[0003] 本发明主题的领域至少包括分子生物学、细胞生物学、生物化学、遗传学和医学。在具体的方面，本发明主题的领域包括学习和记忆、长时程增强、神经网络、γ-氨基丁酸能抑制和/或网状构造同步性过强。

[0004] 发明背景

[0005] 双链(ds)RNA-活化的蛋白激酶(PKR)广泛存在于脊椎动物中且其活化导致几种底物磷酸化，主要已知的胞质靶标是翻译起始因子eIF2α(Dever等人,2007)。尽管PKR作为对各种细胞应激的响应被活化，所述细胞应激例如病毒感染(Garcia等人,2007)、癫痫持续状态(Carnevalli等人,2006)和几种神经病理学情况包括阿尔茨海黙病(Couturier等人,2010；Morel等人,2009；Peel和Bredesen,2003)、帕金森病(Bando等人,2005)、亨廷顿病(Bando等人,2005；Peel等人,2001)和Creutzfeldt-Jakob病(Paquet等人,2009)中的变性神经元，但是几乎不了解其在正常神经元功能中的作用。

[0006] 脑认知功能基于广泛分布于脑中的大量神经元的协调相互作用。现代神经科学的基础性的尚未解决的问题在于如何实现这种细微的协调活性。尽管可以通过网状构造同步性过强可以通过过度兴奋性震荡网状构造驱动(Huguenard和McCormick,2007；McCormick和Contreras,2001；Steriade,2005)，但是已经提出神经元放电的暂时同步化涉及记忆巩固作用(Beenhakker和Huguenard,2009；Buzsaki,2006；Girardeau等人,2009；Paulsen和Moser,1998)。认为γ-氨基丁酸能突触传递在维持这种平衡中起中枢作用：γ-氨基丁酸能抑制性神经元不仅抑制主细胞活性，而且用作海马网状构造中震荡的发生器(Freund,2003；Klausberger和Somogyi,2008；Mann和Mody,2010；Sohal等人,2009)，这在涉及记忆巩固方面显然是决定性的(Beenhakker和Huguenard,2009；Buzsaki,2006；Girardeau等人,2009；Paulsen和Moser,1998)。此外，γ-氨基丁酸能抑制还促成了这些节律事件终止，由此在癫痫网状构造活度过程中防止失控的兴奋。然而，对有关基于记忆形成过程中的神经元同步的分子机制几乎不了解。

[0007] 发明简述

[0008] 在本发明的实施方案中，本发明涉及导致脑节律性增加和认知增强的双链RNA活化蛋白激酶(PKR)的抑制。

[0009] 本发明的实施方案提供了同步性过强的网状构造活性和记忆增强的第一种单一基因模型–迄今为止未研究的脑激酶PKR中的缺陷。实施方案还包括小分子抑制剂(PKRi)，其选择性地抑制PKR活性，复制(拟表型)Pkr-/-表型，特异性地增强突触联系的强度(L-LTP)和长时记忆和增加网状构造节律性。在本发明的一些方面，PKR通过选择性控制γ-氨基丁酸能突触传递调节这些过程，由此暴露一种调节脑节律性、突触可塑性和记忆储存的新信号传导途经。

[0010] 在本发明的一个实施方案中，提供了增强个体中的认知的方法，其包括对该个体提供治疗有效量的双链RNA-蛋白依赖性激酶抑制剂的步骤。在一些情况中，所述抑制剂包括蛋白质、核酸或小分子。

[0011] 在本发明的一些实施方案中，对个体实施本发明的方法和/或组合物。在一些情况中，所述个体没有可检测到的认知功能障碍。在一些实施方案中，通过本领域的常规方法测试所述个体的认知功能障碍。典型方法包括认知缺损的过筛检查(Screening Examination for Cognitive Impairment)(SEFCI)、用于评价神经生理学状态重复性成套测验(Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status)(RBANS、Rao短暂重复性成套测验(Rao's Brief Repeatable Battery)(BRB)、完全SEP-59调查表、选择性联想试验(Selective Reminding Test)、符号数字模式测验(Symbol Digit Modalities Test)(SDMT)、相似性分测验(Similarities Subtest)、PASAT、斯特鲁测验(Stroop Test)、Myers-Briggs型指数(Myers-Briggs Type Indicator)、简短精神状态检查(Mini-Mental State Examination)和/或PROSPER检验。在其他实施方案中，个体具有阿尔茨海黙病、帕金森病、多发性硬化、唐氏综合征、精神发育迟滞、孤独症谱群疾病、创伤后精神紧张性障碍、脑瘫、中风、脑损害、头部损伤、脑疾病、三期梅毒、肝病、肾疾病、酒精中毒、甲状腺低能、肌营养不良症、重度营养不良、重性精神症、药物滥用、脑脊膜炎、脑炎、脑血块、脑瘤、脑脓肿、铅中毒、严重低血糖症、胰岛素过量、神经系统变性性疾病、代谢疾病、多发性梗死性痴呆、甲状腺功能减退、正常压力脑积水、维生素b12缺乏、溶酶体贮存病、化疗、四肢痉挛、脑炎、脑脓肿、胎儿酒精综合征或为中老年人。在具体的实施方案中，中老年人至少是45-50岁。在一些实施方案中，对任意年龄的个体实施本发明的方法和/或组合物。在一些情况中，在1小时或多个小时、数天、数周、数个月或数年的间隔对个体给予重复剂量的所述抑制剂。

[0012] 上述描述概括了相当宽泛的本发明的特征和技术优点，以便更好地理解本发明的详细描述。描述了本发明另外的特征和优点，其在下文中构成本发明权利要求的主题。本领域技术人员应理解所公开的构思和具体实施方案易于以改变或涉及实施本发明相同目的的其他结构为基础利用。本领域技术人员还应理解这种等效构成不会脱离如待批权利要求中所述的本发明的精神和范围。认为是作为有关组成和操作方法的本发明特征的新特征与其他目的和优点可以从如下描述中并且在考虑结合附图时得到更好地理解。然而，特别地应理解，提供每个特征的目的仅是为了示例和描述，而不预以作为限制本发明的定义。

