多个孔，因此可将其分成用于计数特定细胞的数量和用于培养特定细胞的孔。例如，首先在用于计数的孔中确认是否有癌细胞，如果确认存在，则在用于培养的孔中培养癌细胞，然后用于确定药物的作用。

[0043] 在多孔板1(医疗分析装置1)或单孔2(医疗分析装置2)中，每个孔11具有至少部分地形成在其内表面上的亲水性聚合物层，并且亲水性聚合物层具有吸附在其上的纤连蛋白。图1示出了在孔的底表面和侧表面的一部分上形成亲水性聚合物层21并且纤连蛋白31吸附到亲水性聚合物层21上的情况。

[0044] 一旦将血液或生物流体导入到孔11中，则存在于血液或生物流体中的特定细胞如癌细胞吸附到吸附有纤连蛋白31的亲水性聚合物层21上，同时减少其它细胞如血小板和红细胞的吸附。因此，通过将血液或生物流体导入并保留在孔中预定时间，然后洗涤，可以将特定细胞吸附到亲水性聚合物层21上。然后，可以预期，例如为了确认癌症治疗效果，计数吸附的特定细胞的数量以确定血液或生物流体中的特定细胞例如癌细胞的数量。

[0045] 亲水性聚合物层21(由亲水性聚合物形成的层)的厚度(膜厚)优选为2～200nm，更优选为20～180nm。当将厚度调节到上述范围内时，可以很好地实现癌细胞的选择性吸附或粘附，以及其他蛋白质和细胞的低吸附。

[0046] 亲水性聚合物可以适当地选自具有亲水性的聚合物。例如，它可以是一种或两种以上亲水性单体的均聚物或共聚物，或一种或两种以上亲水性单体与第二种单体的共聚物。均聚物和共聚物的实例包括聚丙烯酸，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸，聚甲基丙烯酸酯，聚丙烯酰基吗啉，聚甲基丙烯酰吗啉，聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺。

[0047] 亲水性单体可以是含有亲水基团的任何单体。亲水基团的实例包括已知的亲水基团，例如酰胺基，硫酸基，磺酸基，羧酸基，羟基，氨基和氧乙烯基。

[0048] 亲水性单体的具体实例包括(甲基)丙烯酸，(甲基)丙烯酸酯(例如，烷氧基烷基(甲基)丙烯酸酯如甲氧基乙基(甲基)丙烯酸酯，和羟基烷基(甲基)丙烯酸酯如(甲基)丙烯酸羟乙酯)，(甲基)丙烯酰胺，和含有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物(例如(甲基)丙烯酰吗啉)。

[0049] 只要不抑制亲水性聚合物的效果，可以适当选择第二单体。实例包括可赋予温度响应性的芳族单体如苯乙烯，乙酸乙烯酯和N-异丙基丙烯酰胺。

[0050] 特别地，亲水性聚合物优选为选自聚(甲基)丙烯酰基吗啉和下式(I)表示的聚合物中的至少一种，

[0051]

[0052] 式中R1表示氢原子或甲基，R2表示烷基，m表示1～5，n表示重复数。

[0053] 由R2表示的烷基优选碳原子数为1～10，更优选为1～5。特别地，R2特别优选为甲基或乙基。符号m优选为1～3，n(重复单元数)优选为15～1000，更优选为30～500。

[0054] 或者，亲水性聚合物也可以适当地为选自(甲基)丙烯酰基吗啉和下式(I-1)表示的化合物的至少一种亲水性单体与第二单体的共聚物，

[0055]

[0056] 式中R1，R2和m如上定义。

[0057] 从选择性吸附或粘附癌细胞的观点出发，亲水性聚合物的重均分子量(Mw)优选为4000～150000，更优选为5000～100000，进一步优选为8000～50000。本文使用的Mw可以通过凝胶渗透色谱法(GPC)(由TOSOH Corporation制造的GPC-8000系列，检测器：差示折射计，色谱柱：由TOSOH Corporation生产的TSKGEL SUPERMULTIPORE HZ-M)用聚苯乙烯标准品校准测量得到。

[0058] 为了将纤连蛋白31吸附到亲水性聚合物层21上，可以适当地使用溶液或分散液等液体，其纤连蛋白浓度优选调整为0.5～500μg/ml，更优选为1～250μg/ml。当浓度被调整到上述范围内时，可以很好地实现癌细胞的选择性吸附或粘附，以及其他蛋白质和细胞的低吸附。

[0059] 本发明的医疗分析装置可以例如通过制备如图1所示的包括孔11的多孔板1或单孔2，任选地随后添加其他部件(零件)来制造得到，在孔11的内表面上形成具有吸附在其上的纤连蛋白31的亲水性聚合物层21。

