[0002] 本发明涉及来自革兰氏阴性细菌的囊泡。囊泡包含存在其腔中的异源蛋白。该囊泡特别有用于免疫原性组合物，例如疫苗。

[0003] 由于细胞被膜的膨压，革兰氏阴性菌可在其生长期间自发释放外膜囊泡(OMV)。可通过某些细菌组分的破坏来促进这类OMV的形成，例参考文献1和2中破坏了大肠杆菌Tol-Pal系统以得到在生长期间向培养基释放囊泡的菌株。也可通过破坏完整的细菌来产生OMV。已知的OMV生产方法包括使用去污剂处理(例如，用脱氧胆酸盐)[3和4]，无去污剂方法[5]或声处理[6]等的方法。

[0004] OMV在免疫原性细胞表面相关的、周质和分泌的抗原中富集，并且已经用作例如针对脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)血清组B的疫苗[7]。它们特别适于该用途，因为囊泡含有发挥佐剂作用的化合物，这引发针对该抗原的强免疫应答。从而对于免疫系统而言，囊泡是比纯化的抗原性蛋白质或其他细菌组分更为接近的天然细菌模拟物。OMV因此保持疫苗和其他免疫原性组合物的更具吸引力的靶标。已经提出，通过使用ClyA作为融合伙伴对OMV进行工程改造以在OMV表面上呈现多种抗原能够增加一些蛋白质抗原的免疫原性[8]。

[0005] 已经进行了多次尝试以使异源蛋白，尤其是异源抗原靶向OMV。然而，很大程度上因为与异源蛋白质向囊泡运输相关联的挑战，迄今为止，相对亲本细菌而言外来的抗原仍然在大部分OMV中显著缺失[11]。大多数使异源蛋白靶向OMV的尝试依赖于异源蛋白与整合膜蛋白的共价连接。这类共价连接的异源蛋白的示例包括FLAG表位与OmpA(外膜蛋白A)的全长序列的融合物、FLAG表位与PagP(PhoPQ-激活基因P)的全长序列的融合物[9]以及GFP与ClyA(溶细胞素)的融合物[10]。凭借它们与膜蛋白的共价连接，所得的融合蛋白靶向外膜并且因此包含于OMV中。这些方法具有缺陷，尤其是由于难以在不对转化的细菌造成有害影响的情况下过表达大量的整合膜蛋白。

[0006] 还已证明，难以使周质蛋白靶向OMV。GFP与Tat(双精氨酸转运体)信号序列的融合导致靶向周质的GFP的过表达，但是GFP荧光几乎没有超过OMV中的背景荧光水平[11]，表明GFP没有进入OMV中或者由于错误折叠而在OMV中没有功能。

[0007] 仍然存在对开发适于在OMV中表达异源蛋白的方法，尤其是在OMV中表达抗原性蛋白质的方法的需求。也仍然存在对替代或改良的OMV(尤其用于疫苗)的需求。

[0229] 实施例1-异源蛋白表达进入大肠杆菌OMV

[0230] 大肠杆菌BL21(DE3)ΔtolR和ΔompA ko突变体的产生

[0231] 通过使用高度精通的同源重组系统(红色操纵子(red operon))[122]来产生易于重组的BL21(DE3)细胞。简而言之，用5μg的pAJD434质粒通过电穿孔(2.5kV下5.9ms)来转化电感受态细菌细胞。然后使细菌在37℃下在1ml的SOC肉汤中生长1小时，然后接种在含甲氧苄啶(100μg/ml)的LB培养基上。通过向培养基中加入0.2％的L-阿拉伯糖来诱导由pAJD434携带的红色基因的表达。

[0232] 通过分别用卡那霉素(kmr)和氯霉素(cmr)抗性盒取代ompA和tolR编码序列来产生已知自发产生大量的OMV的ΔtolR和ΔompA大肠杆菌BL21突变株。使用三步PCR
方案来分别将ompA和tolR的上游和下游区域与kmr和cmr基因融合。简而言之，分别使
用特定引物对tolR-1/tolR-2和tolR-3/tolR-4；ompA-1/ompA-2和ompA-3/ompA-4(表1)从BL21(DE3)基因组DNA扩增tolR和ompA基因的上游和下游区域。使用引物PUC4K-rev
和PUC4K-for从质粒pUC4K中扩增kmr盒并且使用引物CMR-for/CMR-rev扩增cmr。最后，
100ng的三种经扩增的片段中的每一种通过在含1/4引物的PCR中混合而融合在一起。

