[0001] 本发明涉及酶工业领域以及免疫检测领域，具体地说涉及凝血酶溶液的稳定剂、凝血酶溶液以及相关的检测试剂、制备稳定的凝血酶溶液的方法以及凝血酶溶液的稳定剂的用途。

[0002] 纤维蛋白原(Fibrinogen，FIB)是作为血凝块的主要蛋白质的纤维蛋白的前体物质，由肝实质细胞产生。生物体中的纤维蛋白原的约80％分布于血浆中(正常成年人中约为200～400mg/dL)，其余分布于组织中。纤维蛋白原是含有经二硫键结合的3对多肽(Aα，Bβ和γ)链的糖蛋白质，Aα，Bβ链通过凝血酶被分解而形成纤维蛋白，从而起到血栓生成、止血血栓的主要作用。在临床上，在炎症中增加，在高度的肝功能障碍、DIC等中减少。

[0003] 纤维蛋白原测定的临床意义包括但不限于：1.病理性增高：(1)血栓前状态和血栓性疾病时，机体凝血功能增强，血浆纤维蛋白原增多，如急性心肌梗塞、糖尿病、妊娠高血压症、动脉粥样硬化、恶性肿瘤等。(2)蛋白合成增多，如结缔组织病、多发性骨髓瘤等。(3)反应性增多，如急性感染、急性肾炎、烧伤、休克、大手术后等。2.病理性降低：(1)消耗过多，导致血浆含量减少，如DIC等。(2)纤溶系统活性增强，FIB被分解，如原发性纤溶亢进症等。(3)合成减少，如重症肝炎、肝硬化等。

[0004] 纤维蛋白原的测定法包括凝血酶添加法(Clauss法)、凝固时间法(PT演算法)、免疫比浊法(TIA)、乳胶法等，一般采用凝血酶添加法。

[0005] 在凝血酶添加法下，纤维蛋白原的含量根据纤维蛋白原与凝血酶作用最终形成纤维蛋白的原理测定，以国际标准品为参比血浆制作标准曲线，用凝血酶来测定血浆凝固时间，即凝血酶时间(Thrombin Time，TT)，所得血浆凝固时间与血浆中纤维蛋白原浓度呈负相关，从而得到纤维蛋白原的含量。

[0006] 具体而言，凝血酶时间是指在血浆中加入标准化的凝血酶原后血浆凝固的时间。在凝血酶作用下，待检血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白。当待检查的血浆中抗凝物质增多时，凝血酶时间延长。当待检查的血浆呈酸性、测试对象患有异常纤维蛋白血症等情况下，凝血酶时间缩短。

[0007] 例如，凝血酶时间延长见于血浆纤维蛋白原减低或结构异常；临床应用肝素，或在肝病、肾病及系统性红斑狼疮时的肝素样抗凝物质增多；纤溶蛋白溶解系统功能亢进。

[0008] 在纤维蛋白原测定时使用的凝血酶，从作为其前体的凝血酶原中切下肽而形成具有凝固活性的α-凝血酶。已知这种α-凝血酶会自分解成低分子量的不具有凝固活性的β-凝血酶，进而分解成γ-凝血酶，长期保存时，通常进行冷冻干燥。

[0009] 对于测定纤维蛋白原(FIB)含量或凝血酶时间(TT)的试剂而言，现有的试剂均为冻干试剂，除了价格昂贵，在使用过程中，均需要复溶，使用不方便，而且必然会带来复溶过程中造成体积误差，导致结果出现偏差。而液体试剂不存在这一问题，并且使用方便，即开即用，批间差更小，结果更准确。因此迫切地需要开发出能够稳定凝血酶溶液的稳定剂以及稳定的凝血酶溶液制品。

[0052] 本发明的以下实施例中使用的各组分来源分别为：上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶纯生化科技股份有限公司)的商标为阿拉丁(Aladdin)的乳酸钙(货号C110506)、来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(上海晶纯生化科技股份有限公司)的商标为阿拉丁(Aladdin)的葡萄糖酸钙(货号587478)、来自上海源叶生物科技有限公司的商标为源叶的谷氨酸钾(例如，货号S20427)、上海天宇生物试剂有限公司的谷氨酸钠、苏州市贝克生物科技有限公司的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES酸)、成都科龙化工试剂厂的吐温80、西宝生物科技(上海)股份有限公司的商标为Amresco的叠氮钠(货号0639)、湖南一格制药有限公司的凝血酶冻干粉。

[0053] 实施例1

[0054] 含有本发明的稳定剂的凝血酶时间(TT)检测试剂的制备

[0055] 称取HEPES酸11.9g，乳酸钙7.7g，谷氨酸钠50g，叠氮钠1g，吐温800.2g，加入蒸馏水中溶解，用氢氧化钠调节pH至6.4，定容至1L。取凝血酶4只(1000U/支)，用以上配制缓冲液1mL/支溶解，取溶解凝血酶3.6mL(可调节酶量控制批间差)，加入1L缓冲液中摇匀，TT检测试剂配制完成。

