[0001] 本发明涉及分析微生物的方法。所述分析是基于脂质谱，并且可以用于微生物识别。

[0002] 理想的是迅速且简单、可靠地识别微生物。可靠的识别允许微生物样本的致病性和/或其它特性可以被识别。确定微生物的生物分子组成可以协助识别继而诊断。

[0003] 质谱可用于分析生物分子，一般使用软电离技术。基质辅助激光解吸/电离(MALDI)-MS是这样的技术之一，并已被广泛地应用于大型生物分子包括蛋白质的分析。蛋白质指纹图谱使得MALDI-MS可以应用到微生物识别和诊断中。

[0004] 然而，蛋白质指纹图谱无法可靠地区分在同种的不同菌株。需要血清学检测或PCR分析，以测试样品的致病性。

[0005] 已知脂质对细胞内的结构很重要，并且它是细胞膜和其它亚细胞结构的主要组成部分。它们在主要细胞机制中是活跃的，并影响蛋白质的性质和功能。

[0006] US2012/0197535描述了从细菌样本中提取糖脂类(糖脂saccharolipid)。采用质谱技术(包括MALDI)分析糖脂组成使得可以识别细菌菌株。这种技术利用细菌外部细胞壁糖脂结构(例如脂质A、脂磷壁酸)的特异性。然而，该方法是开发用于并定制用于这些糖脂的特定提取，并且发明人已经发现，其不能广泛适用。例如，它不能被用来测定其它不含这些糖脂的微生物有机体(例如酵母或真菌)的识别。

[0007] 不同属(如细菌、酵母、丝状真菌)之间，即使是一个属的不同种级别中，微生物的细胞结构可以变化非常大。例如，取决于细胞结构特征，原核生物(如细菌)分成两大类，革兰氏阳性和革兰氏阴性。然而，尽管原核生物和真核生物(如酵母和真菌)的细胞结构的完全不同的构造，它们都具有细胞质膜。

[0008] 磷脂(PLs)(特别是甘油磷脂和鞘磷脂)已知是许多微生物的主要膜脂质。事实上，磷脂的生物合成的组分和磷脂本身是膜表面，并作为其它细胞膜组分的前身。[1][0009] 例如，阳离子磷脂酰胆碱(PC)，在真核生物中占总膜脂质的约50％，并且磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)作为次要组分。两性离子磷脂酰乙醇胺(PE)、阴离子磷脂酰甘油(PG)和/或心磷脂(CL)代表大多数已知细菌的主要膜脂质(例如大肠杆菌中有高达80％的PE)[2]。其它显著磷脂是PG的氨基酸酯(例如赖氨酰-，丙氨酰-，或鸟氨酰-PG)[14]。

[0010] 一些其它中性脂质(NLs)(或非极性脂质)，例如二酰基甘油(DAGs)，三酰基甘油(TAGs)和胆固醇酯(CEs)，已知在细胞膜的功能中起重要作用。虽然在原核生物(例如细菌)中很少发现CEs，它们是真核生物(即酵母、真菌和哺乳动物细胞)中更常见的脂质成分。这些脂质分子含有酯化到甘油或甾醇骨架的1-3个脂肪酸。NLs的一个重要的分组是糖基甘油二酯(例如双半乳糖基二酰甘油酯，DGDG)，其主要见于革兰氏阳性菌(如芽孢杆菌)[14]。

[0011] PLs(和NLs)对细胞膜的重要性，是指脂质组成的体内平衡对于维持微生物细胞细胞膜的完整性和功能(例如，跨膜信号传导、细胞间相互作用、能量代谢、细胞增殖等)，以及它们在不同环境中的生存是非常重要的[13]。公知的，细胞磷脂组合物的改变将导致微生物暴露于环境压力，如极端温度、有毒物质、食品添加剂和抗生素[4][5][6][7]。

[0012] 因此，微生物细胞具有非常特色的、基于进化的磷脂组合物，其可被用于化学分类的目的，由此，潜在地磷脂谱的微小差异可以用于菌株水平的区分。这允许可以识别具有特定特征的菌株，包括那些致病性和对抗生素产生抗药性的菌株。