[0013] 附图简述

[0014] 为了更完整地理解本发明，现在结合附图进行如下描述。

[0015] 图1.PKR的遗传缺失和药理学抑制导致体内同步的皮质EEG活动。来自双侧皮-/-质电极(左半球-参比＝L-r；右半球-参比＝R-r)的痕迹显示在自由活动的Pkr 小鼠
(a)、而并非在WT小鼠(b)中异常的自发性同步皮质活动，包括独立的发作间的尖峰，随后是短暂的放电波形。注射PKR抑制剂(PKRi；0.1mg/kg)在成年WT小鼠中诱导急剧尖峰(d)和节律性突发(e)。校准：1s和200μV。在来自全部WT对照组记录(n＝6)中不存在异常-/-
EEG活动，而存在于全部Pkr 小鼠(n＝8)和7只PKRi-注射的小鼠中的6只中(PKRi-注
射后1小时记录的)。通过费希尔精确检验，p值分别为<0.001和<0.01。

[0016] 图2.PKR的遗传缺失和药理学抑制导致切片中同步的海马活动。在0.03Hz的半数最大电刺激引起群峰电位(箭头所示)。a、b、c中的插图显示在施用荷苞牡丹碱前记录-/-的相似平均痕迹。低剂量的荷苞牡丹碱(2μM)在Pkr 切片(b)或用PKRi(1μM)处理的WT切片(c)中生成了比WT切片(A)中显著的后放电。所有的图表示至少5次的连续记录。
校准：插图：2ms和3mV；和缓慢痕迹：10ms和5mV。在这些条件下，引起的尖峰数量(d)和-/-
突发期限(e)在Pkr 切片或用PKRi处理的WT切片中增加。总结数据示例在图2a-c中。
统计学显著性：*p<0.05；**p<0.01。

[0017] 图3.来自Pkr-/-小鼠的海马切片CA1和用PKR抑制剂(PKRi)处理的WT切片中-/-
的抑制性突触响应降低。a)样品痕迹(上部)和总结数据(下部)显示来自Pkr 小鼠的
CA1神经元中的频率下降，但mIPSCs幅度未改变[使用包含KCl的膜片吸管和在宽谱谷氨酸盐拮抗剂犬尿烯酸(2mM)和河豚毒素(TTX,1μM的存在下在-60mV保持电位记录]。右-/-
侧的痕迹(各自是至少100次sIPSCs的平均值)在WT(最上部)与Pkr 切片(中部)
-/-
之间无差别，正如重叠的WT和Pkr IPSCs(最下部)所证实的。b)类似地，在WT切片中，PKRi降低了mIPSCs的频率(但不降低其幅度)。总结数据和单个事件排列在(a)中。校准(a,b)：缓慢痕迹：1s和50pA；和快速痕迹：20ms和20pA。c)作为刺激强度的函数的引起的IPSC幅度[在0mV保持点位在APV(50μM)、CNQX(10μM)和CGP(10μM)的存在下记录]显示为重叠且绘制为输入/输出曲线。校准：100ms和200pA。d)通过成对尖峰刺激得到的IPSCs在从50、100、200和400ms刺激时距(ISIs)时记录的成对响应中扣除第一次-/-
IPSC后重叠(左侧)；和相应的图(右侧)：注意在Pkr 切片和用PKRi处理的WT切片中
成对尖峰抑制(在50ms)比WT切片减少。将抑制性突触电流之比(IPSC2/IPSC1)测定为ISI的函数。数据是指±SEMs。统计学显著性：*p<0.05；**p<0.01。

[0018] 图4.PKRi抑制来自WT的切片中、而非Pkr-/-小鼠的单突触引起的IPSCs。在50μM APV、10μM CNQX和10μM CGP55845的存在下记录的药理学分离的eIPSCs通过半数最大刺-/-激引起。PKRi浴施用降低了WT切片(a)、而不是Pkr 切片(b)中的eIPSCs幅度。膜电
位保持在0mV且使用包含葡糖酸盐的膜片吸管进行全细胞膜片记录。水平条显示PKRi施用；插图痕迹(a,b)在下图中所示时间“a”和“b”时得到。校准：50ms和100pA。

[0019] 图5.兴奋性突触传递在来自Pkr-/-小鼠的切片或用PKRi处理的WT切片中未改变。使用包含葡萄糖酸盐的膜片吸管在-70mV保持电位在印防己毒素(100μM)的存在下-/-在来自WT和Pkr 小鼠的切片中进行EPSCs的醛细胞记录。a)样品痕迹(上部)和总结
-/-
数据(下部)显示在来自WT和Pkr 小鼠的切片中相似的自发性EPSCs(sEPSCs)频率和
-/-
幅度。b)样品痕迹(上部)和总结数据(下部)显示在来自WT和Pkr 小鼠的切片中相
似的缩图EPSCs(mEPSCs)频率和幅度[在印防己毒素(100μM)和TTX(1μM)的存在下记录]。c)PKRi(1μM)浴施用对在印防己毒素(100μM)的存在下记录的诱发的EPSCs没有影响。数据是指±SEMs。水平条表示与PKRi一起温育的期限。校准(a,b)：1s和20pA；
(c):10ms100pA。

[0020] 图6.来自Pkr-/-小鼠或用PKRi处理的WT切片中得到促进的L-LTP。a)单一高频-/-串(100Hz，1s)在WT切片中引起短效早期-LTP(E-LTP)，但在来自Pkr 小鼠的切片中生成-/-
持续的晚期-LTP(L-LTP)(在220min p<0.001)。b)在来自Pkr 小鼠的切片中的L-LTP被茴香霉素抑制(在220min p<0.01)。c)在WT切片中PKRi将E-LTP转化成L-LTP[在220min -/-
p<0.001]。低浓度的地西泮(1μM)防止了诱导来自Pkr 小鼠的切片中L-LTP[在220min p<0.05；d)]；但无法防止WT切片中4个强直串诱导的L-LTP[在220min p>0.05；(e)].f)在WT切片中，高浓度的地西泮(50μM)阻断了在100Hz4个串诱导L-LTP(在220min p<0.05)。
水平条表示与PKRi、茴香霉素或地西泮一起温育的期限。数据是指±SEMs。校准：5ms和
3mV。

