技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物低磷应答调控单元及表达载体构建技术，属生物技术领域。
相关背景技术
[0002] 磷元素是植物生长发育不可或缺的营养元素之一，它不仅是生物体内ATP、核酸、磷脂分子的组成成分，而且在能量转换和新陈代谢调节等方面发挥着十分关键的作用。但- 2-是，磷主要以H2PO4 和HPO4 可溶的形式被植物吸收，这部分磷元素被称为“有效磷”。在土
2+ 2+ 3+
壤中，虽然磷元素含量较高，但大部分磷元素被Ca 、Fe 、Al 固定或以有机态磷形式存在，无法被植物直接吸收利用，从而造成土壤速效磷匮乏(Smith F W，Mudge S R，Rae A L，et al.Phosphate transport in plants.Plant and Soil，2003，248(1-2)：71-83)。
[0003] PHR1是一类保守的MYB类转录因子，可以结合到一些磷饥饿应答基因(如AtIPS1，AtRNS1)的启动子上促进这些基因的表达，在植物低磷适应调节中发挥中心作用。Franco-Zorrilla等研究发现，在拟南芥中，PHR1可以通过与磷转运蛋白Pht1家族基因启动子上的PIBS相互作用，调节其表达，进而调节植物对磷的吸收和转运能力。Schunmann等分析了大麦磷转运蛋白Pht1-1启动子序列，发现其中的PIBS序列发生突变后，低磷胁迫对Pht1-1的诱导作用明显减弱，这表明PHR1在Pht1-1的诱导表达中起着重要的作用。
Bari等发现在拟南芥phr1突变体中，miRNA399的表达在低磷环境下受到明显的抑制，揭示了PHR1、miRNA399和PHO2/UBC之间存在着相互关系。综上所述，PHR1可以通过直接或间接的作用调控一些磷转运蛋白和磷饥饿应答基因的表达，以促进植物对磷的吸收利用(Schunmann P H D，Richardson A E，Vickers C E，et al.Promoter analysis of the barley Pht1；1phosphate transporter gene identifies regions controlling root expression and responsiveness to phosphate deprivation.Plant Physiology，2004，
136(4)：4205-4214；Bari R，Pant B D，Stitt M，et al.PHO2，microRNA399，and PHR1define a phosphate-signaling pathway in plants.Plant Physiology，2006，141(3)：988-999)。
[0004] 近年来的研究表明，SIZ1对植物的低磷适应也具有重要的调节作用。在磷饥饿的情况下，SIZ1可以使PHR1SUMO化来提高PHR1的活性，更进一步提高植物对磷的利用效率。研究发现，PHR1有两个类泛素化修饰位点，有研究者在体外将T7-PHR1与酵母的ScAos1(E1)、ScUb2(E1)、ScUbc9(E2)、ScSmt(SUMO)和拟南芥的SIZ1(E3)组成的混合物进行反应，然后利用抗T7的抗体检测到PHR1被SUMO化修饰，但类泛素化位点突变的PHR1被检测到无SUMO化修饰，表明PHR1可以直接被SIZI识别和修饰，在植物的磷调控网络中，SIZ1位于PHR1的上游，通过调节PHR1的活性来调节下游与磷饥饿应答有关的基因的表达。Duan等研究证明，在拟南芥siz1突变体中，PHR1的下游基因SPX1、SPX2的表达都明显下降(Duan K，Yi K K，Dang L，et al.Characterization of a sub-family of Arabidopsis genes with the SPX domain reveals their diverse functions in plant tolerance to phosphorus starvation.Plant Joumal，2008，54(6)：965-975)。
[0005] 鉴于SIZ1和PHR1对植物低磷应答的调节作用以及它们之间的相互作用，本发明通过将PHR1基因和SIZ1基因串联构建成一个独立的调控单元插入表达载体中并转化植物，实现其在植物体内的表达，提高植物体内PHR1的含量并通过SIZ1提高PHR1的活性，从而提高植物对磷的利用效率。经文献检索，目前尚未发现将PHR1基因和SIZ1基因作为独立调控单元构建于同一载体转化植物以提高植物磷吸收利用效率的文献和专利报道。
具体实施方式
[0032] 实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆手册中所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。
[0033] 实施例1
[0034] 拟南芥SIZ1基因的克隆。包括如下步骤：
[0035] (1)用TRIZOL试剂法提取拟南芥总RNA，反转录得到其cDNA。
[0036] (2)以cDNA为模板PCR克隆得到SIZ1基因(图2)，将其克隆到pMD19-T simple vector，构建载体pMD19-T-SIZ1进行测序，测序正确。PCR所用引物是根据拟南芥AtSIZ1基因序列设计的：
[0037] P1：5′-GAATTCATGGATTTGGAAGCTAATTGTAAGGAAAAAC-3′
[0038] P2：5′-ACTAGTCAAATCTTGTTTAAACTCCGGTGTCT-3′
[0039] 上游引物P1添加EcoR I酶切位点，下游引物P2添加Spe I酶切位点，均用下划线表示。
[0040] 实施例2
[0041] 一种低磷应答调控单元表达植物载体的构建。包括如下步骤：
[0042] (1)pMD19-T-35S载体的构建。
[0043] 将35S启动子(图3)克隆到pMD19-T simple vector中，构建载体pMD19-T-35S。所用的PCR引物是根据35S启动子的DNA序列设计的：
[0044] P3：5′-GAATTCACTAGTCCCACAGATGGTTAG-3′
[0045] P4：5′-GAATTCCGTGTTCTCTCCAAATGAAAT-3′
[0046] 上游引物P3添加EcoR I和Spe I酶切位点，下游引物P4添加EcoR I酶切位点，均用下划线表示。
[0047] (2)pMD19-T-35S-SIZ1载体的构建。
[0048] 以pMD19-T-SIZ1为基本载体，将35S启动子从载体pMD19-T-35S中用EcoR I单酶切后回收，插入载体pMD19-T-SIZ1中，进行PCR和酶切鉴定(图4)及其插入正反向的鉴定(图5)，构建载体pMD19-T-35S-SIZ1。
[0049] (3)pX6-35S-SIZ1载体的构建。
[0050] 用Spe I单酶切载体pMD19-T-35S-SIZ1得到35S-SIZ1片段，将35S-SIZ1片段插入植物表达载体pX6中，进行PCR鉴定(图6)及其插入正反向的鉴定(图7)，构建植物表达载体pX6-35S-SIZ1。
[0051] (4)pX6-PHR1-35S-SIZ1载体的构建。
[0052] 用Asc I单酶切得到PHR1基因，将PHR1基因插入植物表达载体pX6-35S-SIZ1中，进行PCR和酶切鉴定(图8)及其插入正反向的鉴定(图9)，构建植物表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1。即为本发明所述的低磷应答调控单元表达载体。
[0053] 将上述表达载体pX6-PHR1-35S-SIZ1转化农杆菌GV3101，构建同时含有SIZ1基因和PHR1基因的工程菌株NK-314。从工程农杆菌中提取质粒进行PCR鉴定(图10)。