[0013] 微生物的磷脂组合物是非常复杂的，并且其通常使用质谱(MS)来分析，因为它允许同时检测一个单独MS谱中的多个个体分子种类。使用MS对微生物进行分类的第一个例子是使用气体色谱(GC)-MS[8]。因为良好的色谱分离潜力，GC-MS被用于细胞脂肪酸分析[9]。然而，脂质需要被分解成组成性脂肪酸分子进行分析，因此不能测定细胞内的磷脂组合物。

[0014] 磷脂的功能分析表明，结构特性(如头部、链长、不饱和度)是膜功能的主要原因[10]。磷脂被分解成构成性脂肪酸时，该信息也会丢失。

[0015] 因此，在分析期间保存完整的磷脂结构的检测技术更适合化学分类的目的。一些报道已经显示完整的脂质谱对于，使用软电离技术，例如快原子轰击(FAB)[11]和电喷雾电离(ESI)-MS来区分细菌的作用[12]。

[0016] 然而，MALDI-MS通常是优选的软电离技术。可以简单和快速地获得数据，并且它是相对简单的分析，因为在对基质包埋的样品进行激光激发后，所述分子几乎被专一地检测为单电荷离子。。而且采用的仪器是稳健的和可靠的，其允许分析原始(即未纯化的)样品。因此，MALDI-MS已发展成基于“蛋白质指纹图谱”的微生物诊断的一个常规的技术[13]。

[0017] 最近，MALDI-MS已被报告为一种用于细菌磷脂分析的方法[14][15]。然而，可靠的样品制备步骤和仪器仪表技术的缺乏阻止了这些方法的广泛应用。通过使用MALDI-MS的磷脂分析进行常规细菌的识别，对关系紧密的细菌是不可能的，这阻碍了其在分类学中的使用。此外，目前在其他类型的微生物(如酵母和真菌)中，尚没有脂质MALDI-MS的成功分析的报道，它们仍必须通过使用光学显微镜观察细胞形态、基因分型、和/或蛋白质指纹图谱来识别。

[0018] 此外，使用基于MALDI-MS的磷脂分析来区分微生物菌株(在一个物种内)尚未见报道。也没有用于酵母或真菌的基于MALDI-MS的脂质谱(lipid profile)。

[0222] 下面描述的实施例是说明性的，仅作为示例的方式。

[0223] 方法

[0224] 微生物的细胞培养物

[0225] 培养13种不同的细菌种类和菌株(列于表1)。菌株于37℃在哥伦比亚血液(CB)琼脂或基本培养基(LB琼脂，Sigma)、及标准有氧条件下生长过夜(24小时)。

[0226]

[0227]

[0228] 表1：培养的细菌菌株。菌株6a和6b是溶血葡萄球菌和纹带棒状杆菌(C.Striatum)的混合培养物。菌株7和8是抗生素敏感性的，菌株9和10是耐抗生素的和菌株11、12和13是致病性大肠杆菌菌株。基于测定最小抑制浓度(MIC)值，针对17种不同的化合物测试了抗生素抗性。

[0229] 同样培养9种酵母菌株。它们属于酿酒酵母和库德里阿兹威(氏)酿酒酵母，和在GYP(葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨)介质中在室温(25℃)下生长三天。

[0230] 也培养丝状真菌(丝孢纲)。属于短梗霉属、曲霉属、青霉属、木霉属、节担菌属(Waliemia)和毛霉菌属的真菌在室温(25℃)下在麦芽提取物琼脂平板中生长一周。

[0231] 微生物脂质提取

[0232] 使用三种脂质的提取技术。

[0233] 在所有三种技术中，在CB琼脂或LB琼脂(Sigma)中在37℃下过夜培养含有纯细胞培养物(～106个细胞)的一个10μΙ塑料环(Nunc)，然后悬浮于500μΙ的双蒸馏水中，立刻涡旋并在微型离心机中以3000g离心3分钟。然后除去上清液，留下细菌细胞团块，并将其悬浮在40μΙ的双蒸馏水中。在进行脂质提取之前再重复一次该过程。

[0234] 在酵母和丝状真菌的情况下使用相同的步骤。

[0235] 方法1：甲醇提取

[0236] 向悬浮的细胞团中添加200μΙ甲醇(Sigma)。然后微生物细胞悬浮液在室温下超声处理5分钟，随后在冰上放置15分钟。然后将悬浮液涡旋几秒钟，在冰上再放置15分钟，以完成脂质提取。然后将所得悬浮液以12000g离心5分钟以沉淀细胞碎片。然后将上清液储存在-20℃直至进行MS分析。