[0056] 产品性能指标

[0057] 1.重复性：变异系数(CV)≤5％；用正常质控血浆重复测试10次，计算测定的平均值 和标准差(s)。按照公式(1)计算变异系数(CV)。所得结果应符合下述3.稳定性的要求。

[0058]

[0059] 式中：

[0060] S中：标准差

[0061] ——测定均值

[0062] 2.批间差：变异系数(CV)≤10％；用正常质控血浆分别测试3个不同批次的试剂，每个批次测定重复测试10次，计算30个测量值平均值(X)和标准差(s)，按照公式(1)计算变异系数(CV)。

[0063] 3.稳定性

[0064] 本品2℃～8℃密闭保存，每次新开一瓶测定质控血浆，与第一天对比，相对偏差在15％内，有效期12个月。

[0065] 实施例2

[0066] 凝血酶时间(TT)检测试剂的检测方法

[0067] 取血浆100μL，37℃预热2分钟，然后加入凝血酶试剂100μL，在CA550全自动凝血仪(厂家SYSMEX)按照厂家的说明书测定。

[0068] 注意事项：

[0069] 1.采血应避免溶血，防止组织液混入。抽血时要顺利，抗凝要充分，不可有凝血块；分离血浆时务必去除血小板。

[0070] 2.样本收集时不宜用EDTA和肝素作抗凝剂。血液和抗凝剂的比例应准确，采血量偏差大于10％的标本不宜使用。

[0071] 3.如果血球压积≤20％或≥55％，则需调整血样与抗凝剂的比例，抗凝剂毫升数＝0.00185×血液毫升数×(100－压积)。

[0072] 4.使用经校准后的刻度吸管和加样器。

[0073] 5.使用清洁无污染的塑料或硅化的玻璃器皿。

[0074] 6.实验温度控制在37℃±1.0℃。

[0075] 7.试剂与样本量可根据需要按比例改变。

[0076] 8.试剂使用完毕，应擦干净瓶口，尽快旋紧瓶盖，及时放回要求的储存条件下保存。

[0077] 实施例3

[0078] 含有本发明的稳定剂的凝血酶时间(TT)检测试剂的稳定性实验

[0079] 按照实施例1的方案配制凝血酶时间(TT)检测试剂，使用CA550全自动凝血仪(厂家SYSMEX)按照厂家的说明书测定以下条件下所述试剂的稳定性

[0080] 1.37℃加速破坏。

[0081] 2.2-8℃开瓶稳定性。

[0082] 3.2-8℃长期稳定性。

[0083] 37℃稳加速破坏，正常质控血浆测值，测值1月之内稳定。见表1。

[0084] 表1 37℃加速热破坏实验

[0085]

[0086]

[0087] 开瓶稳定性实验，开瓶后放于2-8℃,15天,测值较稳定。见表2。

[0088] 表2 2-8℃开瓶稳定性

[0089]

[0090] 2-8℃长期稳定性，15个月，测值较稳定。见表3。

[0091] 表3 长期稳定性

[0092]

[0093]

[0094] 实施例4

[0095] 含有本发明的稳定剂的纤维蛋白原(FIB)检测试剂的制备

[0096] (一)配制试剂：称取HEPES酸11.9g，乳酸钙7.7g，谷氨酸钠50g，叠氮钠1g，吐温80 0.2g，加入蒸馏水中溶解，用氢氧化钠调节pH至6.4，定容至1L。取凝血酶70只(1000U/支)，用以上配制缓冲液1mL/支溶解，全部加入1L缓冲液中摇匀，FIB检测试剂配制完成。

[0097] (二)配制稀释样本缓冲液：称取咪唑3.06g，氯化钠5.22g，柠檬酸钠1.2g，叠氮钠0.95g，加入蒸馏水中溶解，用氢氧化钠调节pH至7.30，定容至1L。稳定两天后，再次调节pH至7.30。

[0098] 产品性能指标

[0099] 1.准确度：取参考物质或正确度质控物测试，重复三次，得平均值，按照公式(2)计算平均值与参考物质或主校准品的相对偏差，结果应符合相对偏差应在±15％范围内的要求。计算公式：

[0100]

[0101] 式中：

[0102] x――检测均值；

[0103] xc――参考物质或正确度质控物标示值。

[0104] 2.重复性

[0105] 用正常质控血浆和异常质控血浆分别重复测试10次，并计算测定的平均值 和标准差(S)。按公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合变异系数(CV)≤8％的要求。