[0233] 采用其中抗生素抗性基因侧接tolR/ompA的上游和下游区域的线性片段来转化易于重组的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，其通过在冷水中洗涤3次制成电感受态。转化通过在2.5kV下5.9ms的电穿孔进行。通过将细胞接种在含30μg/ml卡那霉素或20μg/ml氯霉
素的LB平板上来筛选转化子。通过使用引物对tolR-1/PUC4K-rev和PUC4K-for/tolR-4；
ompA-1/CMR-rev和CMR-for/ompA-4的基因组DNA的PCR-扩增来确认tolR和ompA基因的
删除。

[0234] 表1

[0235] 寡核苷酸引物：

[0236]名称 序列 SEQ ID NO
GAS25-F ACCGTAGCGCAGGCCAACAAACAAAACACTGCTAG 4
GAS25-R GTGATGGTGATGTTACTACTTATAAGTAATCGAACC 5
SpyCEP-F3 ACCGTAGCGCAGGCCGCAGCAGATGAGCTAAGCAC 6
SpyCEP-R3 GTGATGGTGATGTTATTAGGCTTTTGCTGTTGCTGA 7
Bla-omp-F ACCGTAGCGCAGGCCCGGTAAGATCCTTGAGATTTT 8
Bla-omp-R GTGATGGTGATGTTATTACCAATGCTTAATCAGTGA 9
fHbp-F ACCGTAGCGCAGGCCGTCGCCGCCGACATCG 10
fHbp-R GTGATGGTGATGTTATTATTGCTTGGCGGCAAGGC 11
omprev GGCCTGCGCTACGGTAGCGAAA 12
nohisflag TAACATCACCATCACCATCACGATTACAAAGA 13
tolR-l TCTGGAATCGAACTCTCTCG 14
tolR-2 ATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCATGGCTTACCCC 15
tolR-3 TTCACGAGGCAGACCTCATAAACATCTGCGTTTCCC 16
tolR-4 TTGCTTCTGCTTTAACTCGG 17
ompA-1 GATCGGTTGGTTGGCAGAT 18
ompA-2 CACCAGGATTTATTTATTCTGCGTTTTTGCGCCTCG 19
ompA-3 TACTGCGATGAGTGGCAGGCGCAGGCTTAAGTTCT 20
ompA-4 AAAATCTTGAAAGCGGTTGG 21
PUC4K-rev AAAGCCACGTTGTGTCTC 22
PUC4K-for TGAGGTCTGCCTCGTGAA 23
CMR-for CGCAGAATAAATAAATCCTGGTG 24
CMR-rev CCTGCCACTCATCGCAGTA 25
Spy0269-F ACCGTAGCGCAGGCCGATGATAGAGCCTCAGGAGA 26
Spy0269-R GTGATGGTGATGTTATCACTTAGATTCCTTACGGAA 27
Spy0269-fus GATTACTTATAAGTAGAGAAGGAGATATACATATG 28
Slo-fus-F AACAAACAAAACACTGCTAGTACAG 29
Slo-fus-R3 TATACTCCTTCTCTACTTATAAGTAATCGAACCATA 30
Spy0269-fus TCACTTAGATTCCTTACGGAACC 31

[0237]Spycep-fus- AAGGAATCTAAGTGAGAAGGAGATATACATATGAA 32

[0238] 实施例2-质粒构建

[0239] 选择来自革兰氏阳性和革兰氏阴性的不同细菌物种并且属于不同细胞区室的5种异源蛋白作为模型蛋白以确定异源蛋白是否能够以其天然构型进入大肠杆菌OMV。这些蛋白质包括：(1)来自大肠杆菌的周质TEM1β-内酰胺酶(Bla)、(2)来自脑膜炎奈瑟氏球菌的H因子结合蛋白(fHbp)脂蛋白、(3)来自酿脓链球菌的胞外胆固醇依赖性链球菌溶血素O(Slo，也称为GAS25)、(4)来自酿脓链球菌的细胞被膜丝氨酸蛋白酶SpyCep(也称为GAS57)和(5)来自酿脓链球菌的假定表面排斥蛋白Spy0269(也称为GAS40)。使用聚
合酶不完全引物延伸(PIPE)克隆方法[123]将这5种蛋白质各自的核酸编码序列克隆到
pET-OmpA质粒中。pET-OmpA质粒(也在例如[124]和[125]中提供)是pET21b-衍生的
质粒。