[0021] 图7.用PKRi处理的Pkr-/-小鼠或WT小鼠中的增强的空间和恐惧记忆。a)作为在Morris水迷宫中训练天数的函数的平均逃逸潜伏期(1次试验/天)。与WT对照组相-/- -/-
比，Pkr 小鼠显示的逃逸潜伏期在第7和8天时明显减少(WT小鼠，n＝14；Pkr 小鼠，-/-
n＝12；*p<0.05)。b)在第9天时进行的探测试验中，仅Pkr 小鼠显示对目标四分体的偏好(**p<0.01)。c)通过测定条件前(首次用于实验，2min期限过程中)和然后在训练后24hr(3min期限过程中)的停顿时间确定与场景相关的恐惧条件。d)通过在音调发出前训练24hr后(前-CS，2min)或音调出现过程中(3min)测定停顿时间评价听觉恐惧记-/-
忆。在训练后24hr增强的停顿表明在Pkr 小鼠中更强的恐惧记忆(c,d：WT小鼠，n＝-/- -/-
13；Pkr 小鼠，n＝10；*p<0.05)。e)Pkr 小鼠与WT同窝出生仔畜相比显示明显更快的/-
停顿消失作为对场景的响应(WT小鼠，n＝8；Pkr- 小鼠n＝9；*p<0.05)。在训练后即刻注射PKRi(0.1mg/kg)增强了场景(f)和听觉恐惧(g)记忆(对于2个组，n＝8；*p<0.05；
**p<0.01)。h)场景-恐惧训练后即刻早期基因Egr-1的表达在来自接触场景(CS)的WT和-/-
Pkr 小鼠的CA1神经元中类似(对于2个组，n＝6)。相反，作为对训练的响应(CS+US)，-/-
在来自Pkr 小鼠的CA1区中的阳性Egr-1神经元的数量大于WT对照组(**p<0.01)。

[0022] 图8.缺乏Pkr不会改变总体脑形态。用尼氏染色剂(A)和针对GAD67(B)、-/-
VGLUT1(C)、PSD95和(D)和PKR(E)的抗体染色来自WT和Pkr 小鼠的脑横切片。这些标-/- -/-
记显示在WT与Pkr 小鼠之间无主要结构差异。蛋白质印迹(F)显示在来自Pkr 小鼠的海马中缺乏PKR。

[0023] 图9.PKR的遗传缺失导致体内同步的皮质-海马EEG活动。a)来自双侧皮质和海-/-马电极的痕迹(左半球-参比＝L-r；右半球-参比＝R-r)显示在自由活动的Pkr 小鼠
中神经元同步化过度的皮质-海马异常模式。箭头是指导致皮质(上)和海马(下)中癫痫发作的异常高频同步化发作。

[0024] 图10.在来自Pkr-/-小鼠CA1海马切片和用PKR抑制剂(PKRi)处理的WT切片中sIPSCs和电分离的eIPSCs减少。a)样品痕迹(上部)和总结数据(下部)显示在
Pkr-/-切片中在-60mV保持电位在犬尿烯酸(1mM)的存在下记录的频率降低，但sIPSCs幅-/-
度未改变。右侧的痕迹(各自是至少100个事件的平均值)在WT(最上部)与Pkr 切片
-/-
(中部)之间无差别，正如重叠的WT和Pkr mIPSCs(最下部)所证实的。b)类似地，在WT切片中，PKRi降低了sIPSCs的频率，但不降低其幅度。总结数据和单个事件排列在a中。
-/-
c)WT切片中荷苞牡丹碱对sIPSCs的可逆消除证实其通过GABAA受体介导。d)Pkr 切片和用PKRi处理的WT切片中的电分离的eIPSCs减少。使用包含葡糖酸盐的吸管在0mV保持电位进行全细胞膜片记录。eIPSCs在CA1椎体细胞神经元中因半数最大刺激引起。将数据概括为如下的直方图。*p<0.05；**p<0.01。

[0025] 图11.累积抑制在来自Pkr-/-小鼠或用PKRi处理的WT小鼠的切片中减少。短高频串(在100Hz5次尖峰)导致WT切片中的群峰电位幅度快速衰减，这归因于累积的γ-氨-/-基丁酸能抑制(a)，而在来自Pkr 小鼠的切片(b)或在用GABAA受体拮抗剂荷苞牡丹碱(c)或PKRi(d)处理的WT切片中未衰减。概括在(e)中的这些数据表明PKR正向地调节
γ-氨基丁酸能抑制。

[0026] 图12.PKRi特异性地增强CA1中单一刺激引起的群峰电位。PKRi不会改变突触前传入性排放或EPSPs的起始斜率(a)；然而，它增强WT切片中的群峰电位幅度(b)，但不-/-增强Pkr 切片中的群峰电位幅度(c)，表明PKRi效应不归因于脱靶作用。(d)在用GABAA受体拮抗剂荷苞牡丹碱预处理的WT切片中，PKRi不会导致进一步的放电增强。这些结果表明PKRi通过减少γ-氨基丁酸能抑制增加群峰电位。

[0027] 图13.来自Pkr-/-小鼠的切片中的正常基础突触传递。a)输入-输出数据显示在-/-来自Pkr 小鼠和WT同窝出生仔畜的切片中在宽泛的刺激强度内相似的突触前纤维幅度。
-/-
b)作为突触前纤维排放大小函数的fEPSPs输入-输出相关性对于Pkr 和WT切片也是类-/-
似的。c)fEPSPs的成对尖峰增强(反映出突触递质释放增强)在WT与Pkr 切片之间无
差别。图显示对于成对刺激的不同间隔的fEPSP2/fEPSP1的平均值(±SEM)。

[0028] 图14.L-LTP在来自WT和Pkr-/-小鼠的切片中是类似的，而PKRi不会进一步增强-/- -/-来自Pkr 小鼠的切片中的L-LTP。b)在来自WT和Pkr 小鼠的切片中，由4个强直串在
-/-
100Hz诱导的L-LTP是类似的(在220min p>0.05)。b)在Pkr 切片中，PKRi不会进一步增强由单一100Hz串(1s)引起的LTP(在220min p<0.05)。水平条表示与PKRi一起温育的期限。数据是指±SEMs。校准：5ms和3mV。

[0029] 图15.Pkr-/-显示当在高架十字迷宫和开放区域中测试时正常的焦虑样行为。花费在开放臂(a)(安全性较低)中的时间(以秒计)、进入开放臂的次数(b)和在开放臂中活-/- -/-动的距离(以cm计)(c)在WT与Pkr 小鼠之间无显著性差异(p>0.05)。WT和Pkr 小
鼠显示相似的总体活动距离(d)和花费在迷宫中心中的时间百分比(e)。