[0060] 具体地说，当希望制备其上形成有亲水性聚合物层21的多孔板1或单孔2时，具有亲水性聚合物形成的聚合物层的多孔板或单孔可以通过如下方式制造：将亲水性聚合物溶解或分散在任何溶剂中以制备亲水性聚合物溶液或分散体，并通过已知方法将亲水聚合物溶液或分散体全部或部分地涂覆在每个孔11的内表面上，例如(1)通过将亲水性聚合物溶液或分散体注入到孔11中并保持预定时间，或(2)通过将亲水性聚合物溶液或分散体涂布(喷雾)到孔11的内表面上。

[0061] 溶剂，注射方法，涂布(喷雾)方法和其它条件可以是常规已知的材料或方法。

[0062] 方法(1)或(2)中的保留时间可以根据孔11的尺寸，引入的液体的种类等因素适当选择，优选为5分钟至10小时，更优选为10分钟至5小时，进一步更优选15分钟至2小时。保留后，可以根据需要排出过量的亲水性聚合物溶液或分散体，然后干燥。

[0063] 接下来，纤连蛋白31可以通过任何已知的方法吸附到已形成的亲水性聚合物层21上，例如通过已知的方法使亲水性聚合物层21与含有纤连蛋白31的缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))接触，并在预定温度下将其放置预定时间，任选地随后洗涤。可以适当选择温度和时间，并且可以分别为例如约10至60℃和约0.1至10小时。

[0064] 然后，如果需要，将其它部件添加到制备好的多孔板1或单孔2中，其中吸附有纤连蛋白31的亲水性聚合物层21在孔11的内表面上部分地形成，从而制得医疗分析装置。

[0065] 在本发明中，优选使用吸附有纤维蛋白原的部件作为其他部件。当要分析的血液或生物流体与在血细胞粘附中起作用的具有吸附的纤维蛋白原的部件接触时，血细胞数在分析之前减少，从而导致特定细胞如癌细胞的粘附或吸附提高。

[0066] 本发明的细胞分析方法是使用上述医疗分析装置检测存在于血液或生物流体中的细胞。如上所述，本发明的医疗分析装置具有改善捕获特定细胞如癌细胞的能力，同时降低了捕获诸如血小板的其他细胞的能力，因此具有选择性捕获特定细胞如癌细胞的作用。因此，可以预期这种装置可用于检测存在于血液或生物流体中的细胞，例如为了确认癌症治疗效果，如上所述确定药物如抗癌药物的离体效果，和/或筛选药物如抗癌药物。

[0067] 在细胞分析方法中，为了提前减少血细胞数以改善特定细胞如癌细胞的粘附或吸附，优选血液或生物流体在导入(例如注射或滴加)到医疗分析装置中之前与吸附有纤维蛋白原的部件接触。例如，当吸附有纤维蛋白原的部件是采血注射器，采血管或离心管时，可以显著地实现上述效果。

[0068] 在细胞分析方法中，为了提前减少血细胞数以改善特定细胞如癌细胞的粘附或吸附，血液或生物流体优选在导入(例如注射或滴加)到医疗分析装置中之前被离心除去上清液和/或沉淀物。

[0069] 实施例

[0070] 以下参照实施例对本发明进行具体说明，但本发明不限于此。

[0071] (实施例1)

[0072] 丙烯酸2-甲氧基乙酯在80℃下使用偶氮二异丁腈(AIBN)热聚合6小时以制备聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)(分子量Mn＝约15000，Mw＝约50000)。然后，制备聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)在甲醇中的2.5w/v％溶液。

[0073] 将聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)溶液(2.5w/v％)注入市售的PMMA板中，并在室温下放置30分钟。然后，使用移液管抽取溶液，然后干燥，以形成亲水性聚合物层。

[0074] 此外，纤连蛋白被吸附到涂覆有聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)(亲水性聚合物层)的部件上。具体的，制备1μl/ml的纤连蛋白溶解于PBS溶液(磷酸缓冲盐水)中的溶液，将该溶液与亲水性聚合物层接触，在40℃下放置1小时，然后用PBS溶液洗涤，以制备分析装置，该分析装置包括如图1所示的在其上形成的具有吸附的纤连蛋白的亲水性聚合物层的多孔板。

[0075] (实施例2)

[0076] 以与实施例1相同的方式制备分析装置，除了将PBS溶液中的浓度变为10μl/ml。

[0077] (实施例3)

[0078] 以与实施例1相同的方式制备分析装置，除了将PBS溶液中的浓度变为100μl/ml。

[0079] (实施例4)

