[0001] 本发明属于微生物鉴定领域，特别涉及利用功能材料亲和质谱快速鉴定微生物的方法。

[0002] 微生物鉴定对于临床诊断和食品安全有着重要的意义。以血液细菌感染为例，在血液细菌感染(菌血症)的细菌鉴定工作中，由于患者的临床表现不典型，给感染的诊断带来困难。目前，临床上菌血症诊断的金标准是血液细菌培养法，但血液培养的阳性率极低从而导致延误治疗[P.Phoompoung,M.Chayakulkeeree,Mycopathologia,2016,181(5-6),1-7；V.Kroumova,E.Gobbato,E.Basso,L.Mucedola,T.Giani,G.Fortina,Rapid Communications in Mass Spectrometry,2011,25(15),2247–2249.]。

[0003] 传统的微生物鉴定方法还包括分子生物学方法和免疫学方法，其中分子生物学方法主要有PCR技术、DNA探针技术和核糖体基因序列分析[I.M.Mackay,K.E.Arden,A.Nitsche，Nucleic Acids Research,2002，30(6),1292-1305；T.J.M.V.Steenbergen,M.F.Timmerman,F.H.M.Mikx,G.D.Quincey,G.A.V.D.Weijden,U.V.D.Velden,J.D.Graaff,Journal of Clinical Periodontology,1996,23(10),955-959.]，免疫学方法主要有酶联免疫法、免疫磁珠技术和免疫荧光技术[D.Bryniok,W. Applied Microbiology&Biotechnology,1989，32(32),235-242；J.G.Bruno,H.Yu,J.P.Kilian,A.A.Moore,Journal of Molecular Recognition,1996,9(5-6),474-479.]。这些方法有的操作流程比较复杂，有的还欠缺灵敏度和选择性。

[0004] 相比之下，质谱谱图法准确度高、稳定性好、操作简单，易于临床推广。从1990年代起，基质辅助激光解析电离源飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)被用于细菌鉴定[R.D.Holland,J.G.Wilkes,F.Rafii,J.B.Sutherland,C.C. K.J.Voorhees,J.O.Lay,Rapid Communications in Mass Spectrometry 1996,10(10),1227-1232；M.A.Claydon,S.N.Davey,V.Edwards-Jones,D.B.Gordon,Nature Biotechnology 1996,14(11),1584-1586.]。通过分析不同的细菌，科学家发现从完整的细菌细胞中可以得到具有指纹特征性的质谱图。通过记录多种单一纯细菌的指纹质谱图可以构建细菌鉴定所需的生物特征数据库。之后通过比对临床样本中采集的细菌的MALDI-TOF-MS指纹质谱图，可以实现细菌种类的精准鉴定[A.Croxatto,G.Prod'hom,G.Greub,Fems Microbiology Reviews 
2012,36(2),380-407；T.R.Sandrin,J.E.Goldstein,S.Schumaker,Mass Spectrometry Reviews 2013,32(3),188-217；N.Singhal,M.Kumar,P.K.Kanaujia,J.S.Virdi,Frontiers in Microbiology,2015,6,791]。

[0005] 然而，受限于灵敏度，当前的质谱法仍然无法直接用于临床样本中的细菌鉴定。通常情况下，需要首先对样本中的细菌进行培养得到单菌落，之后对菌落中的细菌进行质谱鉴定[A.Bizzini,C.Durussel,J.Bille,G.Greub,G.Prod'Hom,Journal of Clinical Microbiology 2010,48(5),1549-1554.]。因此，该方法仍然受限于细菌培养阳性率低的问题。

[0036] 图1是本发明快速准确鉴定样品中微生物的方法的流程示意图。如图1所示，本发明快速准确鉴定样品中微生物的方法的流程包括：

[0037] 事先准备工作：建立纯微生物参考指纹质谱图库，作为标准谱图。

[0038] 制作功能性材料：向表面修饰重组有Protein A/G的磁珠中加入目标微生物的抗体或人血清免疫球蛋白G，混匀反应，得到功能性材料；

[0039] 接着向功能性材料中加入样品，功能性材料会选择性的捕获目标微生物—细菌。

[0040] 然后通过磁力分离，将捕获目标微生物后的功能性材料分离出来，接着洗涤，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析功能化材料捕获到的微生物，得到微生物谱图；

[0041] 将得到的微生物谱图与标准谱图进行比对，实现微生物鉴定。

[0042] 下面结合附图和实例对本发明进一步阐述。

[0043] 下述实施例中均先将枪头、50mL离心管和液体培养基在灭菌锅中灭菌2小时，设定温度为126℃。超净台紫外灭菌30min，用75％乙醇擦拭消毒移液枪和手套。将灭好菌的枪头、50mL离心管和液体培养基移入超净台，关闭紫外灯。均先获取目标纯菌指纹库，作为标准谱图进行比对参照。