[0030] 发明详述

[0031] 作为本说明书中所用的“一种(a)”或“一种(an)”可以指一种或多种。作为本申请权利要求中所用的，当与措词“包含”联用时，措词“一种(a)”或“一种(an)”可以指一种或一种以上。本申请所用的“另一种”可以指至少第二种或以上。此外，本申请所用的术语“包括”、“包含”和“具有”解释为开放式且可以与本申请所用的术语“含有”互换使用。

[0032] I.定义

[0033] 本申请所用的术语“认知”是指认知的心理过程，包括例如了解、感觉、推理和判断这样的方面，包括、但不限于想了解、充分感觉、推理或直觉；知识。

[0034] 本申请所用的术语“认知增强”是指通过使用本领域的一种或多种测定可检测到地改善认知。

[0035] 本申请所用的术语“记忆增强”是指通过使用本领域的一种或多种测定可检测到地改善记忆。

[0036] 本申请所用的术语“PKR抑制剂”是指抑制至少部分PKR活性或抑制至少部分其表达的化合物或化合物的混合物。在一些实施方案中，所述抑制剂至少部分干扰PKR激酶活性。可以通过本领域的任意方法检测激酶活性，包括，例如针对PKR或其主要下游靶标的eIF2α的磷酸特异性抗体和体温测定测定法。

[0037] 当用于上下文的化学基团时，“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代”是指＝O；“卤素”是指独立地-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2(参见下文有关包含本申请所用的术语氨基的基团的定义，例如烷氨基)；“羟基氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH(参见下文有关包含本申请所用的术语亚氨基的基团的定义，例如烷基亚氨基)；
“氰基”是指-CN；“异氰酸酯”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在一价环境中的“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)2或其脱质子化形式；在二价环境中的“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)O-或其脱质子化形式；“巯基”是指-SH；“硫代”是指＝S；“硫醚”是指-S-；“磺酰氨基”是指-NHS(O)2-(参见下文有关包含本申请所用的术语磺酰氨基的基团的定义，例如烷基磺酰氨基)；“磺酰基”是指-S(O)2-(参见下文有关包含本申请所用的术语磺酰基的基团的定义，例如烷基磺酰基)；且“亚磺酰基”是指-S(O)-(参见下文有关包含本申请所用的术语亚磺酰基的基团的定义，例如烷基亚磺酰基)。

[0038] 在上下文的化学式中，符号“-”是指单键，“＝”是指双键，“≡”是指三键。符号“----”表示任选的键，如果存在，其为单键或双键。符号 表示单键或双键。因此，例如，结构 包括结构 和 正如本领域技术人员可以理解的，无一这样的环原子形成一个以上双键的组成部分。符号 在垂直拉过
键时表示基团的连接点。注意该连接点典型地仅以这种方式鉴定，其用于较大基团，以便有助于读者快速和清楚地鉴定连接点。符号 是指单键，其中连接楔形粗端的基团是在“页面外”。符号 是指单键，其中连接楔形粗端的基团是“进入页面”。符号
是指单键，其中构型(例如R或S)或几何构型未确定(例如E或Z)。

[0039] 本申请中所示的结构的原子上任何未确定的化合价隐含地表示键合该原子的氢原子。当将基团“R”描述为例如下式中环系上的“浮动基团”时：

[0040]

[0041] R可以替代连接任意环原子的任意氢原子，包括描绘的、隐含的好明确定义的氢，只要形成稳定的结构。当将基团“R”描述为例如下式中稠合环系上的“浮动基团”时：

[0042]

[0043] R可以替代连接稠合环的任意环原子的任意氢原子，除非另有指定。可替代的氢包括描绘的氢(例如连接上式中的氮的氢)、隐含的氢(例如未显示、但理解应存在的上式的氢)、明确定义的氢和任选的氢，其存在取决于环原子的身份(例如连接基团X的氢，此时X等于-CH-)，只要形成稳定的结构。在描述的实例中，R可以位于稠合环系的5-元或6-元环上。在上式中，紧接在圆括号内的基团“R”后面的下标字母“y”表示数值变量。除非另有指定，否则该变量可以为0、1、2或大于2的任意整数，仅限于环或环系的看替代氢原子的最大值。

[0044] 对于如下基团和类型，下列附加的下标进一步如下定义了基团/种类：“(Cn)”定义了基团/种类中碳原子的确切数量(n)。“(C≤n)”定义了可以在所述基团/种类中的碳原子的最大数量(n)，与所述基团中尽可能小的最小数量，例如，应理解基团“烯基(C≤8)”或种类“烯(C≤8)”中的碳原子最小数量为2。例如，“烷氧基(C≤10)”表示具有1-10个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或其中的任意可衍生的范围(例如3-10个碳原子)的那些烷氧基。(Cn-n′)定义了基团中碳原子的最小数量(n)和最大数量(n′)。类似地，“烷基(C2-10)”表示具有2-10个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或其中的任意可衍生的范围(例如3-10个碳原子)的那些烷基。

[0045] 本申请所用的术语“饱和”是指不具有碳-碳双键且不具有碳-碳三键的化合物或基团，除外如下所示的那些。该术语不排除碳-杂原子多键，例如碳氧双键或碳氮双键。此外，它不排除可能作为酮-烯醇互变异构现象或亚胺/烯胺互变异构现象的组成部分出现的碳-碳双键。

[0046] 术语“脂族”在不使用“取代的”修饰语使用时表示如此修饰的化合物/基团是无环的或环状的，但不是芳香烃化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以彼此连接成直链、支链或非芳香环(脂环族)。脂族化合物/基团可以是通过单键连接的饱和的(烷/烷基)或带有一个或多个双键(烯/烯基)或一个或多个三键(炔/炔基)的不饱和的。当术语“脂族”在不使用“取代的”修饰语使用时，仅存在碳和氢。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型非限制性官能团替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。

[0047] 本申请所用的术语“烷基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价饱和脂族基团，其具有作为连接点的一个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构和不带有非碳和氢的原子。因此，本申请所用的环烷基是烷基的亚组。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(异-Pr)、-CH(CH2)2(环丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲-丁基)、-CH2CH(CH3)2(异-丁基)、-C(CH3)3(叔-丁基)、-CH2C(CH3)3(新-戊基)、环丁基、环戊基、环己基和环己基甲基是烷基的非限制性实例。术语“烷二基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价饱和脂族基团，其具有作为连接点的一个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构、不带有碳-碳双键或三键和不带有非碳和氢的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-、-CH2CH2CH2-和 是烷二基的非限制性实例。术语“亚烷基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价基团＝CRR′，其中R和R′独立地是氢、烷基或R和R′一起表示具有至少两个碳原子的烷二基。亚烷基的非限制性实例包括：＝CH2、＝CH(CH2CH3)和＝C(CH3)2。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2,–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。下列基团是取代的烷基的非限制性实例：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。本申请所用的术语“氟烷基”是取代的烷基的亚组，其中一个或多个氢原子被氟基团取代，且没有除碳、氢和氟外的其他原子存在。基团-CH2F、-CF3和-CH2CF3是氟烷基的非限制性实例。“烷”是指化合物H-R，其中R是烷基。