[0080] 以与实施例2相同的方式制备分析装置，所不同的只是移液管(吸附有纤维蛋白原的采血管)通过如下方式单独制备：用10μl/ml纤维蛋白原溶液涂布移液管的内表面，然后用PBS溶液洗涤，然后充分脱水。

[0081] (实施例5)

[0082] 以与实施例1相同的方式制备分析装置，除了PBS溶液中的浓度变为200μl/ml。

[0083] (比较例1)

[0084] 以与实施例1相同的方式制备分析装置，除了简单地形成聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)层之外。

[0085] 对实施例和比较例中制备的医疗分析装置进行如下评价。以相同的方式评价实施例4的医疗分析装置，除了血液用制备的移液管预先吸取，并保持在移液管中10分钟，然后注入孔中。

[0086] (亲水性聚合物层(涂层)的厚度)

[0087] 使用TEM，在15kV的加速电压和1000倍的倍率下测量(照相)孔的内表面上的亲水性聚合物层的厚度。

[0088] (血小板的吸附量)

[0089] 通过将血浆与血小板混合以将血小板浓度(植板密度)调节至4×107个细胞/cm2而制备的液体被注入孔中，并在37℃下放置1小时。用磷酸盐缓冲盐水洗涤孔内部，然后用1％戊二醛固定(在37℃下放置2小时)。然后，用磷酸盐缓冲盐水和蒸馏水再次洗涤孔内部。

[0090] 通过SEM观察制备的样品，计数吸附的血小板数。将计数相对于设定为1.0的比较例1进行比较。

[0091] (计数癌细胞数)

[0092] 将纤维肉瘤(HT-1080)悬浮于解离溶液中，并将一部分悬浮液重新悬浮于PBS溶液中，以使用血细胞计数器计数细胞数。使用得到的数量，将含有纤维肉瘤(HT-1080)的解离溶液重新悬浮于血液中，使计算得到的植板密度(浓度)为2850个细胞/cm2。

[0093] 将1ml的该血液部分注入各孔中，在37℃下放置1小时，使其粘附。然后，用PBS溶液洗去未粘附的细胞。随后，进行免疫染色，使用荧光显微镜计数粘附的癌细胞数。粘附细胞的数量相对于设定等于1.0的比较例1进行比较。

[0094] (加癌细胞的全血分析)

[0095] 将染色的人结肠腺癌(HT-29)细胞以每ml血液100个细胞的浓度悬浮在全血中，以制备加癌血液样品。将样品用等体积的液体培养基稀释以制备加癌血液稀释液。接下来，向15ml离心管中加入淋巴细胞分离液(用于分离单核细胞的溶液，密度＝1.077±0.001g/mL)，然后加入加癌血液稀释液，然后在800g下离心20分钟。然后，分离单核细胞层。向分离的单核细胞层中加入磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，然后再次离心以浓缩单核细胞层。离心后，将最下层的聚集体悬浮在含有10％胎牛血清(FBS)的液体培养基中，液体培养基的体积等于初始全血的体积。将1ml的悬浮液部分注入各孔中，在37℃下放置1小时，使其粘附。然后用PBS溶液洗去未粘附细胞。然后，使用荧光显微镜计数粘附的癌细胞数。粘附细胞的数量相对于设定等于1.00的比较例1进行对比。

[0096] [表1]

[0097]

[0098] 选择性＝(癌细胞的粘附量)/(血小板的吸附量)

[0099] [表2]

[0100]

[0101] 与仅形成亲水性聚合物层的比较例1相比，在其中形成吸附有纤连蛋白的亲水性聚合物层的实施例1～3中，癌细胞的粘附量大大提高。这可能是因为由纤连蛋白引起癌细胞的优先粘附，纤连蛋白在癌细胞吸附到聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)层上的粘附中起了一定作用。

[0102] 在实施例4中，血液进一步预先与具有吸附在其表面(移液管的内表面)的纤维蛋白原的容器接触，癌细胞粘附量进一步提高。这可能是因为由于血液被注入到具有纤维蛋白原的移液管中(所述移液管在血细胞粘附中起作用，使血细胞在被滴加到孔中之前吸附到该容器的内表面上)，所以血细胞的数量减少，从而进一步改善癌细胞的粘附。

[0103] 此外，在实施例中，由于吸附的血小板的量少，而癌细胞的粘附量大，所以也表现出良好的选择性[(癌细胞的粘附量)/(血小板的吸附量)]。

[0104] 如表2所示，在表1中表现出良好的癌细胞粘附性的实施例4，和吸附的纤连蛋白的量增加的实施例5，在加癌细胞的全血分析中也显示出优异的癌细胞粘附性。