[0001] 本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法。

[0002] 皮肤的成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，成纤维细胞通过分泌多种物质构成细胞外基质，从而形成结缔组织，对机体发挥结构性功能。成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持，促进损伤部位结构与功能的修复等。

[0003] 目前，自体皮肤成纤维细胞的原代培养方法大致分为2种：酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法的消化时间久，操作复杂，并且因为胰酶会对细胞造成不可逆的损伤，从而导致细胞得率低，细胞不纯等问题。组织块贴壁法相对于酶消化法减少了一部胶原酶的操作，但胰酶依然能对细胞造成伤害。同时组织块在贴壁过程中容易干燥，从而导致细胞死亡，而且组织块容易悬浮，从而使细胞没法爬出，导致细胞得率低。

[0004] 上述两种方法为了得到得到纯度相对高的成纤维细胞，必须要使用胰酶消化去除表皮层，使细胞受到严重损伤。而且成纤维细胞还要多次传代才能获得高纯度的细胞，从而使得患者等待时间久，细胞原代活性差，疗效显著降低，且可能存在潜在致瘤风险。

[0005] 如申请号为201610994328.9的中国发明专利，公开了一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM(Dulbeccominimumessentialmedium，杜尔伯科极限必需培养基)和F12培养基(Ham＇sF12nutrientmedium，动物细胞培养基)并添加细胞生长因子EGF(EpidermalGrowthFactor，表皮生长因子)和/或b-FGF(BasicFibroblastGrowthFactor，碱性成纤维生长因子)培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。采用上述培养方法虽然能促进成纤维细胞的增殖，同时EGF和b-FGF能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。但是前期使用酶消化法去除表皮层对成纤维细胞损伤较大，而且该方法的培养基对成纤维细胞无选择性，杂细胞影响比较大，所培养的原代成纤维细胞纯度低，需要传代多次才能得到纯度高的成纤维细胞。

[0038] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0039] 实施例1

[0040] 一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法

[0041] 实验组

[0042] 1)配置选择培养基：

[0043] 将DMEM培养基与F12培养基按3-1:1的体积比混合形成Xml的基础培养基，，接着在基础培养基中添加(2ng-9ng)*Xml的b-FGF、(1μg-20μg)*Xml的IGF-1(Insulin-likeGrowthFactors，胰岛素样1号生长因子)、(0.1μg-1μg)*Xml的EGF后，再将上述添加各细胞因子的培养基与胎牛血清按照体积比4:1制成选择培养基，用于加快成纤维细胞的增殖速率，并且能够抑制其他细胞的生长。

[0044] 其中，DMEM培养基和F12培养基混合作为无血清的基础培养基，利用F12培养基里的多种成分和DMEM培养基的高浓度营养成分的优点，使成纤维细胞增殖速率快并且对血清需求量显著降低。DMEM培养基和F12培养基优选按照2:1的体积比混合配置基础培养基，当DEME培养基过高时会导致细胞对血清的依赖性提高从而不得不使用更高浓度的胎牛血清，当F12培养基过高时导致细胞缺乏营养而降低细胞生存和增值能力。胎牛血清用于提供成纤维细胞增殖时所需的营养物质，促进成纤维细胞增殖。b-FGF可以促进成纤维细胞生长，抑制表皮细胞生长。IGF-1促进细胞生长，维持细胞形态，使得成纤维细胞不会分化。同时，高浓度的IGF-1及EGF相配合产生协同作用，使选择培养基对成纤维细胞具有选择性，促进成纤维细胞生长的同时抑制其他杂细胞的生长，从而能获得高纯度的成纤维细胞。

[0045] 2)配置浓缩胎牛血清：

[0046] 将15ml胎牛血清加入到超滤离心管中，7500g离心10min，浓缩至200μl的浓缩胎牛血清。

[0047] 3)取样：

[0048] 取约10mm2的自体皮肤，消毒后在无菌台上切成1mm2小块，分为10个组织块。将10个组织块真皮层向下，均匀贴在培养皿中，往各个组织块上各滴加20μl的步骤2)中提取的浓缩胎牛血清，随后放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃培养箱中静置10-30min，使浓缩胎牛血清充分浸润组织块，缩短组织块贴壁时间，避免干燥，并且使得组织块和培养皿之间能够更好地黏连，从而使组织块不会漂浮起来。而且浓缩胎牛血清能够使组织块周围形成高密度的血清，从而使得里面的细胞更快更容易爬出。