[0240] 简而言之，使用GAS25-F/GAS25-R引物(参见表1)从含有slo-dm基因的pET21-Slo-dm质粒中PCR-扩增Slo-dm(slo双突变体，SEQ ID：42)。使用SpyCEP-F3/
SpyCEP-R3引物从M1GAS菌株ISS3348中PCR-扩增SpyCEP基因(也以SEQ ID：40提
供的双突变体序列)，该引物设计为排除C-末端LPXTG基序细胞壁锚定物(位于氨基
酸1614-1647)。使用spy0269-F/spy0269-R引物从M1GAS菌株ISS3348中PCR扩增
spy0269(SEQ ID：44)基因。用于fHbp基因扩增的引物设计排除脂盒(其位于fHbp的氨基酸17-25处)以避免膜锚定。为了使蛋白质靶向周质，去除分别编码这些蛋白质的信号序列的序列并用大肠杆菌OmpA信号序列(SS)取而代之(参见图1)。分别使用引物Bla-omp-F/Bla-omp-R和fHbp-F/fHbp-R分别从pET21b和脑膜炎奈瑟氏球菌MC58基因组中扩增Bla和fHbp。使用引物omprev/nohisflag通过PCR扩增pET-OmpA质粒。通过这种方式产生质粒pET-21_Bla(SEQ ID：37)、pET-21_slo(SEQ ID：33)、pET-21_SpyCEP(SEQ ID：34)、pET-21_fHbp(SEQ ID：36)和pET21_spy0269(SEQ ID：35)。

[0241] 实施例3-异源蛋白表达进入ΔtolR和ΔompA突变体、OMV和总裂解物制备物

[0242] 为了研究Bla、slo、SpyCEP、fHbp和Spy0269蛋白是否包装到OMV中，用pET-21_Bla、pET-21_slo、pET-21_SpyCEP、pET-21_fHbp质粒和pET21_spy0269转化ΔtolR和ΔompA大肠杆菌BL21菌株。作为阴性对照，用pET-OmpA空载体来转化ΔtolR和ΔompA
大肠杆菌BL21菌株。

[0243] 使所有的菌株在液体培养基中生长至对数期并且通过加入1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)来进行基因的诱导表达。图2显示了用1mM IPTG诱导之前
和之后这些培养基的总裂解物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在所有经诱导的样品中存在对应于Bla、slo、SpyCEP、fHbp和Spy0269蛋白的条带并且由箭头指出。因此，在大肠杆菌中成功地诱导了所有5种测试的异源蛋白。

[0244] 使用各转化子的过夜培养物，200ml的LB培养基在OD600＝0.05下孵育。培养物生长直至OD600＝0.5并且然后通过加入1mM IPTG来诱导重组蛋白的表达，之后另孵育2小时。对于OMV制备物，通过在8,000x g下离心20分钟来收获细胞。所得的上清经过滤通过0.22μm孔径的过滤器(密理博(Millipore))。然后滤液经过高速离心(200,000x g持续
2小时)并且在含蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))的PBS中重悬含OMV的团块。对于小鼠免
疫，当显示时，OMV在低渗缓冲液(10mM Tris pH 7.5，1.5mM MgCl2，10mM KCl)中超声处理(每30秒中10次脉冲)，之后在冰上冷却。从1ml的培养物中制备总裂解物，其在13,000x g下离心5分钟。团块在SDS-PAGE上样缓冲液中重悬，在100℃下加热5分钟并且加载在
4-12％聚丙烯酰胺胶(英杰公司(Invitrogen))上。胶在MES缓冲液(英杰公司)中跑动
并且用考马斯亮蓝染色。图3显示了从ΔtolR和ΔompA菌株中得到的约30μg OMV的聚
丙烯酰胺凝胶，该菌株含有表达不同异源蛋白的质粒。箭头指出了对应于SpyCEP、Slo、Bla和fHbp的重量的条带。为了鉴定蛋白质，将条带切下并用胰蛋白酶消化，并且然后通过基体辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析所得的蛋白质水解肽。

