[0001] 本发明涉及一种FISH探针的制备方法。

[0002] FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

[0003] FISH使用的探针序列来源于基因组或BAC(细菌人工染色体)DNA，包含许多重复序列。串联重复序列(Tandem repeat)，如存在于着丝粒的α卫星DNA(Satellite DNA)；散在重复序列(Interspersed repeat)，如Alu家族。探针中的这些重复序列，在与基因组杂交时易产生非特异信号，如何去除成为探针制备过程中的难题。

[0004] 人类Cot-1DNA是在杂交中常用来封闭及去除重复序列的工具之一。探针制备前，可以使用人类Cot-1DNA筛选出重复序列，得到特异性模板再制备探针。

[0005] 然而，人类Cot-1DNA只包含目的片段中重复序列的一部分，因此，采用Cot-1DNA并不能有效去除非特异性信号。

[0026] 实施例1

[0027] 以HER-2基因为例，使用Genomic information research institute(Giri)在线序列分析软件RepeatMasking对目的片段进行重复性序列分析，并据此合成目的片段序列中比例较高的特异性重复序列。

[0028] 1、在Giri网站上点击RepeatMasking，输入目的片段序列，选择物种类型和分析类型后，提交分析。

[0029] 2、分析结果分5部分，第一部分是“Map of Hits”，罗列了所有比对到的重复序列名称、类型及比对到目的片段上的位置信息，第二部分是“Masked sequence”，将比对到的重复序列隐藏，只显示特异的目标序列，第三部分是“Local alignments”，详细给出了每一个比对到的重复序列与目的片段的匹配情况，第四部分是“Masked regions”，仅显示重复序列，第五部分是“Summary tables”，总结了重复序列类型及对应的比对次数与碱基长度，如下表所示：

[0030]

[0031] 3、根据分析结果，选取重复度较高的序列，如L1或SINE1，通过化学合成的方法合成这部分序列。

[0032] 实施例2

[0033] 以HER-2基因为例，使用生物素偶联的人类Cot-1DNA去除模板中的对应重复序列，标记后得到的探针使用特异性重复序列封闭。

[0034] 1、HER-2BAC DNA片段化

[0035] 使用超声打断仪将HER-2BAC DNA打断，使其主带位于250-1000bp。

[0036] 2、采用随机引物标记法制备生物素偶联的人类Cot-1DNA，标记体系如下：

[0037]体系 100μL 250μL
Human Cot-1DNA N1(0.4-0.8μg) N1(1-2μg)
2.5×Buffer 40μL 100μL
Biotin-N8 N2(8-10μg) N2(20-25μg)
dH2O 26-N1-N2 65-N1-N2
dNTP 32μL 80μL
Klenow Fragment(5U/μL) 2μL 5μL

[0038] 具体操作如下：

[0039] 1.一步(冰上)

[0040]

[0041]

[0042] 吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

[0043] 二步(冰上)

[0044]

[0045] 吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，

[0046] 加入2.5μL Stop Buffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。

[0047] 3、生物素偶联的人类Cot-1DNA与片段化的HER-2BAC DNA杂交

[0048] 100ng片段化的HER-2BAC DNA与2.5μg生物素偶联的人类Cot-1DNA杂交，总体积15μL。

[0049] 95℃变性10min，65℃杂交过夜，产物中加入15μL洗涤后的 MyOneTM Streptavidin C1(Invitrogen 65002)磁珠，室温结合30min，磁力架吸附3min，转移上清至新的EP管。

[0050] 上清使用DNA纯化试剂盒纯化，得到一次去重的HER-2DNA模板。

[0051] 4、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：

[0052]体系 10μL 20μL 25μL
一次去重的HER-2DNA N(40-80ng) N(80-160ng) N(100-200ng)
2.5×Buffer 4μL 8μL 10μL
dH2O 1-N 2-N 2.5-N
缺C dNTP 1.6μL 3.2μL 4μL
Cy3-dCTP 3.2μL 6.4μL 8μL
Klenow Fragment(5U/μL) 0.2μL 0.4μL 0.5μL

[0053] 具体操作如下：

[0054] 1.一步(冰上)

[0055]

[0056] 吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

[0057] 二步(冰上)

[0058]