[0237] 方法2：丙酮提取

[0238] 向悬浮的微生物细胞团中添加200μΙ丙酮。然后将细菌悬浮液置于冰上30分钟。然后将所得悬浮液在3000g离心3分钟。然后将上清液储存在-20℃直至进行MS分析。

[0239] 方法2a：甲醇：丙酮提取

[0240] 测试各种甲醇/丙酮的混合物用于酵母和真菌的脂质提取，结果显示出各种甲醇/丙酮的混合物均适合于提供良好的质谱质量。最好混合物范围为从70:30(体积)至90:10。

[0241] 方法3：氯仿/甲醇提取

[0242] 向悬浮的微生物细胞团中添加300μΙ氯仿：甲醇＝70：30(v/v)，然后将其放置在冰上30分钟。然后将75μΙ的0.7M甲酸添加到细胞悬浮液并在冰上放置另外15分钟。然后将细菌悬浮液涡旋几秒钟并置于冰上另外15分钟，以分离成上层水相上部和下层有机相。之后将细胞悬浮液以12000g离心5分钟，用移液管吸出包含被提取的脂质的下相并将其转移至新的样品瓶。最后脂质提取物被储存在-20℃直至进行MS分析。

[0243] MALDI样品制备

[0244] 使用不同脂类特异性共基质系统，以获得MALDI脂质谱。

[0245] 溶解在包含10mM乙酸钠的丙酮:甲醇(MeOH)＝70:30(v/v)中的2，4，6-三羟基苯乙酮(THAP)用于检测中性脂质(如DAGs、TAGs、DGDCs等等)。

[0246] 溶解在包含10mM柠檬酸氢二铵(DAHC)的乙醇(EtOH)：水(H2O)＝90:10(v/v)中的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)用于检测阳离子磷脂(例如PC、SM)。

[0247] 溶解在包含5mM的盐酸胍(GUA)或0.5％吡啶(PYR)作为基质添加剂的异丙醇：乙腈(ACN)＝60：40(v/v)中的9-氨基吖啶(9AA)用于检测阴离子PLs(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)。

[0248] 将少量体积(如0.3-0.5μΙ)且浓度为10g/L的基质点在MALDI靶表面，紧接着是等体积微生物脂质提取物。该已知的“干滴技术”对于脂质分析而言，是灵活的和完全自动化的点样方法[17]。

[0249] FlexiMassTM-DS(岛津，曼彻斯特，英国)48孔一次性聚合的目标玻片被用作样品支持物，因为它们相对于传统的不锈钢靶板(targets)提供了最佳表现而不会在低质量范围(如m/z<1000)产生任何干扰的背景噪音。

[0250] 结晶后，将样品插入到MALDI质谱仪，立即使用携带多达四个样品板的特定目标适配器(AXIMA-PrecisionTM，岛津，曼彻斯特，英国)进行分析。

[0251] 在制备用于蛋白质分析的MALDI样品的情况下，基质的溶液由溶解在包含最终浓度为3％TFA的33/33/33乙腈/乙醇/水的1ml的饱和的CHCA溶液组成。

[0252] 制备：称取约40毫克的CHCA，将其溶解在包含最终浓度为3％TFA的1mL 33/33/33乙腈/乙醇/水中(预先制备的)。涡旋混合。在室温下，得到饱和溶液；离心或允许任何不溶解的固体沉淀。

[0253] 分析混合物(脂质+蛋白质颗粒，或仅是蛋白质颗粒)：将1μΙ样品直接转移到MALDI靶，然后添加1μl CHCA基质溶液(见上)。

[0254] MALDI分析步骤与脂质分析相同，除了质量范围不同(2000-22000最大值)以及在正离子模式下进行。

[0255] MALDI-MS的测量

[0256] 使用装配有氮激光器(λ＝337nm)和用于直接观察靶表面和研究中的基质的集成单色视频-影像系统(25倍放大倍率)的MALDI-反射-TOF(RTOF)质谱仪(AXIMA-CFR+或AXIMA-Performance，岛津，曼彻斯特，英国)获得MALDI脂质谱。