[0245] 简而言之，从凝胶中切下蛋白质条带，用50mM的碳酸氢铵-乙腈(50/50，体积/体积)洗涤，并用空气干燥。在37℃下在12μl的5mM碳酸氢铵中的0.012-μg/μl测序级修饰的胰蛋白酶(测序级修饰的胰蛋白酶；威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega))中消化经干燥的斑点2小时。在消化后，在矩阵-预点样的(matrix-prespotted)锚芯片(Anchorchip)(PAC 384HCCA；德国不莱梅的Bruker-Daltonics公司)上加载0.6μl的经消化的产物并经空气干燥。用0.6μl的含70％乙醇和0.1％三氟乙酸的溶液洗涤斑点。
用ultraflex MALDI-TOF质谱仪(Bruker-Daltonics公司)得到质谱。通过使用PAC芯片
(Bruker-Daltonics公司)上存在的标准品的组合来对图谱进行外部校准。使用MASCOT软件(英国伦敦的矩阵科学公司(Matrix Sciences))的许可版本自动进行单一同位素的肽匹配和蛋白质检索。使用的MASCOT检索参数如下：(i)允许的错误切割数量＝1；(ii)可变翻译后修饰＝甲硫氨酸氧化；和(iii)肽容限＝100ppm。只考虑由MASCOT可能性分析定义的显著命中。MASCOT软件分别鉴定了对应于Bla、Slo、SpyCEP和fHbp蛋白的条带。这些结果证明Bla、Slo、SpyCEP和fHbp都能被表达并进入由ΔtolR和ΔompA大肠杆菌菌株产生的OMV中。

[0246] 实施例4-进入OMV的异源蛋白的定量

[0247] 为了对进入大肠杆菌OMV的异源蛋白的量进行定量，进行了Western印迹分析。

[0248] 30μg的含异源蛋白的OMV与递增浓度(20-80ng)的对应的纯化的蛋白质一起加载到4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。也加载的空OMV作为阴性对照。然后通过标准方法[126]将聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素滤纸上。通过在4℃下在封闭液(PBS中10％脱脂牛奶和0.05％吐温)中过夜搅拌封闭滤纸，之后在37℃下与在含3％脱脂牛奶和0.05％吐温的PBS中以1∶1000稀释的需要的抗体血清(抗-Bla(阿柏堪穆公司(Abcam))、抗-slo、抗-SpyCEP和抗-fHbp)孵育90分钟。在PBS-吐温中进行三次洗涤步骤之后，滤纸与在含3％脱脂牛奶和0.05％吐温的PBS中以1∶2000稀释的过氧化氢酶偶联的抗小鼠免疫球蛋白(Dako公司)孵育1小时，并且进行三次洗涤步骤之后，通过使用SuperSignal West Pico化学发光底物(皮尔斯公司(Pierce))来检测所得的信号。

[0249] 图4和图5显示了来自进行的4个不同的Western印迹的结果。如从MALDI-TOF中所期望，所有的OMV制剂含有所选的异源蛋白。比较化学发光信号与来自已知量的纯化蛋白的那些化学发光信号，证明30μg的OMV含有大约240ng的Slo、SpyCEP和Bla。

[0250] 实施例5-异源蛋白位于OMV周质中

[0251] 如上所述，所有4种异源蛋白的信号序列被大肠杆菌OmpA信号序列取代以使蛋白质靶向大肠杆菌周质。因此，重要的是证明蛋白质被表达为OMV的腔内组分而不是与OMV的胞外表面结合。

[0252] 为了对此进行测试，向表达Slo-dm或SpyCEP的完整和溶解的(在1％SDS中)15μg OMV中加入100μg/ml蛋白酶K(Fermentas公司)，然后将混合物在37℃下孵育
10分钟。在用10mM苯甲基磺酰氟(PMSF；西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))使蛋白酶K失活之后，将样品加载到4-12％聚丙烯酰胺凝胶上并用所需的抗体进行Western印迹分析来检测异源蛋白的存在。

[0253] 图6和图7显示了在未溶解的OMV(但不在溶解的OMV)中Slo-dm、SpyCEP和Bla全部受到保护而免受蛋白酶K-介导的降解，这证明了它们在大肠杆菌OMV的腔中都表达成周质蛋白。

