[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种通过微生物发酵生产肌酸的方法。

[0002] 肌酸(Creatine)化学名称为N-甲基胍乙酸，又称为胍基醋酸、肌肉素、肌氨基酸、甲胍基醋酸等，是脊椎动物体内自然产生的一种氨基酸衍生物，是存在于人体中的天然营养素，人体中的肌酸是由精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸在肝、肾、胰脏中合成经由血液输送到肌肉组织，并以磷酸肌酸盐的形式贮存于肌肉组织。肌酸对促进核酸、蛋白质的合成，增加体内能量物质的储备，促进肌肉的生长，以及延缓疲劳和加速体能恢复具有重要的作用。肌酸是当前使用最广的运动营养补剂，其作为一种运动营养物质，可显著提高肌肉力量和肌体的持久力，具有抗疲劳、促恢复的功效，是运动营养补剂中的常青树。由于肌酸不属于激素类物质，其不会产生耐药性和生理性副反应，因而肌酸营养制剂备受人们亲睐，国内外对肌酸的生产及应用都予以足够的重视。

[0003] 目前，肌酸主要通过化学合成方法获得，合成肌酸的路线主要有以下几种：1.氰化钙与肌氨酸钠水溶液反应直接生成肌酸；2.氰化钙与用干燥的氯化氢气体饱和了的甲醇溶液反应得O-甲基异脲盐酸盐，O-甲基异脲盐酸盐再和肌氨酸反应得到肌酸；3.氰化钙和盐酸水溶液在通入空气的条件下生成氯代甲脒氯化物，然后和肌氨酸钠反应得到肌酸；4.氨基氰与氯乙酸、甲胺反应得到一水肌酸；5.以硫脲和硫酸二甲酯为原料生成S-甲基异硫脲硫酸盐，S-甲基异硫脲硫酸盐再和肌氨酸、肌氨酸钠或肌氨酸钾反应得到肌酸；6.尿素和硫酸二甲酯反应得到O-甲基异脲硫酸甲酯，不用进一步纯化，再和肌氨酸钠反应得到肌酸。上述反应方式的反应时间长，操作工艺复杂，且产品纯度也不是很高。这些传统的制备方法中往往涉及剧毒的氰胺或者收率不够理想，从而具有极大的安全隐患和生产成本高的弊端，尤其对于大规模工业化生产中，剧毒物质的泄漏很容易造成人员伤亡，同时也不贴合绿色环保的潮流。

[0004] 通过化学合成方法生产的肌酸一般都带有异味比如苦味，不能直接用作食品添加剂，往往需要用硫代硫酸钠等脱苦味剂来处理，后处理工艺复杂，收率仅为50％左右。

[0005] 目前，人们普遍认为天然或生物来源的化合物更安全，对于食品成分包括食品添加剂的来源越来越追求“天然化”。出于市场推广目的，食品和饮料生产商都更乐意使用生物来源的产品来替代化学方法合成出来的相同物质。肌酸作为广泛使用的食品添加剂，寻找一种生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。

[0026] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0027] 本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

[0028] 本发明的实施例中，如果对于操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温(15-30℃)。

[0029] 在本文中，对于本发明，术语“肌酸基因工程生产菌”、“肌酸生产菌”、“肌酸基因工程菌”表示相同的意义，都是指发明人构建的用于发酵生产肌酸的微生物。

[0030] 在本发明中，术语“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒状杆菌”、“菌株CGMCC No.12602”、“谷氨酸棒(状)杆菌HR056”表示相同的意义，都是指发明人构建的用于发酵生产肌酸的菌株。

[0031] 美国食品和药品监督管理局FDA和中国政府对于作为食品添加剂肌酸有严格的规定，比如，FDA已对用于食品、药物和化妆品的肌酸制定了标准。此外，仅“安全的”有机溶剂可用于肌酸的合成，并且这些溶剂的残留量应被控制到符合标准。

[0032] 中国国家发展和改革委员会于2006年12月17日发布了食用肌酸的轻工行业标准QB/T 2834-2006。该标准规定：食用肌酸中的一水合物(一水肌酸，Creatine Monohydrate)的质量分数不低于99.0％，无异味，铅含量不高于0.5(mg/kg)，无机砷含量不高于0.25(mg/kg)，不含致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌)。