[0044] 实施例1

[0045] 利用目标微生物抗体修饰的磁珠选择性捕获目标微生物。

[0046] 取50μg磁珠，该磁珠的直径约为1微米，表面修饰有重组的Protein A/G(～50,00Da)，每组Protein A/G包含了4个Protein A的Fc结合位点和2个Protein G的Fc结合位点。用PBST缓冲溶液(137mM NaCl，10mM Na2HPO4·12H2O，2mM NaH2PO4·2H2O，0.05％Tween 
20)清洗两次(每次20μL)后将磁珠分散于50μL PBST缓冲溶液中。在上述缓冲溶液和磁珠的混合物中加入2μL肠致病性大肠杆菌抗体，室温下在恒温混匀仪上反应30min。将反应后的磁珠用封闭液PBST+1％BSA洗涤三次(每次20μL)，用磁铁将磁珠分离，并分散于50μL PBST缓冲溶液中。

[0047] 含有大肠杆菌DH5alpha(108CFU/mL)的0.1mL全血样品用去离子水稀释6倍，140g转速下离心10min，沉淀去除血细胞，上清与2mL去离子水混合去除裂解残留红细胞，2000g转速下离心5min获得微生物，用1mL去离子水清洗一次，并悬浮在300μL PBST混和溶液中。将50μg接有抗体的磁珠中加入上述处理后的样本。在恒温混匀仪上反应30min，设定温度为
37℃。用磁铁收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗涤两次(每次1mL)，去离子水洗涤一次(每次1mL)。去掉上清液，得到捕获了大肠杆菌的磁珠。

[0048] 取上述得到的捕获有大肠杆菌的磁珠1μL，点到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB(2,5-二羟基苯甲酸)基质(50％H2O，50％CH3CN，0.1％TFA，10mg/mL DHB)叠加在样品点上。用MALDI-TOF MS测定大肠杆菌谱图，与标准谱图进行比对实现鉴定。结果如图2所示。

[0049] 实施例2

[0050] 利用人血清免疫球蛋白G实现广谱性的病原微生物提取富集。

[0051] 取-80℃保存的大肠杆菌ATCC43889菌液100μL于50mL离心管中，加入9mL液体胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，混匀。将离心管盖子稍微拧松于摇床中培养，设定温度为37℃，设定转速为180rpm，培养时间12h。此时细菌进入对数期末期，活性最好，菌浓度最大。

[0052] 取50μg与实施例1中相同的磁珠，每次用20μL PBST缓冲溶液，清洗两次后将磁珠分散于50μL PBST缓冲溶液中。在上述缓冲溶液和磁珠的混合物中加入2μL人血清免疫球蛋白G，室温下在恒温混匀仪上反应30min。将反应后的磁珠用封闭液PBST+1％BSA洗涤三次(每次20μL)，用磁铁将磁珠分离，并分散于50μL PBST缓冲溶液中。

[0053] 取培养的大肠杆菌(108CFU/mL)1mL，设定离心机转速为2000g，离心5min，去掉上清液，用去离子水清洗两次(每次1mL)，将清洗过的大肠杆菌分散于300μL PBST缓冲溶液中。

[0054] 将50μL经过人血清免疫球蛋白G处理并分散于PBST缓冲溶液的磁珠加入处理后的大肠杆菌中，在恒温混匀仪上反应30min，设定温度为37℃。用磁铁收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗涤两次(1mL)，去离子水洗涤一次(1mL)。去掉上清液，得到捕获了大肠杆菌的磁珠。

[0055] 取上述得到的捕获有大肠杆菌的磁珠1μL，点到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB基质叠加在样品点上。用MALDI-TOF MS测定大肠杆菌的谱图，与标准谱图进行比对实现鉴定。鉴定结果如图3所示。

[0056] 实施例3

[0057] 利用人血清免疫球蛋白G实现广谱性的病原微生物提取富集。

[0058] 取-80℃保存的副溶血性弧菌菌液100μL于50mL离心管中，加入9mL液体胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基，混匀。将离心管盖子稍微拧松于摇床中培养，设定温度为37℃，设定转速为180rpm，培养时间12h。此时细菌进入对数期末期，活性最好，菌浓度最大。

[0059] 取50μg与实施例1中相同的磁珠，每次用20μL PBST缓冲溶液，清洗两次后将磁珠分散于50μL PBST缓冲溶液中。在上述缓冲溶液和磁珠的混合物中加入2μL人血清免疫球蛋白G，室温下在恒温混匀仪上反应30min。将反应后的磁珠用封闭液PBST+1％BSA洗涤三次(每次20μL)，用磁铁将磁珠分离，并分散于50μL PBST缓冲溶液中。

[0060] 取培养的副溶血性弧菌(108CFU/mL)1mL，设定离心机转速为2000g，离心5min，去掉上清液，用去离子水清洗两次(每次1mL)，将清洗过的副溶血性弧菌分散于300μL PBST缓冲溶液中。

[0061] 将50μL经过人血清免疫球蛋白G处理并分散于PBST缓冲溶液的磁珠加入处理后的副溶血性弧菌中，在恒温混匀仪上反应30min，设定温度为37℃。用磁铁收集磁珠，并依次用PBST+1％BSA溶液洗涤两次(1mL)，去离子水洗涤一次(1mL)。去掉上清液，得到捕获了副溶血性弧菌的磁珠。

[0062] 取上述得到的捕获有副溶血性弧菌的磁珠1μL，点到MALDI靶板上，待干后取1μL DHB基质叠加在样品点上。用MALDI-TOF MS测定副溶血性弧菌的谱图，与标准谱图进行比对实现鉴定。鉴定结果如图4所示。

[0063] 虽然本发明已由较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟知此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，可作些许的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所要求保护的范围为准。