[0254] 实施例6-含SpyCEP的OMV能够水解IL-8

[0255] 已经报道SpyCEP水解IL-8，将其转化成6-kDa的无活性片段[127]。为了确定SpyCEP是否在OMV制剂中保留其水解活性，使表达SpyCEP的OMV在37℃下在不同浓度下
与人IL-8(50μg/ml)孵育2小时。使用SpyCEP野生型蛋白(在10μg/ml的浓度下)作
为阳性对照。IL-8与作为阳性对照的10ng/ml GAS57纯化的质蛋白(其已知水解IL-8)孵育。使用18％SDS-PAGE和银染分析水解产物。为了测试SpyCEP蛋白的活性形式是否位
于OMV中，通过在室温下将OMV在0.5％曲通X-100中通透20分钟来诱导从OMV腔中泄漏
SpyCEP(参见图8)。进行使用1％曲通X-100对OMV通透的另一个实验(参见图8B)。

[0256] 如图8A和8B所示，在与30μg含SpyCEP的OMV孵育2小时后，IL-8几乎被完全切割。因此，在OMV中保留了SpyCEP的生物活性。功能活性的保留表明异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的结构表位。
IL-8水解活性在经通透的OMV中增加，表明SpyCEp的活性形式位于OMV内。功能活性的保留表明异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的抗原。

[0257] 实施例7-含Bla和Slo的OMV

[0258] 表达Bla的OMV与发色底物头孢硝噻吩孵育并且如本文所述测量Bla活性。在37℃下，使OMV制备物与头孢硝噻吩(0.5mg/ml；Oxoid，英国剑桥的热科学公司)避光孵育
30分钟。用Tecan分光光度计在OD485下立即测定发色团水解和上清液的后续颜色变化。
使用标准曲线来估计酶活性，其中OD485与水解的头孢硝噻吩的量相关。使用重组β-内酰胺酶(VWR)来对此进行定量。

[0259] 图9A显示空OMV没有显示出Bla活性，而在含Bla的OMV中显示出Bla活性。因此，在OMV中保留了Bla的生物活性。

[0260] 为了测试Bla的活性形式是否位于OMV中，通过在室温下使OMV在1％曲通X-100中通透20分钟来诱导从OMV腔中泄漏Bla。如图9A所示，Bla活性在经通透的OMV中增加，表明Bla的活性形式位于OMV内。

[0261] 通过使用以下的方法将表达野生型(wt)形式的毒素的OMV与绵羊血红细胞孵育来测试Slo溶血活性。采用PBS+0.5％BSA作为稀释缓冲剂在具有U型底部的96孔板中制备样品的连续稀释物。用PBS将1ml绵羊血液洗涤三次(在3000x g下离心)，最后将血细胞悬浮在5ml PBS中。向50μl的各稀释样品中加入50μl的这种悬浮液并且在37℃下孵育30分钟。用水产生100％溶血作用，并且将PBS+BSA 0.5％用作阴性对照。然后将孔板在1000x g下离心5分钟，并且小心将上清液转移到96孔平底板中以在540nm下读取吸光度[128]。

[0262] 如图9B所示，阴性对照空OMV显示没有溶血活性，而含Slo-wt的OMV显示出高水平的溶血活性，这依赖于存在的OMV的量。因此，在OMV中保留了Slo的生物活性。Slo和Bla的功能活性的保留表明这些异源蛋白在OMV中正确折叠并且因此会展示出与其天然环境中的野生型蛋白质相同或基本相同的抗原。

[0263] 实施例8-用工程改造的OMV中的Slo和SpyCEP免疫的小鼠中引发的抗体效价

[0264] 为了检测大肠杆菌OMV中的Slo和SpyCEP的免疫原性，在第0、21和35天用25μg经超声或未经超声处理的过表达Slo或SpyCEP蛋白的OMV腹膜内免疫一组8只CD15-周龄的雌性小鼠。所有的样品都用2mg/ml氢氧化铝作为佐剂配制。用PBS和佐剂来免疫对照小鼠。由用20μg重组的纯化的Slo或SpyCEP蛋白免疫的小鼠组成阳性对照组。为了
测试OMV佐剂特性，也用25μg空OMV或25μg空OMV加20μg的Slo或SpyCEP抗原来免
疫小鼠。