[0106] 3.批间差

[0107] 用正常质控血浆测试3个不同批次的试剂，每个批次测试10次，计算30个测量值平均值 和标准差(S)，按照公式(1)计算变异系数(CV)，结果应符合变异系数(CV)≤15％的要求。

[0108] 4.稳定性

[0109] 本品2℃～8℃密闭保存，每次新开一瓶测定质控血浆，相对偏差在15％内，有效期12个月。

[0110] 实施例5

[0111] 纤维蛋白原(FIB)检测试剂的检测方法

[0112] (一)标准曲线建立

[0113] 用稀释液按下表稀释参比血浆，即可获得系列浓度：

[0114]

[0115] 取FIB检测试剂预温3分钟，至37℃。取稀释后的参比血浆100μl，37℃预温2分钟。加入50μl已预温试剂，立刻混匀并计时，记录凝固时间。以参比血浆梯度稀释所获靶浓度为横坐标，对应凝固时间(秒)为纵坐标，测定结果在双对数曲线上作图，或输入仪器按照相应的数学模型自动生成工作曲线。

[0116] (二)样本测定

[0117] 样本用稀释缓冲液进行10倍稀释，测定步骤同工作曲线的制备。用CA550全自动凝血仪(厂家SYSMEX)按照厂家的说明书测定。

[0118] 注意事项：

[0119] 1.采血应避免溶血，防止组织液混入。抽血时要顺利，抗凝要充分，不可有凝血块；分离血浆时务必去除血小板。

[0120] 2.样本收集时不宜用EDTA和肝素作抗凝剂。血液和抗凝剂的比例应准确，采血量偏差大于10％的标本不宜使用。

[0121] 3.如果血球压积≤20％或≥55％，则需调整血样与抗凝剂的比例，抗凝剂毫升数＝0.00185×血液毫升数×(100－压积)。

[0122] 4.使用经校准后的刻度吸管和加样器。

[0123] 5.使用清洁无污染的塑料或硅化的玻璃器皿。

[0124] 6.实验温度控制在37℃±1.0℃。

[0125] 7.试剂与样本量可根据需要按比例改变。

[0126] 8.试剂使用完毕，应擦干净瓶口，尽快旋紧瓶盖，及时放回要求的储存条件下保存。

[0127] 实施例6

[0128] 含有本发明的稳定剂的纤维蛋白原(FIB)检测试剂的稳定性实验

[0129] 按照实施例4的方案配制纤维蛋白原(FIB)检测试剂，使用CA550全自动凝血仪(厂家SYSMEX)按照厂家的说明书测定以下条件下所述试剂的稳定性。

[0130] 1.37℃加速破坏。

[0131] 2.2-8℃开瓶稳定性。

[0132] 3.2-8℃长期稳定性。

[0133] 37℃加速破坏，正常质控血浆测值，测值1月之内稳定。见表4。

[0134] 表4 37℃加速热破坏实验

[0135]

[0136]

[0137] 开瓶稳定性实验，开瓶后放于2-8℃，开瓶17天，测值较稳定。见表5。

[0138] 表5 2-8℃开瓶稳定性

[0139]

[0140] 2-8℃长期稳定性，416天，测值较稳定。见表6。

[0141] 表6 2-8℃长期稳定性

[0142]

[0143]

[0144] 实施例7

[0145] 水溶性钙化合物与水溶性谷氨酸化合物之间存在稳定凝血酶溶液的协同效[0146] 应

[0147] 在其他变量一致的条件下，对于仅含有乳酸钙、仅含有谷氨酸钠以及同时含有乳酸钙和谷氨酸钠的三种凝血酶溶液测定37℃下的稳定时间，以相对偏差10％为质控线，观察上述凝血酶溶液的检测结果。检测结果取5次试验的均值。

[0148] 本申请还测量了同时含有乳酸钙和谷氨酸钾凝血酶溶液在37℃下的稳定时间，以相对偏差10％为质控线，观察上述凝血酶溶液的检测结果。检测结果取3次试验的均值。

[0149] 表7中序号1-4中凝血酶溶液中各成分的含量分别为：乳酸钙7.7g/L(如含有)、谷氨酸钠50g/L(如含有)、谷氨酸钾50g/L(如含有)、HEPES酸11.9g/L、叠氮钠1g/L、吐温80 200μl/L、凝血酶4KU/L(序号1-3的溶液)或2KU/L(序号4的溶液)。

[0150] 表7：乳酸钙与水溶性谷氨酸化合物稳定凝血酶溶液的协同效应

[0151]

[0152]

[0153] 表8a 乳酸钙与水溶性谷氨酸化合物稳定凝血酶溶液的试验

[0154]

[0155]

[0156] 从表7、表8a可以观察到，乳酸钙与水溶性谷氨酸化合物同时存在时，凝血酶溶液的稳定天数最长。因此，乳酸钙与水溶性谷氨酸化合物之间存在稳定凝血酶溶液的协同效应。