[0049] 4)原代成纤维细胞培养：

[0050] 将步骤3)中的培养皿从培养箱中拿出，沿培养皿壁缓慢加入步骤1)中的选择培养基，随后将培养皿放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养。每隔3-5天培养皿中的选择培养基半量换液，直至细胞融合。在本实施例中的培养条件下，成纤维细胞在第3天时细胞爬出(如图1-A)，在第10天时细胞融合(如图2-A)，细胞融合后的成纤维细胞即为原代细胞。此时观察细胞的生长情况，结果如图3-A所示。

[0051] 将细胞融合后的培养皿取出，使用生理盐水清洗二遍后，加入含有重量百分比为0.25％的胰酶的溶液在37℃下消化3分钟，使细胞从培养皿中脱落，然后使用步骤1)的基础培养基和胎牛血清按照体积比4:1制成的完全培养基终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中离心后，用完全培养基将重悬细胞接种到1个洁净的培养瓶中，接着放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养。第二天用完全培养基全量换液，
3天后细胞密度即可达90％。

[0052] 5)传代成纤维细胞培养：

[0053] 将步骤4)中的培养瓶使用生理盐水清洗二遍后，加入0.25％的胰酶溶液(即浓度为2.5g/L的胰酶溶液，下同)，37℃消化3分钟，并用完全培养基终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中离心后，用完全培养基将重悬细胞接种到10个洁净的培养瓶中，接着放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养。此后每3天用完全培养基全量换液，每5天按1传10的比例进行传代，传代步骤均为上述操作步骤，10天后即可收获1*109个的成纤维细胞。此时观察细胞的生长情况，结果如图4-A所示。

[0054] 对照组

[0055] 1)取样：

[0056] 取约10mm2的自体皮肤，消毒后尽量去除真皮下组织，在无菌台上切成5mm2小块，分为2个组织块。

[0057] 2)酶消化：

[0058] 用4倍体积的0.2％分散酶II溶液(即浓度为2g/L的分散酶II溶液)在4℃下消化组织块15小时。

[0059] 3)去除表皮层：

[0060] 将经步骤2)处理的组织块中的真皮层和表皮分离，丢弃表皮层，将真皮层用生理盐水清洗3遍后切成1mm2小块，共计10个组织块。将各组织块均匀贴在培养皿中，放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃培养箱中培养3个小时。

[0061] 4)原代成纤维细胞培养

[0062] 将步骤3)中的培养皿从培养箱中拿出，沿培养皿壁缓慢加入DMEM培养基和胎牛血清以体积比4:1制成的普通培养基，随后放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养，每隔3-5天半量换液直至细胞融合，当第10天时细胞爬出(如图1-B)，第20天时细胞融合(如图2-B)。此时观察细胞的生长情况，结果如图3-B所示。

[0063] 将培养皿取出，用生理盐水清洗二遍，加入0.25％的胰酶溶液37℃消化3分钟，然后使用步骤4)的普通培养基终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中离心，然后用普通培养基将重悬细胞接种到1个培养瓶中培养。第二天用普通培养基全量换液。3天后细胞密度即可达90％。此时观察细胞的生长情况，结果如图4-B所示。

[0064] 5)传代成纤维细胞培养：

[0065] 将步骤4)中的培养瓶使用生理盐水清洗二遍后，加入0.25％的胰酶溶液37℃消化3分钟，用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中离心后，用普通培养基将重悬细胞接种到3个洁净的培养瓶中，接着放入气体环境为95％空气和5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养。此后每3天用普通培养基全量换液，按照每5天按1传3的比例进行传代，20天后即可收获1*109个的成纤维细胞。

[0066] 结果及分析：

[0067] 对照组在步骤4)中第一次加入普通培养基时，其中两块组织块发生漂浮，在第二次加入普通培养基终止消化时，仍有三块组织块没有细胞爬出。由此可知，对照组中的10块组织块的细胞爬出率仅为50％，而实验组中的组织块则全部爬出。说明实验组的组织块能够牢牢粘附在培养皿中，并且细胞爬出率高。

[0068] 图1-A为实验组在第三天时成纤维细胞生长情况，明显可见成纤维细胞已经大量爬出。图1-B为对照组在第十天时成纤维细胞爬出情况，其成纤维细胞爬出数量明显少于图1-A图。图1-A和图1-B两图对比说明实验组的成纤维细胞培养方法能够使成纤维细胞迅速爬出。

[0069] 图2-A为实验组在第十天时成纤维细胞融合示意图。图2-B为对照组在第二十天时成纤维细胞融合示意图。图2-A和图2-B两图对比说明实验组的成纤维细胞培养方法能够使成纤维细胞快速有效地完成细胞融合。