[0257] 离子加速电压设为20千伏，以及反射器分析器在25千伏下进行操作。使用峰的基线单一同位素质量分辨率的离子延时引出，在正(+)或负(-)离子模式下进行测量。

[0258] 根据制造商的额定值(最大功率180)，将激光能量调整到激光辐射阈值以上的10-20％(功率90-100)，由此使用被调整到靶表面上的基质斑点的形态的圆形激光光栅(～
500-1000μm直径)。

[0259] 微生物识别

[0260] 进行层级聚类分析，基于脂质/蛋白质图谱的不同，使用市售统计软件包DataLab 3.5(http://www.lohninger.com/datalab)和BioNumerics 7.1(应用数学，比利时)建立可以显示微生物种类之间的关联性的树状图(dendrogramme)。在DataLab的情况下，使用欧几里德距离度量，并且联杆类型(linkage type)是基于沃德方法。

[0261] 统计分析前，对MALDI-MS数据进行了处理。首先，将每个单独生物的MALDI数据导出到所谓的包含m/z值和相应的信号强度的“质量名单”至Microsoft Excel 2007。其次，对来自所有样本的m/z值执行升序数据排列，以及从中减去来自培养介质(如CB或LB琼脂)的信号、用于脂质提取的信号管以及基质背景信号(记录自空白样品)。这导致了全部样品中发现的m/z值和相应信号强度的一个数据基质。第三，将每个生物体所有峰的信号强度归一化为信号的总和(即显示为％相对强度)，并导入到用于聚类分析的软件程序。

[0262] 实施例

[0263] 实施例1-提取溶剂的比较

[0264] 图1示出了6种不同的有机溶剂对带电荷的磷脂(PLs)和中性脂质(NLs)的提取效率。提取效率是基于在MALDI-MS谱中相应的脂质种类的信号强度来计算的。

[0265] 可以看出Folch、MTBE和MeOH溶剂优先允许检测到PLs，而丙酮则有利于NLs的检测。使用DIPE/BuOH时观察到两种脂类具有几乎相等的效率，而己烷的结果最差。

[0266] 基于这些初步结果，进一步评价Folch、MeOH和丙酮在脂质提取步骤中的应用和在针对来自不同的细菌、酵母和真菌种类的磷脂的MALDI-MS分析。

[0267] 将这三种溶剂施用于革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)。从图2可以看出，甲醇得到带有最佳信噪比(S/N)的脂质MALDI-MS谱。

[0268] 实施例2-基质物质的比较

[0269] 图3示出了包含不同脂质标准品的混合物的相同样本的三种不同的质谱。根据上述的方法，使用不同的基质物质得到质谱。由此可以看出，在负离子模式下，9AA-GUA允许检测到大量峰。这些对应于阴离子磷脂。

[0270] 也可以看出，ATT和THAP在正离子模式均能返回清晰的谱图。在ATT-DC谱峰对应于阳离子磷脂，以及THAP-Na峰对应于中性脂质。由此可以看出，在正离子模式下，检测到更少的峰。

[0271] 本申请发明人评估了三种不同的基质物质对于电离生物膜中存在的不同的主PL类的选择度。结果示于图4。

[0272] 数据显示，在正离子模式下，来自等摩尔PL-混合物的阳离子磷脂(PC和SM)比阴离子磷脂(如PA、PE、PS)更容易被电离和检测到，阴离子磷脂要么没有被检测到要么仅表现出微弱的信号(图2A)。ATT在正电离模式下，在所有磷脂PL范围内的测试中表现出最好的电离。

[0273] 与此相反，在负离子模式下阴离子磷脂(如PA、PE、PG、PS、PI、CL)容易被检测到，但是PC和SM无法被检测到(图2B)。9AA允许对所有阴离子磷脂几乎相等的检测，而THAP和ATT显示出倾向PG和PS而非其它PL类的电离。

[0274] 因此，ATT和9AA分别显示出在(+)和(-)离子模式下用于微生物脂质谱的优选基质物质。这些是优选的基质组分。

[0275] 实施例3-培养介质和电离模式的影响

[0276] 图5示出了在甲醇脂质提取溶剂存在下，来自血液琼脂的质谱。当在(+)的MALDI模式下而非(-)MALDL模式下测量时，可以在脂质谱质量范围(m/z 700-1500)内看到几个背景峰。