[0033] 为了满足肌酸的FDA标准和中国的QB/T 2834-2006标准，并且满足消费者以及食品和饮料生产商对于食品添加剂肌酸“天然化”或“生物化”来源的追求，发明人研究了用微生物发酵来生产肌酸的方法。发明人对于用于构建基因工程菌株的微生物品种进行了筛选，摒弃了虽然常用、但有潜在致病性的微生物比如大肠肝菌，选择无致病性的谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、乳糖发酵短杆菌、散枝短杆菌、黄色短杆菌和产氨短杆菌等作为宿主，构建了基因工程菌，通过筛选，得到可通过一步发酵生产肌酸的几种菌株。这些菌株在发酵过程中不会产生可能对于大部分人群造成危害的内毒素，符合“无毒无害”的设计思想。

[0034] 作为一种优选的实施方式，本发明的菌株还能够过表达一种以上选自下组的酶： N-乙酰谷氨酰胺酶(N-acetylglutamokinase)、N-乙酰谷氨酸酸-γ-半醛脱氢酶(N-acetylglutamate-γ-semialdehyde dehydrogenase)、精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinase)。

[0035] 在发酵过程中，为了得到较高的肌酸产率，可以对溶氧、温度、pH等条件进行必要的调节和控制。

[0036] 优选进行发酵时，常数dO2控制在15％～25％。例如发酵可以在下述条件下进行：空气流量约为1vvm，其中vvm(通气比)是每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值(例如，对于一个30升的发酵罐，1vvm等于30L/min；而对于一个5升的发酵罐，1vvm等于5L/min)。

[0037] 优选进行发酵时，温度控制在30～32℃；在发酵后期，可将温度提高到34～37℃，以便于肌酸的合成和排到发酵液中。

[0038] 优选进行发酵时，pH控制在pH7.0-8.0，优选pH7.0-7.5、更优选pH7.0-7.2；在发酵后期，可将pH控制在7.5左右，以便于肌酸的合成和排到发酵液中。

[0039] 上述的术语“发酵后期”是指微生物生长平台期至衰亡期。比如用OD600nm值监测微生物浓度时，OD600nm值不再上升并且趋于下降。

[0040] 整个发酵过程残糖控制在1％～3.0％左右，更优选控制在1.5％～2.5％。

[0041] 发酵结束后，需要对发酵液进行回收，从中提取肌酸。例如，通过离心方法得到除去菌体的上清液，必要时浓缩上清液；再调节上清液的pH值，通过等电点(pI，isoelectric point)法使肌酸沉淀出来。或者通过过滤(包括超滤、纳滤等)方法除去菌体和大分子物质，得到滤液，必要时浓缩滤液；再调节pH值，通过等电点法使肌酸沉淀出来。或者通过离心方法得到除去菌体的上清液，再通过超滤或纳滤等方法除去大分子物质，得到滤液，必要时浓缩滤液；再调节pH值，通过等电点法使肌酸沉淀出来。也可以使用离子交换树脂或者硅胶通过层析法来提取肌酸。

[0042] 利用等电点法从发酵液中分离肌酸时，由于室温下肌酸在水中等电点是11.10左右，故调节上清液或滤液的酸碱度，使其pH值保持在11.10左右，此时肌酸在水中的溶解度达最小，有利于从发酵液中结晶出来。

[0043] 为了进一步提高肌酸的纯度，可以将肌酸产物在水中进行重结晶。通过干燥比如真空干燥后，可得白色固体肌酸。由于制备过程中不使用有机溶剂，所得到的肌酸产品比如一水肌酸不含化学异味比如苦味，可直接用于食品或饮料制造。

[0044] 实施例

[0045] 实施例1：预培养和发酵

[0046] 将装在甘油管中的菌株CGMCC No.12602保藏液解冻，接种于种子培养基中(葡萄糖75g/L、玉米浆25-30g/L、(NH4)2SO4 20g/L、KH2PO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、尿素1.0g/L、组氨酸30mg/L、糖蜜25g/L、甘氨酸50g/L、生物素100μg/L，消泡剂0.2g/L，pH 7.0)中，5000mL三角瓶装液量500mL，30℃培养18小时，吸光度值ΔOD＝0.4-0.5时下摇床，得种子培养液。经检测，无杂菌。

[0047] 将500mL种子培养液接种于7升发酵罐中，装液量5升。培养基成分与种子培养基相同，pH＝6.4～6.7(灭菌后)。补料培养基：硫酸铵500g/L、葡萄糖650g/L。培养温度30℃，罐压0.05Mpa，初始通气比1vvm。搅拌600rpm。发酵中pH控制在7.0～7.2；在发酵后期，pH控制在7.5左右。通风量和搅拌转速的调节是根据溶氧灵活控制的，溶氧常数dO2控制在15～25％。残糖控制：当初糖降至3.0％左右时，开始流加补料，整个发酵过程残糖控制在1.5％～2.0％左右。发酵总时间为50小时，产品肌酸浓度达61g/L。

[0048] 实施例2：发酵液的分离