[0048] 术语“烯基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价不饱和脂族基团，其具有作为连接点的一个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构、至少一个非芳香碳-碳双键、无碳-碳三键和不带有非碳和氢的原子。烯基的非限制性实例包括：-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CH-C6H5。术语“烯二基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价不饱和脂族基团，其具有作为连接点的一个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构、至少一个非芳香碳-碳双键、无碳-碳三键和不带有非碳和氢的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和是烯二基的非限制性实例。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。基团-CH＝CHF、-CH＝CHCl和-CH＝CHBr是取代的烯基的非限制性实
例。“烯”是指化合物H-R，其中R是烯基。

[0049] 术语“炔基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价不饱和脂族基团，其具有作为连接点的一个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构、至少一个非芳香碳-碳三键和不带有非碳和氢的原子。本申请所用的术语炔基不排除存在一个或多个非芳香的碳-碳双键。基团-C≡CH、-C≡CCH3,和-CH2C≡CCH3是炔基的非限制性实例。术语“炔二基”在不使用“取代的”稀释液使用时是指二价不饱和脂族基团，其具有作为连接点的两个碳原子、直链或支链、环、环状或无环结构、至少一个碳-碳三键和不带有非碳和氢的原子。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。“炔”是指化合物H-R，其中R是炔基。

[0050] 术语“芳基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价不饱和芳香基团，其带有作为连接点的一个芳香碳原子，所述碳原子形成一个或多个6-元芳香环结构的组成部分，其中环原子全部是碳，且其中基团不由非碳和氢的原子组成。如果存在一个以上的环，则这些环可以稠合或不稠合。该属于不排除存在一个或多个连接第一个芳香环或任意另外存在的芳香环的烷基(允许限制碳的数量)。芳基的非限制性实例包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和衍生自联苯基的一价基团。术语“芳烃二基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价芳香基团，其带有作为连接点的两个芳香碳原子，所述碳原子形成一个或多个6-元芳香环结构的组成部分，其中环原子全部是碳，且其中一价基团不由非碳和氢的原子组成。本申请所用的该术语不排除存在一个或多个连接第一个芳香环或任意另外存在的芳香环的烷基(允许限制碳的数量)。如果存在一个以上环，则这些环可以稠合或不稠合。芳烃二基的非限制性实例包括：

[0051] 和

[0052] 当术语“芳基”与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。“芳烃”是指化合物H-R，其中R是芳基。

[0053] 术语“芳烷基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上述提供的定义一致的方式使用，芳烷基的非限制性实例为：苯基甲基(苄基，Bn)和2-苯基-乙基。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。取代的芳烷基的非限制性实例为：(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。

[0054] 术语“杂芳基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指一价芳香基团，其带有作为连接点的一个芳香碳原子或氮原子，所述碳原子或氮原子形成芳香环结构的组成部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中基团不由非碳氢、芳香氮、芳香氧和芳香硫的原子组成。本申请所用的该术语不排除存在一个或多个连接芳香环或任意另外存在的芳香环的烷基(允许限制碳的数量)。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、吲哚基、吲唑基(Im)、甲基吡啶基、 唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉、喹喔啉基、噻吩基和三嗪基。术语“杂芳烃二基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价芳香基团，其带有作为两个连接点的两个芳香碳原子、两个芳香氮原子或一个芳香碳原子和一个芳香氮原子，所述原子形成一个或多个芳香环结构的组成部分，其中至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中二价基团不由非碳、氢、芳香氮、芳香氧和芳香硫的原子组成。本申请所用的该术语不排除存在一个或多个连接第一个芳香环或任意另外存在的芳香环的烷基(允许限制碳的数量)。如果存在一个以上环，则这些环可以稠合或不稠合。杂芳烃二基的非限制性实例包括：

[0055] 和

[0056] 当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。

[0057] 术语“酰基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，作为这些术语如上述所定义。基团-CHO、-C(O)CH3(乙酰基，Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH2CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5、-C(O)C6H4CH3、-C(O)CH2C6H5、-C(O)(咪唑基)是酰基的非限制性实例。按照类似的方式定义“硫代酰基”，除外基团-C(O)R的氧原子被硫原子替代-C(S)R。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨基甲酰基)和-CON(CH3)2是取代的酰基的非限制性实例。

[0058] 术语“烷氧基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-OR，其中R是烷基，该术语如上述所定义。烷氧基的非限制性实例包括：-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH(CH2)2、-O-环戊基和-O-环己基。术语“烯氧基”、“炔氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳氧基”和“酰氧基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指定义为-OR的基团，其中R分别是烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和酰基。类似地，术语“烷硫基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-SR，其中R是烷基，该术语如上述所定义。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。术语“醇”相当于如上述所定义的烷，其中至少一个氢原子被羟基替代。

[0059] 术语“烷氨基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上述所定义。烷氨基的非限制性实例包括：-NHCH3和-NHCH2CH3。术语“二烷氨基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-NRR′，其中R和R′可以是相同或不同的烷基或R和R′可以一起表示烷二基。二烷氨基的非限制性实例包括：-N(CH3)2、-N(CH3)(CH2CH3)和N-吡咯烷基。术语“烷氧基氨基”、“烯氨基”、“炔氨基”、“芳氨基”、“芳烷氨基”、“杂芳氨基”和“烷基磺酰氨基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指定义为-NHR的基团，其中R分别是烷氧基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基和烷基磺酰基。芳氨基的非限制性实例是-NHC6H5。术语“酰氨基”(酰基氨基)在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上述所定义。酰氨基的非限制性实例是-NHC(O)CH3。术语“烷基亚氨基”在不使用“取代的”修饰语使用时是指二价基团＝NR，其中R是烷基，该术语如上述所定义。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是取代的氨基的非限制性实例。