[0277] 这是因为血液琼脂中含有一些血浆脂质(例如，源自血细胞和脂蛋白)，其为主要的阳离子PL-类(主要为LPC、PC和SM)，和它们因此优先在(+)离子模式下被检测到。

[0278] 这个问题可以在(+)MALDI模式通过使用基本培养基(没有外源脂质)代替血液琼脂来规避。所得脂质质谱基本上是相同的，但含有较少的培养基污染物。然而，使用基本培养基通常导致不太有利的培养条件，并导致更长的温育时间以获得足够数量的细胞用于分析。该(-)模式允许在培养中使用血液琼脂，同时最小化来自琼脂的信号。

[0279] 实施例4-脂肪酸检测的

[0280] 负电离模式允许检测到构成脂质的脂肪酸残基分解产生的羧酸根阴离子。这有助于微生物识别，因为不同的菌株包括不同的FAs。

[0281] 图6A示出了根据所要求保护的方法用于大肠杆菌菌株得到的脂质MALDl-MS谱。插图示出了7个峰，其被认为是在大肠杆菌的脂质提取物中记录的PL的7种主要FA-残基。

[0282] 基于羧酸盐离子分配到在MS1模式下记录的脂质谱的特定的峰，在(-)模式下，使用串联质谱计算可检测的所有完整的PL的FA-组合物。

[0283] 图6B示出通过对来自图6A的质谱中三个最丰富(abundant)的信号(M/Z 688.5，702.5，716.5)进行低能量碰撞诱导解离(CID)分析。

[0284] 可以清楚地看到，每种MS2谱仅包含一个在MS1模式下测定的选定数量的[RCOO]-离子。基于该信息，可以识别代表三个峰的脂质种类组合物如下所示：

[0285] -PE(16:0/16:1(9Z)),PE(17:1(9Z)/15:0)的m/z值为688.5；

[0286] -PE(16:0/17:1(9Z)),PE(17:0/16:1(9Z))的m/z值为702.5；和

[0287] -PE(6:0/18:1(9Z)),PE(17:0/17:1(9Z))的m/z值为716.5。

[0288] 这些发现与先前公布的通过(-)LC-ESI-MS/MS获得的大肠杆菌的脂质组成的数据相匹配[18]。然而，MALDl-MS分析更简单，并可以更快地执行。

[0289] 然而，应该指出的是，FA-残基的确切结构(例如包括链支化、环化或双键的位置)不能使用低能量的CID(例如cy17:0和17:1之间的区别)阐明。为了得到该信息，使用允许高能量的MALDI-CID-MS/MS的仪器是必要的[19]。

[0290] 实施例5-谱的可再现性

[0291] 通过对属于酿酒酵母和库德里阿兹威(氏)酿酒酵母的9种不同的酵母菌株根据所要求保护的方法获得MALDI质谱图。

[0292] 酿酒酵母的脂质组成是众所周知的[20]。因此，可以将通过不同质谱得到的峰容易地分配到特定的脂质。

[0293] MALDI脂质谱中单个种类的可再现性测量为相对信号强度变化(RSIV)，所述RSIV是在(+)和(-)MALDI模式下，使用THAP、ATT和9AA基质从同一生物制备的4个独立样品中记录到的Nls和PLs的单个峰的变化系数(CV)测定的。参见图12A到12C。

[0294] -与酿酒酵母的主要二酰甘油(DAG)和三酰甘油(TAG)分子种类相关的14个峰代表的NL-谱的RSIV显示平均CV值为10.4±5.2。

[0295] -与主要溶血磷脂酰胆碱(LPC)和磷脂酰胆碱(PC)的分子种类相关的25个峰代表的阳离子PL-谱的RSIV显示平均CV值为13.2±7.9。

[0296] -与主要磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇相关的24个峰代表的阴离子PL-谱的RSIV显示平均CV值为15.8±10.8。