[0157] 本发明还选取了含有葡萄糖酸钙和谷氨酸钠的凝血酶溶液来进一步验证水溶性钙化合物与水溶性谷氨酸化合物之间存在稳定凝血酶溶液的协同效应。上述葡萄糖酸钙和谷氨酸钠作为稳定剂的凝血酶溶液中各成分的含量分别为：葡萄糖酸钙7.7g/L、谷氨酸钠50g/L、HEPES酸11.9g/L、叠氮钠1g/L、吐温80 200μl/L、凝血酶30KU/L(FIB试剂)或2KU/L(TT试剂)。上述凝血酶溶液的稳定性测试如下：

[0158] 表8b 葡萄糖酸钙与谷氨酸钠稳定凝血酶溶液的试验

[0159]

[0160]

[0161] 从表8b可见，葡萄糖酸钙与谷氨酸钠也具有很好的协同稳定效应。

[0162] 因此，从上述实验可以看出，水溶性钙化合物与水溶性谷氨酸化合物之间存在稳定凝血酶溶液的协同效应。

[0163] 实施例8

[0164] 有无谷氨酸钠对TT试剂稳定性影响实验对比。

[0165] 根据实施例1中的凝血酶溶液配方，其他组分含量不变的情形下，分别测定37℃下含谷氨酸钠和无谷氨酸钠的凝血酶溶液的稳定性。

[0166]

[0167] 表9 37℃有无谷氨酸钠影响

[0168]

[0169]

[0170] 由表9的试验结果可以看出，含谷氨酸钠和乳酸钙的配方稳定性明显优于无谷氨酸钠的配方的稳定性。

[0171] 实施例9

[0172] 乳酸钙与其他非谷氨酸的氨基酸或其盐对凝血酶溶液的稳定效果

[0173] 凝血酶溶液中各成分的含量分别为：乳酸钙7.7g/L、甘氨酸50g/L(如含有)、精氨酸50g/L(如含有)、丝氨酸50g/L(如含有)、谷氨酸50g/L(如含有)、HEPES酸11.9g/L、叠氮钠1g/L、吐温80 200μl/L。TT试剂中凝血酶为4KU/L，FIB试剂中凝血酶为70KU/L。

[0174] 以相对偏差10％为质控线，根据实施例7中表7以及本实施例中表10a、11的实验结果，乳酸钙与其他非谷氨酸的氨基酸或其盐并不能实现水溶性谷氨酸化合物对凝血酶溶液的稳定效果。

[0175] 表10a：乳酸钙与其他非谷氨酸的氨基酸稳定凝血酶溶液的协同效应

[0176]

[0177]

[0178] 表10b：乳酸钙与甘氨酸或缬氨酸稳定凝血酶溶液的协同效应

[0179]

[0180] 实施例10-14中，凝血酶溶液中某一成分含量变化时，其他成分的含量遵循以下数值：乳酸钙7.7g/L、谷氨酸钠50g/L、HEPES酸11.9g/L、叠氮钠1g/L、吐温80 200μl/L。关于凝血酶溶液中酶的含量，TT试剂中，酶的含量为4KU/L；FIB试剂中，酶的含量为70KU/L。

[0181] 实施例10

[0182] 凝血酶溶液中HEPES酸的含量范围

[0183] 根据表11，以15％为质控线，凝血酶溶液中HEPES酸的含量范围可以是5.9g/L至23.8g/L。

[0184] 表11 凝血酶溶液中HEPES酸的含量范围

[0185]

[0186]

[0187] 实施例11

[0188] 凝血酶溶液中乳酸钙的含量范围

[0189] 根据表12，以15％为质控线，凝血酶溶液中乳酸钙的含量范围可以是2g/L至10g/L。

[0190] 表12 凝血酶溶液中乳酸钙的含量范围

[0191]

[0192]

[0193] 实施例12

[0194] 凝血酶溶液中谷氨酸钠的含量范围

[0195] 根据表13，以15％为质控线，凝血酶溶液中谷氨酸钠的含量范围可以是10g/L至100g/L。

[0196] 表13 凝血酶溶液中谷氨酸钠的含量范围

[0197]

[0198]

[0199]

[0200] 实施例13

[0201] 凝血酶溶液中叠氮钠的含量范围

[0202] 根据表14，以15％为质控线，凝血酶溶液中叠氮钠的含量范围可以是0.4g/L至1.3g/L。

[0203] 表14 凝血酶溶液中叠氮钠的含量范围

[0204]

[0205]

[0206] 实施例14

[0207] 凝血酶溶液中吐温80的含量范围

[0208] 根据表15，以15％为质控线，凝血酶溶液中吐温80的含量范围可以是100μl/L至400μl/L。

[0209] 表15 凝血酶溶液中吐温80的含量范围

[0210]

[0211]