[0265] 在第一次免疫之前(免疫前血清)并且在3次免疫中的每次之后(1次后、2次后和3次后)收集血清，并且分析ELISA效价。使用分别由PBS中的3μg/ml或2μg/ml的Slo或SpyCEP包被的96-孔Maxisorp板(Nunc，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Scientific))来进行ELISA。在室温下孵育板2小时，然后用TPBS(PBS中0.05％吐温20，pH 7.4)洗涤
3次并用250μl/孔的2％BSA(西格玛奥德里奇公司)在室温下封闭1小时。各孵育步骤
之后是3次TPBS洗涤。血清样品初始以1∶500-1∶1000在含2％BSA的PBS中稀释，转
移到包被-封闭的板上(200μL)并连续稀释(2倍稀释)，之后在37℃下孵育2小时。然
后，以100μl/孔添加1∶2000稀释的碱性磷酸酶-偶联的山羊抗小鼠IgG并在30℃下放
置2小时。通过以100μL/孔添加含3mg/mL对硝苯基磷酸二钠盐六水合物(西格玛奥德
里奇公司)的1M二乙醇胺缓冲剂(pH 9.8)来观察结合的碱性磷酸酶。在室温下显色10
分钟后，在微孔板分光光度计中于405nm处分析平板。通过在参考校准曲线上内插OD来计算抗体效价，并且表示为每mL的ELISA单位(EU)。

[0266] 图10显示了在第三次免疫(第49天)后从各免疫组的8只小鼠得到的ELISA效价的几何平均数。来自单独用PBS和佐剂或用空OMV免疫的小鼠的血清给出阴性结果。如图10所示，针对全部5种制剂的抗体效价在统计学上相当，表明工程改造的OMV制剂能够诱导针对Slo和SpyCEP抗原的抗体。

[0267] 实施例9-OMV-SpyCEP免疫血清抑制SpyCEP介导的的IL8加工

[0268] 测试了从单独用PBS、空OMV、OMV-SpyCEP和OMV+SpyCEP免疫的小鼠得到的血清的中和SpyCEP的IL-8蛋白质水解活性的能力。为了进行该IL-8抑制测试，在37℃下，SpyCEP(0.1μg/ml)和IL-8(1μg/ml)与5种不同稀释度(1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20
和1∶40)下的来自8只免疫小鼠的小鼠多克隆血清的收集池在PBS，0.5mg/ml BSA中孵
育2小时。作为对照，SpyCEP仅与缓冲剂孵育，并且使用不含SpyCEP的血清。在2小时后通过ELISA(人IL-8免疫试验试剂盒，英杰公司(Invitrogen))对未切割的IL-8的量进行定量并且表示为反应(与SpyCEP孵育)中未切割的IL-8与对照反应(仅与缓冲剂孵育)
中的IL-8相比的百分比。

[0269] 图11、12A和12B显示了在100ng的重组SpyCEP和不同稀释度的三次(3次后)和两次(2次后)免疫后收集的免疫血清存在下由ELISA试验测定的未切割的IL-8的百分
比。

[0270] 来自作为阳性对照的用重组SpyCEP免疫以及用工程改造的含SpyCEP的OMV(OMV-SpyCEP)免疫的小鼠的血清能够以剂量依赖的方式中和SpyCEP蛋白水解活性并且给出统计学上相当的结果。

[0271] 实施例10-OMV-Slo免疫血清抑制Slo介导的溶血

[0272] 测试了从单独用PBS、空OMV、OMV-Slo、20μg Slo和0.5μg Slo(对应于20μg OMV中所含Slo的量)免疫的小鼠得到的血清的中和Slo的溶血活性的能力。为了进行该测试，在室温下将Slo(60ng)与来自每组8只免疫小鼠的收集的多克隆血清在6个不同的稀释度(1∶31.25；1∶63；1∶125；1∶250；1∶500和1∶1000)下在PBS，0.5mg/ml
BSA中孵育20分钟。在PBS中将1ml绵羊血液洗涤3次(在3000x g下离心)，最后将血
细胞悬浮在5ml PBS中。向各样品中加入50μl的这种悬浮液并且在37℃下孵育30分钟。
使用60ng Slo作为阳性对照以得到100％溶血，并且使用PBS+0.5％BSA作为阴性对照。然后将板在1000x g下离心5分钟，并且小心将上清液转移到96孔平底板中并读取540nm处的吸光度[128]。