[0060] 术语“烷基磷酸酯”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-OP(O)(OH)(OR)，其中R是烷基，该术语如上述所定义。烷基磷酸酯的非限制性实例包括：-OP(O)(OH)(OMe)和-OP(O)(OH)(OEt)。术语“二烷基磷酸酯”在不使用“取代的”修饰语使用时是指基团-OP(O)(OR)(OR′)，其中R和R′可以是相同或不同的烷基或R和R′可以一起表示烷二基。二烷基磷酸酯的非限制性实例包括：-OP(O)(OMe)2、-OP(O)(OEt)(OMe)和-OP(O)(OEt)2。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN,-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。

[0061] 术语“烷基磺酰基”和“烷基亚磺酰基”在不使用“取代的”修饰语使用时分别是指基团-S(O)2R和-S(O)R，其中R是烷基，该术语如上述所定义。按照类似方式定义术语“烯基磺酰基”、“炔基磺酰基”、“芳基磺酰基”、“芳烷基磺酰基”和“杂芳基磺酰基”。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3,–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2、–B(OH)2、–P(O)(OCH3)2或–OC(O)CH3。

[0062] 术语“杂环化合物”或“杂环”在不使用“取代的”修饰语使用时表示如此修饰的化合物/基团，其包含至少一个环，其中至少一个环原子是非碳的元素。非碳原子的实例包括、但不限于氮、氧、硫、硼、磷、砷、锑、锗、铋、硅和/或锡。杂环结构的实例包括、但不限于氮丙啶、吖丙啶(azirine)、环氧乙烷、环氧化物、环氧乙烯、硫杂丙环、环硫化物、硫杂丙烯环(thiirene)、双吖丙啶(diazirine)、氧杂吖丙啶(oxaziridine)、二环氧乙烷、氮杂环丁烷、氮杂环丁二烯、氧杂环丁烷、氧杂环丁烷(oxete)、硫杂环丁烷(thietane)、硫杂环丁烷(thiete)、二氮杂环丁烷、二 二酮、二氧杂环丁烷(dioxete)、二硫杂环丁烷、二硫杂环丁烷(dithiete)、吡咯烷、吡咯、氧戊环(oxolane)、呋喃、硫戊环(thiolane)、噻吩、环戊硼烷、borole、啉杂环戊烷(phospholane)、磷杂环戊二烯(phosphole)、砷戊环(arsolane)、砷杂茂(arsole)、锑戊环(stibolane)、锑杂茂(stibole)、bismolane、bismole、硅戊环(silolane)、硅杂环戊二烯(silole)、stannolane、stannole、咪唑烷、咪唑、吡唑烷、吡唑、咪唑啉、吡唑啉、 唑烷、 唑、 唑啉、异 唑烷、异 唑、噻唑烷、噻唑、噻唑啉、异噻唑烷、异噻唑、二氧戊环、thithiolane、三唑、呋咱、 二唑、噻二唑、二噻唑、四唑、哌啶、吡啶、 烷、吡喃、thiane、噻喃、桉叶烷(salinane)、saline、germinane、germine、锡杂 己环 (stanninane)、stannine、borinane、borinine、phosphinane、phosphinine、arsinane、arsinine、哌嗪、diazine、吗啉、 嗪、硫吗啉、噻嗪、二 烷、二 英、二噻烷、dithiine、三嗪、三 烷、四嗪、氮杂庚环、吖庚因、氧杂庚环、 庚因、噻庚环、噻庚因、高哌嗪、二吖庚因、噻吖庚因、ozocane、氮杂环辛烷(azocine)、氧杂环癸烷(oxecane)或硫杂环己烷(thiocane)。当该术语与“取代的”修饰语一起使用时，一个或多个氢原子独立地被如下典型的非限制性官能团之一替代：-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、–C(O)CH3、-N(CH3)2、–C(O)NH2或–OC(O)CH3。

[0063] 本申请所用的“手性助剂”是指能够影响反应的立体选择性的可除去的手性基团。本领域技术人员熟知这样的化合物并且许多是商购的。

[0064] 第一种化合物的“异构体”是单独的化合物，其中每个分子包含与第一种化合物相同的组成原子，但其中那些原子的构型在三维方面有差别。

[0065] 本申请所用的术语“患者”或“受试者”是指活的哺乳动物生物体，例如人、猴子、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因种类。在一些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类。人体受试者的非限制性实例是成年人、青少年、婴儿和胎儿。

[0066] 本申请一般使用的“药学上可接受的”是指这样的化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，它们适用于接触人和动物的组织、器官和/或体液，但没有过度的毒性、刺激性、不良反应或其他问题或危害合理的利益/风险比的并发症。

[0067] “药学上可接受的盐”是指为如上述所定义的药学上可接受的并且具有期望的药理学活性的本发明化合物的盐。这种烟包括与无机酸或与有机酸形成的酸加成的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；所述有机酸例如1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4'-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-羧酸)、4-甲基双环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、乙酸、脂族一-和二羧酸、脂族硫酸、芳香硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、庚酸、己酸、羟萘甲酸、乳酸、十二烷基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、o-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对-氯苯磺酸、苯基-取代的烷酸、丙酸、对-甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸、三氟乙酸、三氟甲基磺(三氟甲)酸等。药学上可接受的盐还包括在酸性质子存在时能够与无机碱或有机碱反应形成的碱加成的盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括、但不限于乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应认为形成本发明任意盐的组成部分的具体的阴离子或阳离子并不是关键的，只要盐作为整体是药学上可接受的。药学上可接受的盐的另外的实例及其制备和使用方法在Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl&C.G.Wermuth eds.,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002)中提供。

[0068] “预防”或“防止”包括：(1)抑制受试者或患者中的疾病发作，所述受试者或患者可能处于疾病风险中和/或易感该病，但尚未经历或展示出该疾病的任何或全部病理学或症状学情况；和/或(2)减缓受试者或患者中疾病的病理学或症状学情况发作，所述受试者或患者可能处于疾病风险中和/或易感该病，但尚未经历或展示出该疾病的任何或全部病理学或症状学情况。

[0069] “有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”是指在对受试者或患者给药用于治疗疾病时足以进行这种疾病的治疗的用量。

[0070] 上述定义替代了引入本申请参考的任意参考文献中的任意出现矛盾的定义。然而，事实上，不应将所定义的一些术语视为表明未定义的任何术语是不明确的。而是认为所用的全部术语以术语的方式描述本发明，使得本领域技术人员可以理解本发明的范围并且实施本发明。

