[0001] 本发明涉及显示出抑制炎性细胞因子产生的优良效果的，改善生物体中的过度炎症反应(excessive inflammation)的，对例如结缔组织疾病、变应性疾病、代谢性疾病和传染病的预防或治疗有用的，并且具有优良的稳定性和安全性的抗炎剂。本发明还涉及各自包含抗炎剂的抗炎用饮食品、抗炎用营养组合物和抗炎用饲料。

[0002] 炎性细胞因子由淋巴细胞(lymphocytes)和巨噬细胞产生并且参与细菌或病毒感染、肿瘤或组织损伤相关的炎症反应。已知的炎性细胞因子包括白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和GM-CSF。炎性细胞因子作用于生物体内的肝脏，以诱导急性期蛋白质的合成和分泌、或提高中性粒细胞(neutrophils)至内皮细胞的附着。另外，炎性细胞因子诱导如白细胞介素-8(IL-8)和MCP-1等趋化因子介导中性粒细胞、单核细胞或淋巴细胞向炎症部位的趋化性，导致炎症的开始。炎性细胞因子的过剩产生引起病理状态，如全身炎症反应综合征、结缔组织疾病(例如，慢性类风湿性关节炎)、变应性疾病、代谢性疾病(例如，动脉硬化、胰岛素耐受性和糖尿病)、和传染病(例如，多发性硬化症、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、病毒性肝炎和HIV感染)。因此，已报道炎性细胞因子的产生抑制对此类病理状态的预防、治疗或改善，或者其复发的预防非常有用。尽管已知抗组胺或类固醇为抑制生物体内的过度炎症反应的药物，但此类药物可引起副作用，包括耳鸣、头痛和厌食。另外，考虑到安全性或生产成本，此类物质不可添加至饮食品中。在这些情况下，出现对可日常安全地摄取并且可抑制炎性细胞因子的过剩产生的饮食品或饲料的开发的需要。

[0003] 乳凝集素(lactadherin)为存在于乳脂肪球膜中的糖蛋白，并占牛乳脂肪球膜所包含的蛋白质的10％。乳凝集素的分子量为43kDa至53kDa，等电点为7.0，并包括两个表皮生长因子样结构域。牛乳中包含的乳凝集素还称作PAS-VI-VII(PAS6/7)，鼠乳中包含的乳凝集素还称作MFG-E8。乳凝集素被认为在调节新生儿的胃肠功能中发挥作用，并且出于防止新生儿感染轮状病毒的目的将乳凝集素掺入婴儿奶粉。

[0004] 能够抑制炎性细胞因子的过剩产生的传统食品成分包括鞘磷脂、乳过氧化物酶和酸性低聚木糖(acidic xylooligosaccharides)。不幸地，尚未知道乳凝集素和/或乳凝集素的分解物具有抑制炎性细胞因子产生的优良效果，或者改善生物体内的过度炎症反应。

[0005] 现有技术文献

[0006] 专利文献

[0007] 专利文献1：日本专利申请特开2007-112793号公报

[0008] 专利文献2：日本专利申请特开2007-223910号公报

[0009] 非专利文献

[0010] 非 专 利 文 献 1 ：Journal of Nutritional Science andVitaminology,56,54-59,2010

[0025] 为抗炎剂的活性成分的乳凝集素可通过将组分(A)、(B)或(C)使用超滤(UF)膜、微滤(MF)膜、反渗透(RO)膜或离子交换树脂的脱盐(desaltation)或浓缩来制备，其中组分(A)为酪乳，其为由原料乳生产黄油(butter)期间制备的水相组分；组分(B)为将原料乳的分离器分离获得的具有40至50％脂肪含量的奶油(cream)再次分离器分离获得的具有60％以上的脂肪含量的高脂肪奶油进行加热或剪切处理，高脂肪奶油相转变(phase inversion)时排出的水相组分；和组分(C)为黄油乳清(butter serum)，其为从加热熔融的黄油中分离的水相组分。可选地，乳凝集素可由以下程序制备：将盐酸添加至黄油乳清至pH为4.4，将氯化钙添加至所得混合物并将混合物保持在50℃达30分钟，接着分离，并将所得沉淀物溶解或悬浮在水中，接着使用超滤(UF)膜、微滤(MF)膜、反渗透(RO)膜或离子交换树脂将溶液或悬浮液脱盐或浓缩。为抗炎剂的活性成分的乳凝集素分解物可由乳凝集素用蛋白酶分解来制备。蛋白酶的实例包括商购可得的食品·工业用蛋白酶产品如蛋白酶A"Amano"SD(商品名)、Thermoase PC10F(商品名)和Protin SD-AY10(商品名)，胰蛋白酶，胰酶制剂，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。可组合使用这些蛋白酶。上述制备的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可冷冻干燥或喷雾干燥。