[0297] 这些数据是在常规分析系统误差的范围内。因此，该谱是高度可再现的，并且所要求保护的方法满足可靠地用于微生物诊断的要求。

[0298] 实施例6-4种不同的微生物种类的分化

[0299] 对4种微生物进行甲醇脂质提取。这些是：

[0300] 1.金黄色葡萄球菌-革兰氏阳性菌

[0301] 2.大肠杆菌-革兰氏阴性菌

[0302] 3.酵母菌-酵母

[0303] 4.青霉菌-丝状真菌

[0304] 单独将每个脂质提取物添加到ATT基质中，并在正离子模式下得到MALDI-MS谱。结果示于图7A。

[0305] 单据将每个脂质提取物添加到9AA基质中，并且在负离子模式下得到MALDI-MS谱。结果示于图7B。

[0306] 对MALDI质谱的目视检查清楚地表明，微生物可以被区分。记录在m/z400-1000之间(最多1500，在负离子模式下)的包括60-80种选定的脂类相关的峰基于(+)和(-)MALDI脂质谱数据的聚类分析，显示了不同微生物物种之间良好的区分。参见图8A和8B。

[0307] 基于聚类分析的不同微生物分类，其(+)和(-)MALDI模式下的脂质谱是基本相同的。这一观察表明只使用一种电离模式的对于可靠地区分微生物是足够的。

[0308] 实施例7-在菌株水平的细菌区分

[0309] 大肠杆菌代表一种与属于“肠杆菌”科的其他种(如肠杆菌属，志贺氏菌，沙门氏菌，克雷伯氏菌属等)关系紧密的革兰氏阴性菌的不同组，，其通常居住在温血生物体(例如，不同的哺乳动物物种包括人类)的肠道。

[0310] 根据上述方法分析表1中列出的13种细菌，包括抗生素抗性、抗生素敏感性和致病性大肠杆菌菌株。

[0311] 图9显示了四种大肠杆菌在m/z范围为240-400和650-800的MALDI质谱。

[0312] MALDI-MS谱之间的差异是非常明显的。特别是，菌株#7和#8(即对抗生素敏感的两个)的图谱与菌株#11和#13(即耐药株)的图谱明显不同。

[0313] 通过观察MALDI-QIT-TOF-MS/MS的FA图谱(即基于[RCOO]-离子的检测)(图9A)，表明，这些差异主要归因于17:1(cy17：0)和18：1的不同内容，其代表由圆圈指出的在m/z 702和716(图9B)处峰的主要FA残基。

[0314] 表1中列出的所有物种的聚类分析显示了以下两大主要群体的区分；

[0315] (1)革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(#1)，表皮葡萄球菌(#3)，及溶血葡萄球菌和纹带棒状杆菌的混合培养物(#6)；和

[0316] (2)革兰氏阴性肠杆菌与大肠杆菌三个子群集及相关物种(例如，铜绿假单胞菌和粪肠球菌)。

[0317] 见图10。

[0318] 由此，抗生素敏感株(#7)可以清楚地分别从抗生素抗性株(#9、#10)与致肠病菌株EIEC(#11)、EAEC(#12)和EPEC(#13)中区分。

[0319] 在聚类分析中，更远处的簇中发现完全敏感性致肾盂肾炎(UPEC)大肠杆菌12M050679菌株(#8)和铜绿假单胞菌和粪肠球菌。

[0320] 使用其他软件工具(BioNumerics)对同一数据集也进行聚类分析，结果非常相似。这表明，该方法是稳健的。

[0321] 在所谓的“最小生成树”(MST)的形式显示的结果，表明我们的研究中分析的不同细菌的相对关联性(见图11)。

[0322] 其他实施例及分析

[0323] 图13显示了“多合一”微生物识别方法(相同微生物的脂质指纹图谱和蛋白质指纹图谱)，其利用快速单步提取(～5-10分钟，取决于细胞壁结构的刚性)，以及使用甲醇或乙醇和超声波降解。由此，形成亲水性和疏水性分子(即主要是细胞蛋白质和膜脂质)的均匀悬浮液。这使得允许通过使用最合适的MALDI基质系统(即CHCA用于蛋白质；ATT或9AA用于脂质)及在正和/或负离子模式下的MALDI-MS分析同时分析蛋白质和脂质，。最后，将获得的MS数据使用生物信息学软件工具(例如，多变量数据分析)从数据库中进行检索。

[0324] 相比已知的用于细胞提取的方法(例如Bruker)，其耗时少且灵敏，因为它可以避免充分洗涤、提取、干燥和重悬，其会带来样品流失和修饰的风险(例如人工氧化和降解)。