[0071] II.一般实施方案

[0072] 在本发明的一些实施方案中，提供了增加个体认知的方法和组合物，无论该个体是否存在认知功能障碍。特别地，PKR抑制剂改善认知功能，包括改善记忆，例如长时记忆和/或短期记忆。在具体的实施方案中，所述改善是持久性的。在其他实施方案中，所述改善是暂时的，但如果连续给予所述抑制剂，则改善得以维持。需要在一定的间隔给予所述抑制剂，包括，例如每日、每周、每隔双周、每个月、每隔双月或每年。在一些实施方案中，可以口服给予所述抑制剂。

[0073] 最初将双链RNA活化蛋白激酶(PKR)鉴定为病毒感染的指示剂。然而，其在脑中的功能仍然不了解。本发明包括独特的小鼠表型，其中缺乏PKR导致网状构造同步性过强，恰好促进长效突触强化(L-LTP)、记忆储存和学习和记忆。此外，对WT小鼠给予选择性PKR-/-抑制剂(PKRi)可复制Pkr 表型，即增强的网状构造节律性、L-LTP和记忆储存。令人意外地，这些作用因γ-氨基丁酸能突触传递选择性减少导致。因此，PKR控制细调的网状构造活性，其必须得以维持，同时在学习过程中储存指定的发作，而不发生病理学变动。当PKR活性在几种神经性障碍中改变时，PKR是治疗认知功能障碍的富有希望的新靶标。

[0074] 本 领 域 技 术 人 员 认 为 PKR 也 可 以 称 作 EIF2AK1；MGC126524；PRKR；OTTHUMP00000201320；P1/eIF2α蛋白激酶；双链RNA激活蛋白激酶；eIF2α蛋白激酶2；干扰素诱导的双链RNA-激活蛋白激酶；干扰素诱导型RNA-依赖性蛋白激酶；干扰素诱导型eIF2α激酶；p68激酶；RNA激活蛋白激酶；蛋白激酶、干扰素诱导型双链RNA依赖性或真核生物翻译起始因子2-α激酶2。作为典型示例，PKR蛋白质序列在 中以
NP_002750提供，将其引入本申请参考，而PKR mRNA序列在 中以NM_002759
提供。本领域技术人员认为本发明的抑制剂可以直接地抑制同种型PKR活性、eIF2α磷酸化或间接地促进PKR或eIF2α磷酸酶的活性。

[0075] III.本发明的典型化合物

[0076] 可以使用下述方法制备本说明书的化合物。可以使用本领域技术人员所应用的有机化学原理和技术进一步改进和优化这些方法。这种原理和技术教导在例如March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure(2007)中，将该文献引入本申请参考。

[0077] 本发明的化合物可以包含一个或多个不对称取代的碳或氮原子且可以以旋光或外消旋形式分离。因此，除非具体指定了具体立体化学或异构体形式，否则预期是所有的手性、非对映异构体、外消旋形式、差向异构体形式和所有的几何异构体形式。化合物可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体混合物和各非对映异构体存在。在一些实施方案中，得到单一非对映异构体。本发明化合物的手性中心可以具有S或R构型。

[0078] 本发明的化合物还可以具有这样的优点，它们比现有技术中已知的化合物更有效、毒性更低、作用期限更长、效力更高。产生的副作用更少、更易于吸收和/或具有更好的药代动力学特性(例如更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)和/或具有其他有用的药理学、物理学或化学特性，无论是用于本申请所述的适应证还是其他。

[0079] 此外，构成本发明的化合物的原子预以包括这种原子的所有同位素形式。本申请所用的同位素包括那些具有相同原子数、但质量数不同的原子。作为一般性实例，氢的同位13 14
素包括氚和氘，碳的同位素 C和 C，但不限于此。

[0080] 本发明的化合物还可以以前体药物形式存在。由于已知前体药物可以提高药物的许多期望的质量(例如溶解度、生物利用度、制备等)，所以，如果期望，则在本发明的一些方法中所用的化合物可以以前体药物形式递送。因此，本发明关注本发明的化合物的前体药物和递送前体药物的方法。用于本发明的化合物的前体药物可以通过修饰所述化合物上存在的官能团制备，按照这种方式以常规的操作或在体内使修饰物裂解，得到母体化合物。因此，前体药物包括，例如本申请所述的化合物，其中羟基、氨基或羧基与任意的基团键合，在对受试者给予前体药物时，它们分别裂解成羟基、氨基或羧酸。

[0081] 应认为形成本发明的任意盐的组成部分的具体阴离子或阳离子并不是关键的，只要所述盐作为整体是药学上可接受的。药学上可接受的盐的另外的实例及其制备和使用方法在Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(2002)中提供，将该文献引入本申请参考。

[0082] 一般而言，通过化学合成，经首先由杂环增环的analine A生成靛红B生成本申请公开的化合物，然后使得多的靛红B与另外的杂环通过膦内鎓盐为介体的反应偶合，生成结构C。本申请公开的化合物根据下列方案生成。

[0083]

[0084] 本领域技术人员易于认为存在与本申请公开的相同类型化合物的其他合成途径。上述合成途径不是限定性的。本说明书关注可以得到上述各结构的可选的合成途径，它们均不脱离本说明书的精神和范围。

[0085] 一般而言，X可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，X是H、OH、SH、O、S、N、NH、CH、CH2或C＝O。一般而言，Z可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，Z是H、OH、SH、O、S、N、NH、CH、CH2或C＝O。一般而言，L可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，L是H、OH、SH、O、S、N、NH、CH、CH2或C＝O。一般而言，A可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，A是H、OH、SH、O、S、N、NH、CH、CH2或C＝O。一般而言，D可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，D是H、OH、SH、O、S、N、NH、CHCH2或C＝O。一般而言，J可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、硫原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子、取代的碳或羰基(C＝O)。在具体的实例中，J是H、OH、SH、O、S、N、NH、CHCH2或C＝O。一般而言，R可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、氮原子或取代的氮原子。在具体的实例中，R是H、OH、SH、O或NH2。一般而言，G可以选自如下官能团的任意一种，例如氢(-H)、羟基(-OH)、巯基(-SH)、氧原子、氮原子或取代的氮原子。在具体的实例中，G是H、OH、SH、O或NH2。