[0026] 乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可由哺乳类如人、奶牛、水牛、山羊或绵羊的乳制备、通过基因工程技术生产、或由此类哺乳类的血液或器官的精制。乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可由此类材料通过简单工序以低成本生产，且所得产物可日常安全地摄取。特别地，乳凝集素和/或乳凝集素的分解物优选源于牛乳。乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可为商购可得的精制试剂。

[0027] 乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可用作抗炎剂而无需任何处理，或者可任选地由常规工艺制备为粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或饮品。冷冻干燥或喷雾干燥的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可用作抗炎剂而无需任何处理，或可由常规工艺制备为任何产品。

[0028] 可将所得乳凝集素产品掺入至营养剂、饮食品(例如，酸奶、饮料和薄饼)、营养组合物或饲料。

[0029] 除乳凝集素和/或乳凝集素的分解物以外，本发明的抗炎用饮食品、抗炎用营养组合物或抗炎用饲料可包含常见包含于任何其它饮食品或饲料中的任何材料。此类材料的实例包括稳定剂、糖类、脂质、香料、维生素、矿物质、类黄酮和多酚。抗炎用饮食品、抗炎用营养组合物或抗炎用饲料可包含与作为活性成分的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物组合显示出抗炎效果的任何组分，如鞘磷脂、乳过氧化物酶或酸性低聚木糖。

[0030] 抗炎用饮食品、抗炎用营养组合物或抗炎用饲料可以任意量包含乳凝集素和/或乳凝集素的分解物。本发明中为了实现抑制炎性细胞因子产生的效果，优选调整乳凝集素和/或乳凝集素的分解物掺入至药物、饮食品或饲料的量以使乳凝集素和/或乳凝集素的分解物的每成人每日口服剂量为5mg以上。

[0031] 通过将适当的助剂添加至其为活性成分的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物中可将抗炎剂制备为任何药物产品。药物产品的制备可涉及使用常见的赋形剂或稀释液，如填充剂、增量剂(extender)、粘结剂、崩解剂(disintegrant)、表面活性剂或润滑剂。赋形剂的实例包括蔗糖、乳糖、淀粉、结晶性纤维素、甘露糖醇、轻质无水硅酸、铝酸镁、合成硅酸铝、硅酸铝酸镁(magnesium metasilicate aluminate)、碳酸钙、碳酸氢钠、磷酸氢钙和羧甲基纤维素钙。这些赋形剂可单独或组合使用。

[0032] 尽管参考实施方案描述本发明，但该实施方案构成本公开的一部分且不应当解释为限制本发明。从本公开的各种可选实施方案、实施例和操作技术对于本领域技术人员是明显的。

[0033] 例如，提供抗炎剂的使用方法，其中将包含实施方案中描述的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物作为活性成分的抗炎剂适用于患有炎症的患者。用于该方法的乳凝集素和/或乳凝集素的分解物可由下述实施例中说明的原料分离或精制。抗炎剂还可用于非人类的哺乳类，包括如狗、猴子、猫、牛、马、猪、鸡和羊等家畜。

[0034] 实施例

[0035] 经由实施例和试验例详细描述本发明，实施例和试验例不应当解释为限制本发明。

[0036] 实施例1

[0037] 将丙酮(100kg)添加至冷冻干燥的未灭菌的酪乳粉末(10kg)，并用夸克分离器处理混合物以完全除去沉淀物。用蒸发器将丙酮从所得上层清液中除去，并将残渣溶解在去离子水中。随后，用具有60kDa截留分子量(cut-off molecular weight)的超滤膜处理溶液以回收滤液。然后用具有30kDa截留分子量的超滤膜处理滤液以除去杂质，接着脱盐和浓缩。其后，冷冻干燥所得产物，从而制备乳凝集素粉末(实施例样品1)(68g)。乳凝集素粉末具有78％乳凝集素含量。由此制备的乳凝集素可用作抗炎剂而无需任何处理。

[0038] 实施例2

[0039] 将实施例1中制备的乳凝集素粉末(500mg)溶解在精制水(100mL)中，并用碳酸氢钠将溶液的pH调整至8。其后，将胰蛋白酶(由Sigma制造)(即，蛋白酶)添加至溶液中使最终乳凝集素浓度为0.01％，用酶在37℃处理混合物一小时。然后在85℃加热处理混合物10分钟以使酶失活。冷冻干燥所得混合物，从而制备乳凝集素分解物粉末(实施例样品2)(463mg)。由此制备的乳凝集素分解物具有5kDa以下的分子量。乳凝集素分解物可用作抗炎剂而无需任何处理。

[0040] 实施例3

[0041] 将实施例1中制备的乳凝集素粉末(10g)溶解在精制水(200mL)中，然后将溶液保持在45℃。将蛋白酶A"Amano"SD(由Amano Enzyme Inc.制造)(2g)添加至溶液中，并用酶处理混合物两小时。然后在80℃加热处理混合物10分钟以使酶失活。冷冻干燥所得混合物，从而制备乳凝集素分解物粉末(实施例样品3)(8.2g)。由此制备的乳凝集素分解物具有5kDa以下的分子量。乳凝集素分解物可用作抗炎剂而无需任何处理。

