[0001] 本发明属于转基因实验方法领域，具体为一种农杆菌介导外植体遗传转化方法。

[0002] 共培养是植物转基因实验转化过程中最为关键的一环。T-DNA的转移及整合都在此时完成。农杆菌附着外植体后不能立即转化，附着16h后才能诱发肿瘤经过“细胞调节期”，使T-DNA发生转移。因此共培养时间较长。但共培养时间过长，也可能导致农杆菌过度增殖使植物细胞受到毒害而死亡。共培养中农杆菌的增殖速度直接与转化有关，农杆菌增殖和生长状态与其侵染能力相关。

[0003] 农杆菌培养大多直接将外植体放在固体培养基上培养，由于常使用的培养基加入了大量元素、微量元素、蔗糖等物质（常用共培养基成份为：MS（大量，微量，有机，肌醇）+ 3%（W/V）蔗糖+ 200uM AS + 0.7%（W/V）琼脂粉），一是比较容易染菌；二是由于培养基含水量高，而且没有滤纸，容易造成农杆菌过度生长，导致后期由于无法抑制过多农杆菌的生长使外植体褐化而死。根癌农杆菌侵染外植体时，既要使菌液和外植体充分接触，T-DNA能转移到植物细胞，又不能使外植体受到农杆菌毒害过大，导致后期由于无法抑制过多农杆菌的生长使外植体褐化而死。现有技术培养过程中大多因共培养过程操作不当导致转化率低下甚至后续实验无法进行。

[0018] 实施例1一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：1）农杆菌的活化、2）农杆菌侵染外植体和
3）农杆菌和外植体共培养、4）外植体诱导和筛选分化，所述农杆菌和外植体共培养步骤的操作为：在固体共培养基上放置灭菌Whatman No.1滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上，22-23℃，黑暗状态下培养3~4天。

[0019] 所述固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%（W/V）的琼脂粉。高压灭菌后加入200uM AS（乙酰丁香酮）。

[0020] Whatman定性滤纸用于定性分析技术中鉴定物质的性质。折叠好的定性滤纸与相同型号平整的滤纸相比，加快了流速和增加了负载力。

[0021] 所述农杆菌活化的具体操作为：取冻存农杆菌，在冰上融化后接种于5ml YEP液体培养基中，28℃，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至OD600=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200μM 乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。

[0022] 所述农杆菌侵染外植体的具体操作为：外植体与活化的农杆菌悬液混合，室温下，浸染时间为10~30min。

[0023] 对杨树叶片等外植体诱导和筛选分化的具体操作为：经过共培养后的外植体用附加200~300mg/L Timentin的无菌水清洗后，以无菌滤纸吸去残留液体，于分化培养基上光照培养5-7天，转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基上生根。分化、选择、生根培养条件：温度25℃，光照14h/d，光照强度1600~2000lux。

[0024] 对于小麦胚等外植体诱导和筛选分化过程的具体操作为：经过共培养后的外植体用附加250mg/L Timentin的无菌水洗3-4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于诱导培养基上黑暗培养3-4周，然后转移至选择培养基上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基上生根，所述诱导培养、选择培养、生根培养的条件：温度25℃，光照16h/d，光照强度1600~2000lux。

[0025] 所述外植体叶片、叶柄、茎、幼胚、成熟胚。 所述农杆菌菌株EHA105，LBA4404，GV3101、AGL1。

[0026] 本实施例中采用简化的固体培养基与无菌滤纸相结合的技术方案来进行农杆菌与外植体的共培养操作，在现有技术中农杆菌培养大多直接将外植体放在固体培养基上培养，由于常使用的培养基加入了大量元素、微量元素、蔗糖等物质（常用共培养基成份为：MS（大量，微量，有机，肌醇）+3%（W/V）蔗糖+ 0.7%（W/V）琼脂粉+ 200uM AS），一是比较容易染菌；二是由于培养基含水量高，而且没有滤纸，容易造成农杆菌过度生长，导致后期由于无法抑制过多农杆菌的生长使外植体褐化而死。

[0027] 也有些现有技术中将滤纸直接放在无菌培养皿中，在滤纸上加入无菌水，然后将外植体直接放入其中培养，整个培养过程中没有使用培养基。本发明的研究过程中发现，上述操作比较适合愈伤组织的培养，在外植体共培养中使用上述方法培养过程容易缺水，不能保证长时间的适度湿润，只有如本实施例中将简化培养基于滤纸结合才能保证最佳的湿润度，且不易污染。

[0028] 实施例2本实施例是在实施例1的基础上进行的具体的改进
一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：
1）农杆菌的活化：
菌株为农杆菌EHA105 (pCAMBIA3301)。从-80℃冰箱中取出农杆菌，在冰上融化后接种于5ml YEP（添加50mg/L 利福平（Rif）、5mg/L 四环素（Tet）和50 mg/L 卡那霉素（Km））液体培养基中，28℃，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至OD600=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200μM 乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。