[0059] 注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。

[0060] 吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μL Stop Buffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于5μL ddH2O中。瞬时离心后，取5μLHER-2探针、5μL着丝粒探针(制备方法与HER-2探针类似)、5μL 1mg/mL特异性重复序列、85μL杂交液(比例为1:1:1:17)，即成HER2/CSP17双色探针。

[0061] 用所制得的探针用于乳腺癌FFPE样本的检测，结果见图3。

[0062] 实施例3

[0063] 以HER-2基因为例，先采用随机引物法标记探针，再使用生物素偶联的人类Cot-1DNA和合成的携带生物素标记的特异重复序列去除探针中的重复序列探针，得到特异性探针。

[0064] 1、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：

[0065]体系 10μL 20μL 25μL
HER-2DNA N(40-80ng) N(80-160ng) N(100-200ng)
2.5×Buffer 4μL 8μL 10μL
dH2O 1-N 2-N 2.5-N
缺C dNTP 1.6μL 3.2μL 4μL
Cy3-dCTP 3.2μL 6.4μL 8μL
Klenow Fragment(5U/μL) 0.2μL 0.4μL 0.5μL

[0066] 具体操作如下：

[0067] 1.一步(冰上)

[0068]

[0069] 吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

[0070] 二步(冰上)

[0071]

[0072]

[0073] 注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。

[0074] 吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μL Stop Buffer终止反应2-3min，待用。

[0075] 2、采用随机引物标记法制备生物素偶联的人类Cot-1DNA，标记体系如下：

[0076]体系 100μL 250μL
Human Cot-1 DNA N1(0.4-0.8μg) N1(1-2μg)
2.5×Buffer 40μL 100μL
Biotin-N8 N2(8-10μg) N2(20-25μg)
dH2O 26-N1-N2 65-N1-N2
dNTP 32μL 80μL
Klenow Fragment(5U/μL) 2μL 5μL

[0077] 具体操作如下：

[0078] 1.一步(冰上)

[0079]

[0080] 吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

[0081] 二步(冰上)

[0082]

[0083] 吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，

[0084] 加入2.5μL Stop Buffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。

[0085] 3、生物素偶联的人类Cot-1DNA、合成的生物素修饰的特异重复序列与标记得到的HER-2探针杂交

[0086] 向HER-2探针标记体系中加入25倍(摩尔比)生物素偶联的人类Cot-1DNA、25倍(摩尔比)合成的生物素修饰的特异重复序列及杂交液，总体积50μL。

[0087] 95℃变性10min，46℃杂交过夜，产物中加入15μL洗涤后的 MyOneTM Streptavidin C1(Invitrogen 65002)磁珠，室温结合30min，置于磁力架上吸附3min，转移上清至新的EP管。使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中。此时得到的探针即为HER-2特异性探针。

[0088] 实施例4

[0089] 以HER-2基因为例，先采用随机引物法标记探针，再使用人类Cot-1DNA和合成的特异重复序列对重复序列进行封闭。

[0090] 2、采用随机引物标记法制备HER-2探针，标记体系如下：

[0091]体系 10μL 20μL 25μL
HER-2DNA N(40-80ng) N(80-160ng) N(100-200ng)
2.5×Buffer 4μL 8μL 10μL
dH2O 1-N 2-N 2.5-N
缺C dNTP 1.6μL 3.2μL 4μL
Cy3-dCTP 3.2μL 6.4μL 8μL
Klenow Fragment(5U/μL) 0.2μL 0.4μL 0.5μL

[0092] 具体操作如下：

[0093] 1.一步(冰上)

[0094]

[0095] 吹打混匀后，于PCR仪上95℃变性10min，立即置于冰上5min，然后瞬时离心。

[0096] 二步(冰上)

[0097]

[0098] 注：荧光素最后加，剩余的荧光素于-20℃避光保存。

[0099] 吹打混匀后，于PCR仪上37℃反应3h以上，加入2.5μL Stop Buffer终止反应2-3min，使用醋酸钠、乙醇沉淀和浓缩，重悬于适量ddH2O中，即成HER-2探针。

[0100] 2、取5μL HER-2探针、5μL着丝粒探针(制备方法与HER-2探针类似)、5μL 2mg/mL人类Cot-1DNA、5μL 1mg/mL特异性重复序列、80μL杂交液(比例为1:1:1:1:16)，即成HER2/CSP17双色探针。