[0273] 图13显示了由在不同血清稀释度下的各样品提供的溶血百分比。来自作为阳性对照的用重组Slo免疫以及用工程改造的含Slo的OMV(OMV-Slo)免疫的小鼠的血清能够以剂量依赖的方式中和Slo的溶血活性并且给出统计学上相当的结果。

[0274] 实施例11-在其腔中携带外来抗原的OMV引发强保护性应答

[0275] 已经证明即使在OMV的腔中存在重组抗原，用这类OMV免疫诱导抗原特异性功能抗体，我们继续研究该免疫是否也能够诱导抗原特异性保护免疫。为了对此进行测试，在第0、21和35天用包含携带Slo或SpyCEP的25μg的OMV的配制有氢氧化铝的疫苗制剂腹
膜内免疫雌性CD15-周龄小鼠。作为阳性对照，也用在即将吸收至氢氧化铝之前超声处理的携带Slo和SpyCEP的25μg OMV，以及重组Slo、重组SpyCEP和来自M1菌株的重组M蛋
白(各20μg)免疫小鼠，其全部配制有氢氧化铝。在第三次免疫后3周，用200μl的含约
2.5E+06CFU的M13348菌株的细菌悬浮液腹膜内感染小鼠。在处理后每天监测小鼠持续6天并且当它们显示出无痛处死终点时处死它们，该无痛处死终点已经对于符合诺华动物福利政策的研究预先建立。

[0276] 如报道了来自每组使用8只小鼠的实验的数据图14所示，如果未经超声，携带Slo和SpyCEP的OMV分别给出了87.5％和75％的保护，与如果在吸收至铝盐之前超声处理OMV并免疫所得到的87.5％和100％的保护值相当。这种保护也与用吸收至铝盐的重组Slo和SpyCEP得到的保护值(分别是81.3％和87.5％)相似，考虑到携带约0.2-0.4μg的Slo和SpyCEP的重组OMV大约是用重组Slo和SpyCEP免疫所用的量的1/100，这是一个显著的结果。

[0277] 实施例12-在OMV腔中用于表达Spy0269和Slo-dm的双顺反子构建体和用于表达Spy0269、Slo和SpyCEP的三顺反子构建体的产生

[0278] 为了产生双顺反子构建体，分别使用slo-fus-F/slo-fus-R3和Spy0269-fus3/Spy0269-R引物从pET-21_slo和pET-21_spy0269中扩增slo-dm和spy0269基因。产生的片段经磷酸化、连接并且克隆(使用PIPE克隆方法[123])到pET-OmpA质粒中产生
pET-slo+spy0269质粒(SEQ ID：38)(图15A)。

[0279] 将Slo-dm和Spy0269蛋白克隆到pET-OmpA质粒中的相同的T7启动子下以产生双顺反子构建体。OmpA前导序列被克隆到各基因的上游，从而其表达能够导向随后产生的OMV的腔(参见下文)。

[0280] 为 了 产 生 三 顺 反 子 构 建 体，用nohisflag/Spy0269-fus-R引 物 扩 增pET-spy0269+slo质粒，用spycep-fus-F/spycep-R3引物从pET-21_spycep质粒上扩增spycep基因并使用PIPE克隆方法克隆到质粒中。产生的片段经磷酸化、连接并且克隆(使用PIPE克隆方法[123])到pET-OmpA质粒中产生pET-slo+spy0269+spycep质粒(图15B)。

[0281] 所得的质粒被转化到ΔompA和野生型大肠杆菌BL21突变株用于蛋白质诱导和OMV制备。通过向培养基中加入1mM IPTG来诱导克隆的基因的表达。对总裂解物进行
Western印迹来验证蛋白质表达。图16A组图I和组图II显示在用IPTG诱导之后从双顺
反子和三顺反子构建体表达的全部克隆的蛋白质。

[0282] 如上所述，从含双顺反子的ΔompA和野生型菌株中制备OMV。图16B的Western印迹的结果显示了Slo和Spy0269蛋白都表达并存在于OMV中。

[0283] SEQ ID：43至69中提供了spy0269(GAS40)的变体序列。SEQ ID：71至75提供了spyCEP(GAS57)的变体序列并且SEQ ID：39和40提供了脱毒或酶失活的突变体
(GAS57D151A-S617A)。SEQ ID：41和42提供了slo(GAS25)W535F-P427L双突变体。

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