[0042] [试验例1]

[0043] 评价实施例1中制备的乳凝集素或实施例2中制备的乳凝集素分解物对抑制为炎性细胞因子的IL-6和IL-8产生的效果。将具有小肠上皮细胞样特征的人结肠癌细胞株Caco-2接种至24-孔微量滴定板并在包含10％牛胎儿血清的杜伯克改进的伊格尔培养基(DMEM)中培养两周。将实施例1中制备的乳凝集素粉末(最终浓度：0.5、5、50或500μg/mL，按乳凝集素计)或实施例2中制备的乳凝集素分解物粉末(最终浓度：0.5、5、50或500μg/mL，按乳凝集素分解物计)添加至已培养Caco-2的微量滴定板，接着培养12小时。
将用做阳性对照的乳过氧化物酶(最终浓度：5、50或500μg/mL，按乳过氧化物酶计)添加至另一已培养Caco-2的微量滴定板，接着培养12小时。随后，将IL-1β(最终浓度：0.2ng/mL)添加至各微量滴定板，接着培养24小时。其后，回收培养上清液，并由ELISA测定上清液的IL-6浓度和IL-8浓度。表1和表2示出结果。

[0044] [表1]

[0045]

[0046] 数值：平均值±标准偏差(n＝8)。

[0047] *：显著低于添加相同浓度的乳过氧化物酶的情况(p<0.05)。

[0048] [表2]

[0049]

[0050] 数值：平均值±标准偏差(n＝8)。

[0051] *：显著低于添加相同浓度的乳过氧化物酶的情况(p<0.05)。

[0052] 参考表1和表2，乳凝集素或乳凝集素分解化合物(最终浓度：5μg/mL以上)的添加显著地减少培养上清液的IL-6浓度和IL-8浓度。该效果显著地高于由乳过氧化物酶的添加获得的效果。这些结果表明乳凝集素或乳凝集素的分解物显示出抗炎效果。

[0053] [试验例2]

[0054] 根据日本专利申请特开No.2007-112793中记载的方法使用角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀模型评价乳凝集素或乳凝集素的分解物的抗炎效果。具体地，将实施例1中制备的乳凝集素粉末或实施例3中制备的乳凝集素分解物粉末悬浮在0.5重量％的羧甲基纤维素水溶液中，并将悬浮液以5或50mg/kg体重的乳凝集素或乳凝集素分解物的剂量经口给药于威斯特雄性大鼠(体重：110至130g，每组10只大鼠)。与上述相同的方式，将乳过氧化物酶以50mg/kg体重的剂量经口给药(即，阳性对照)。一小时之后，将λ-角叉菜胶(即，炎性物质)在生理盐水中的1重量％悬浮液皮下注射(0.1mL)至开始肿胀的大鼠的右后肢足跖(right hindlimb footpad)。λ-角叉菜胶注射之前和注射五小时之后，测量右后肢足跖的面积，以确定足跖体积的增加率(V1)。对于阴性对照，将既不包含乳凝集素、乳凝集素的分解物也不包含乳过氧化物酶的0.5重量％的羧甲基纤维素水溶液经口给药于大鼠，将λ-角叉菜胶(即，炎性物质)在生理盐水中的1重量％悬浮液皮下注射(0.1mL)至大鼠的右后肢足跖，并确定大鼠的足跖体积的增加率(V0)。由下式计算角叉菜胶诱发肿胀的抑制率：{(V0-V1)/V0}×100。因此，肿胀抑制率越高，表明抗炎效果越高。表3示出结果。

[0055] [表3]

[0056]

[0057] 数值：平均值±标准偏差(n＝10)。

[0058] *：显著高于给药50mg乳过氧化物酶的情况(p<0.05)。

[0059] 参考表3，乳凝集素或乳凝集素的分解物以5mg/kg体重以上的剂量的经口给药增加角叉菜胶诱发肿胀的抑制率，其显著高于在经口给药乳过氧化物酶的情况下的抑制率。这些结果表明乳凝集素或乳凝集素的分解物显示出抗炎效果。

[0060] 实施例4

[0061] (抗炎用胶囊剂的制备)

[0062] 按如表4所示的比例混合原料，并由常规工艺造粒混合物然后胶囊化，从而制备抗炎用胶囊剂。

[0063] [表4]

[0064]

[0065] 实施例5

[0066] (抗炎用片剂的制备)

[0067] 按如表5所示的比例混合原料，并由常规工艺将混合物成形为坯块(compact)(1g)，接着制锭，从而制备抗炎用片剂。

[0068] [表5]