[0029] 2）农杆菌侵染外植体：外植体选择山新杨（Populus davidiana×P.bolleana）无菌苗，取新鲜、幼嫩的无菌苗
2
叶片，用解剖刀切成1cm大小的叶盘，将叶盘与活化的EHA105（pCAMBIA3301）菌液混合，室温下侵染15min。

[0030] 3）农杆菌与外植体共培养：在固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上，在22-23℃条件下黑暗培养3~4天。所述固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%（W/V）的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM AS。所述滤纸为Whatman No.1定性滤纸（直径9cm）。

[0031] 4）外植体诱导和筛选分化：用附加250mg/L Timentin的无菌水洗外植体3-4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于分化培养基上光照培养5-7天，然后转移至选择培养基（MS+ NAA0.1 mg/L +6-BA0.2 mg/L +TDZ0.01 mg/L +Km50mg/L+Timentin 250mg/L）上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基（MS+NAA0.1mg/L+Km50mg/L+Timentin 250mg/L）上生根。温度25℃，光照14h/d，光照强度1600~2000lux。

[0032] 实验结果：侵染后的杨树叶片直接在培养基上共培养或在滤纸上共培养3天。共培养结束后挑取叶片进行GUS瞬时表达检测。结果显示，使用干燥共培养时GUS瞬时表达率和GUS瞬时平均表达量，均比直接在普通培养基上共培养时高10%左右。

[0033] 实施例3一种农杆菌介导外植体遗传转化方法，包括：
1） 农杆菌的活化：
根癌农杆菌菌株为LBA4404，携带双元载体质粒pBI121。该质粒T-DNA区带有β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因和新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)基因，均由CaMV35S启动子驱动。
从-80℃冰箱中取出农杆菌，在冰上融化后接种于5ml YEP（添加50mg/L 利福平（Rif）、50 mg/L 卡那霉素（Km））液体培养基中，28℃，200rpm过夜振荡培养；次日扩大培养于50ml的YEP液体培养基中，振荡培养至OD600=0.6-0.8，离心收集菌体，重悬于侵染培养液中，侵染前加入200μM 乙酰丁香酮，得活化的农杆菌悬液。

[0034] 2）农杆菌侵染外植体：外植体选择普通小麦（Triticum aestivum L.）品种EM12的幼胚或成熟胚。将外植体与活化的农杆菌悬液混合，常温下侵染30min。

[0035] 3）农杆菌与外植体共培养：共培养方式：一种为直接在普通共培养培养基（MS（大量、微量、有机、肌醇）+3%（W/V）蔗糖+0.7%（W/V）琼脂粉+200μM AS）上进行共培养；另一种在简化固体共培养基上放置灭菌滤纸，将农杆菌侵染后的外植体表面菌液吸净后放置在所述灭菌滤纸上，在22-23℃条件下黑暗培养3~4天。所述固体共培养基的制备方法为：蒸馏水加入0.7%（W/V）的琼脂粉，高压灭菌后加入200uM AS。所述滤纸为Whatman No.1定性滤纸（直径9cm）。

[0036] 4）外植体诱导和筛选分化：用附加250mg/L Timentin的无菌水洗外植体3-4遍，再用无菌滤纸吸去残留液体，于诱导培养基上黑暗培养3-4周，然后转移至选择培养基（MS+2,4-D0.1mg/L+Zeatin5.0mg/L+G418 25mg/L+Timentin 250mg/L）上培养，待抗性芽长至1-2cm时转至生根培养基（MS+NAA0.1mg/L+G418 25mg/L+Timentin 250mg/L）上生根。温度25℃，光照16h/d，光照强度1600~2000lux。

[0037] 实验结果：侵染后的小麦幼胚或成熟胚直接在培养基上共培养或在滤纸上共培养3天。共培养结束后3 天挑取愈伤组织进行GUS瞬时表达检测。结果显示，使干燥共培养时GUS瞬时表达率和GUS瞬时平均表达量，均比直接在普通培养基上共培养时高15%左右。使用简化培养基干燥共培养时GUS瞬时表达率达到90%以上，GUS瞬时表达位点遍布整个愈伤组织。

[0038] 另外，在滤纸上共培养后的愈伤组织含菌量较少。使用滤纸上共培养处理时，洗菌后涂平板，发现农杆菌菌斑数较少，浓度较低，能有效减少外植体携带菌量，因此使转化受体在诱导、筛选分化阶段易于控制农杆菌的繁殖。可见，在滤纸上共培养处理比直接在培养基上共培养更有助于提高根癌农杆菌转化效率（图1）。