[0325] 通过将分析的有效质量范围从2-20kDa扩大到0.2-20kDa，并包含不同类型的分子(如蛋白质和脂质)的信息内容，这种方法相对于仅仅聚焦于蛋白质模式识别(即MALDI蛋白质分型)的现存方法具有显著的改善。

[0326] 图14和15示出了通过MALDI-MS用于分析细菌脂质的单步提取的提高。使用超声提取方法，可以在比传统方法更短的时间内获得来自革兰氏阴性(图14A)和革兰氏阳性(图14B)的高质量质谱(5分钟超声vs冰上涡旋30分钟)，使得该方法更适合于日常工作(例如，在临床实验室)。此外，可以检测到额外的脂质种类(例如来自金黄色葡萄球菌的赖氨酰-PG)，这增加了分析的信息内容。例如甲醇或乙醇的使用提高了质谱的质量(图15A和15B)，并相比用于脂质提取的传统溶剂(例如氯仿)，其降低了背景信号(例如，“塑料峰”)的贡献(图15C)。

[0327] 图16至图18表明“多合一”方式对于细菌识别的优点。图16显示了不同大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的SARAMIS搜索结果。可以看出，基于％ID和数据计数(评分)的使用单步提取方法((A)蓝色、顶部集、提取＝甲醇)的确认水平相比来自培养板的直接细胞分析((B)红，底部集)基本上更高。在肺炎克雷伯菌包含相比大肠杆菌更为刚性的细胞壁的情况下，差异尤其明显。这清楚地表明我们蛋白分型方法的优势。使用另外的基于在负离子模式下检测脂肪酸(即羧酸根阴离子)和完整的磷脂(PLs)的脂质谱的信息内容(图17)，可以得到基于聚类分析的大肠杆菌菌株的清晰分类(图18)。这允许区分两种致病(红色上部框EIEC E35990，和第三框EPEC E2347)和非致病性(黑色第二个框12M050679大肠杆菌完全敏感性，和下框DH5阿尔法大肠杆菌)菌株，而基于单独的蛋白分型(SARAMIS)则无法实现该区分(图16)。

[0328] 这证明了MALDI脂质分型(lipotyping)对于识别关系紧密的的细菌种类提供了附加值。

[0329] 图19至21表明“全合一”方式对于真菌识别的优点。图19显示了不同酵母和丝状真菌的SARAMIS搜索结果。可以看出，确认水平(列标题为“％”)(甚至在从细胞提取蛋白质后)要么非常差要么在许多情况下没有有用的用于识别的质谱。这表明了蛋白质分型用于识别酵母菌特别是丝状真菌的一般问题，与大多数细菌相比所述丝状真菌包含更刚性的细胞壁结构。相反，在正离子模式下使用脂质谱，随后是单步提取方法(图20)，可以得到酵母(例如酵母属)和不同的丝状真菌(例如曲霉属、青霉属、木霉属等等)的的良好区分(图21)。

[0330] 图22和23示出了对应于图16的蛋白质分析的样品的蛋白质m/z范围。良好信噪比和峰值分辨率有助于高置信水平(图16的％值)。

[0331] 关于将给定微生物的脂质组分和蛋白质组分的质谱数据进行合并，本申请发明人已获得酿酒酵母的蛋白质质谱(使用CHCA基质)和相同的微生物的脂质质谱(使用ATT基质)，然后结合/合并它们。具体地，通过合并m/z范围从500至900的脂质数据和m/z范围从2000到15000的蛋白质数据，得到m/z范围从500到15000的合并数据集。基于此合并的质谱数据的聚类分析，可以使得菌株水平的识别。

[0332] 这些结果证明了结合脂质和蛋白质提取的优点，以及用于识别真菌的分析方法的优点。在这个和其他情况下(例如细菌和真菌孢子、分枝杆菌、脂包膜病毒等)，其中常规蛋白质分型因为缺乏适当的蛋白质提取和/或缺乏信息蛋白图谱而妥协，MALDI脂质分型(lipotyping)显示出其具有作为微生物识别的新的独立的工具的潜力。

[0333] 参考文献：

[0334] 以上引用了很多出版物，以便更充分地描述和公开本发明以及与本发明有关的现有技术状态。以下提供了这些参考文献的完整引用。将每个这些参考文献的全部内容全部并入本文。

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