[0070] 图3-A为实验组在原代细胞培养过程中使用选择培养基后的细胞生长情况，图3-B为对照组在原代细胞培养过程中使用选择培养基后的细胞生长情况。从图3-A中可以看出实验组使用选择培养基后，成纤维细胞以外的很多原本贴壁的细胞蜷曲外翻，说明杂细胞开始死亡漂浮。从图3-B中可以清晰的看出成纤维细胞和杂细胞共存，并未出现细胞死亡的情况。图3-A和图3-B两图对比说明实验组使用的选择培养基具有成纤维细胞选择性。

[0071] 如图4-A为实验组在第23天时成纤维细胞增殖情况示意图，图4-B为对照组在第23天时成纤维细胞增殖情况示意图，图4-A中的成纤维细胞数目已经增殖至1000倍，而图4-B仅增殖30倍。图4-A和图4-B两图对比说明实验组的成纤维细胞培养方法能够使成纤维细胞的增殖速率明显加快。

[0072] 实施例2

[0073] 验证实验A

[0074] 第二代成纤维细胞荧光染色实验

[0075] 为了验证比较实施例1中的实验组和对照组所培养成纤维细胞的纯度，采取成纤维细胞荧光染色实验，比较两种方法的效果。

[0076] 因为实验组的成纤维细胞培养方法具有成纤维细胞选择性，该方法所培养的原代成纤维细胞即具有很高的纯度，而按照对照组的培养方法所培养的成纤维细胞随着传代而纯化，因此选择第二代成纤维细胞进行实验，比较两组的培养方法的培养效果，避免传代过多而导致两组细胞纯度无区别。

[0077] 1)分别取实施例1中实验组和对照组的第二代成纤维细胞的培养基，用生理盐水清洗二遍。

[0078] 2)在两个培养皿中均加入0.25％的胰酶的溶液37℃下消化至细胞脱落，然后用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。

[0079] 3)将两种细胞悬液分别转移至15ml离心管中，加入生理盐水，1200rpm离心5min，弃上清液

[0080] 4)将步骤3)中得到两种细胞悬液沉淀分别按照每孔1*104cells接种到24孔板的4个反应孔中，其中两个反应孔中接种实验组的细胞，另外两个接种对照组的细胞；另外加入阴性对照2孔。

[0081] 5)根据标准换液流程进行换液直至细胞融合到100％时，在实验组的两个反应孔中，其中一个加入波形蛋白抗体，另外一个使用DAPI染色，对对照组的两个反应孔重复同样的操作。

[0082] 7)荧光显微镜观察，结果如图5和图6所示。

[0083] 结果及分析：

[0084] 如图5-A和图5-B所示，两图分别是实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色及波形蛋白荧光染色情况，其成纤维细胞纯度大于95％。图6-A、图6-B两图分别是实验组第二代成纤维细胞的DAPI荧光染色及波形蛋白荧光染色情况，其成纤维细胞纯度小于85％。由图5-6可以看出，实验组所培养的第二代成纤维细胞具有很高的纯度。

[0085] 实施例3

[0086] 验证实验B

[0087] 实验组第二代成纤维细胞表面标记物检测实验

[0088] 1)取实施例1中实验组的第二代成纤维细胞的培养基，用生理盐水清洗二遍。

[0089] 2)在步骤1)清洗后的培养皿加入0.25％的胰酶的溶液37℃消化3分钟，然后使用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。

[0090] 3)将步骤2)得到的两种细胞悬液放入15ml离心管中，加入生理盐水，1200rpm离心5min；弃上清液，重复上述步骤3次。

[0091] 4)弃上清液，离心管中加入适量磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSolution，7
PBS)调整细胞悬液终浓度为1×10cells/ml。

[0092] 5)离心管中分别取100μL细胞悬液分开转移至两支上样管中，并标记所有的抗体名称和荧光素。

[0093] 6)按照上样管标记，在两支上样管中分别加入适量对应的荧光抗体：CD90，CD73。冰上避光孵育20分钟。

[0094] 7)用适量PBS清洗细胞2次，300g离心5min，弃上清液，得到PBS重悬细胞。

[0095] 8)使用流式细胞仪检测，结果如图7和图8所示。

[0096] 结果及分析：

[0097] 如图7-8所示，实验组的第二代成纤维细胞通过流式细胞仪器检测表面标记物CD90，CD73都大于99％，说明细胞纯度高原代活性强。

[0098] 本发明要求保护的范围不限于本文中介绍的实施例，凡基于本发明申请专利范围和说明书内容所作的各种形式的变换和代换、合并等，皆属本发明专利涵盖的范围。