[0086] 一般而言，Y可以选自如下官能团的任意一种，例如氧原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子或取代的碳原子。在具体的实例中，Y是CH2；CH、N、NH、C或O。一般而言，E可以选自如下官能团的任意一种，例如氧原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子或取代的碳原子。在具体的实例中，E是CH2；CH、N、NH、C或O。一般而言，Q可以选自如下官能团的任意一种，例如氧原子、氮原子、取代的氮原子、碳原子或取代的碳原子。在具体的实例中，Q是CH2；CH、N、NH、C或O。一般而言，m是0，形成5-元环；或m是1，形成6-元环。一般而言，n是0，形成5-元环；或n是1，形成6-元环。

[0087] 根据本发明生成的化合物的具体的非限制性实例如下：

[0088]

[0089]

[0090] 和

[0091] IV.药物制剂

[0092] 本发明的药物组合物包含有效量的溶于或分散于药学上可接受的载体中的本发明的一种或多种组合物。如果适合，措词"药学或药理学可接受的"是指在对动物例如人给药时不产生不良、过敏或其他不需要的反应的分子本体和组合物。包含至少一种本发明的组合物或另外的活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员根据本说明书的教导已知的，正如以Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990为典型，将该文献引入本申请参考。此外，对于动物(例如人)的给药，可以理解制剂应满足FDA Office生物制品标准所要求的无菌性、致热原性、一般的安全性和纯度标准。

[0093] 本申请所用的“药学上可接受的载体”包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等材料及其组合，正如本领域技术人员公知的(例如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329，将该文献引入本申请参考)。除外任何与活性成分不相容的载体，关注其在药物组合物中的应用。

[0094] PKR抑制剂可以包含不同类型的载体，这取决于是将其以固体、液体还是以气雾剂形式给予和是否需要灭菌以用于作为注射剂这样的给药途径。可以通过静脉内、皮内、透皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、粘膜、口服、局部、局部性地、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、浸浴靶细胞的直接局部灌注、通过导管、通过灌洗、以乳膏形式、液体组合物(例如脂质体)形式或通过其他本领域技术人员公知的其他方法或任意上述方法的组合(例如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版.Mack Printing Company,1990，将该文献引入本申请参考)给予本发明的化合物。

[0095] 可以将PKR抑制剂以游离碱、中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成的盐，例如与蛋白质组合物的游离氨基形成的那些盐或与无机酸或有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如盐酸或磷酸，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或可以衍生自例如异丙基胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因这样的有机碱。在配制时，可以以与剂型相容的方式和例如治疗有效这样的量给予溶液。易于以不同剂型给予制剂，例如为胃肠外给药配制的剂型，例如注射溶液或用于递送至肺的气雾剂；或为营养给药配制的剂型，例如药物释放胶囊等。

[0096] 此外，根据本发明，适合于给药的本发明的组合物以使用或不使用稀释剂的药学上可接受的载体形式提供。载体应是可同化的且不包括液体、半固体即糊状或固体载体。除外任何对接受者或其中包含的组合物的治疗有效性有害的常用介质、试剂、稀释剂或载体，其在用于实施本发明方法的给药组合物中的应用是适合的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等或其组合。组合物还可以包含各种抗氧化剂以阻止一种或多种成分氧化。另外，可以用防腐剂预防微生物的作用，例如各种抗菌剂和抗真菌剂，包括、但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

[0097] 根据本发明，将组合物与载体按照任意便利和可实施的方式合并，即通过溶解、混悬、乳化、混合、包囊、吸收等。这类方法对于本领域技术人员而言是常规的。

[0098] 在本发明的一个具体的实施方案中，将组合物与半固体或固体载体合并或充分混合。混合可以以任意常规的方式进行，例如研磨。在混合过程中还可以加入稳定剂以防止组合物丧失治疗活性，即在胃中变性。用于组合物的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸例如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露糖醇等。

[0099] 在另一个实施方案中，本发明还涉及包括PKR抑制剂、一种或多种脂质和水性溶剂的药物脂质囊泡组合物的应用。本申请所用的术语“脂质”定义为包括在特征方面不溶于水并且可用有机溶剂提取的任意宽泛的物质。这种宽范类型的化合物是本领域技术人员众所周知的，且作为本申请所用的术语“脂质”不限于任何特定的结构。实例包括包含长链脂族烃类及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人设计或生产的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域众所周知的且包括，例如中性脂肪、磷脂类、磷酸甘油脂类、甾类、萜类、lysolipids、糖苷神经鞘脂类、糖脂类、硫苷脂类、含有醚和酯-连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质及其组合。当然，非本申请特别描述的那些的本领域技术人员理解为脂质的化合物也包括在BF组合物和方法中。

[0100] 本领域技术人员熟知可以用于将组合物分散于脂质囊泡的技术范围。例如，PKR抑制剂可以分散于包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质合并，与脂质共价键合，作为混悬液包含在脂质中，与胶束或脂质体一起包含或与之复合，否则与脂质或脂质结构通过本领域技术人员公知的方式结合。分散可以导致形成脂质体，也可以不形成脂质体。

[0101] 对动物患者给予的本发明组合物的实际剂量可以根据身体和生理因素决定，例如体重、疾病严重性、所治疗的疾病类型、在先或同时的治疗干预、患者的特发病和给药途径。根据给药剂量和途径的不同，优选的剂量和/或有效量的给药次数可以根据受试者的响应的不同而改变。负责给药的临床医师在任何情况下都可以决定针对个体受试者的组合物中活性成分的浓度和适合的剂量。

[0102] 在一些实施方案中，药物组合物可以包含，例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方案中，活性化合物可以包含例如约2％-约75％的重量单位或约25％-约60％和其中衍生的任意范围。自然地，可以按照这样的方式制备每种治疗有用的组合物中活性化合物的量，即以任意指定的化合物的单位剂量得到适合的剂量。制备这种药物制剂的本领域技术人员关注例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、给药途径、产品贮存期限和其他药理学考量这样的因素，照此，期望各种剂量和治疗方案。

[0103] 在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次给药约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重－约1000mg/kg/体重或以上和其中可衍生的任意范围。在来自上述举出的数值的可衍生范围的非限制性实例中，可以基于上述数值给予约5mg/kg/体重－约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重－约500毫克/kg/体重等。

[0104] a.消化组合物和制剂

[0105] 在本发明的优选的实施方案中，为通过消化途经给药配制组合物。消化途经包括所有可能的给药途径，其中组合物直接接触消化道。特别地，本申请根据的药物组合物可以通过口服。口含、直肠或舌下给药。照此，可以使用惰性稀释剂或可同化食用载体配制这些组合物或可以将它们包封在硬壳胶囊或软壳胶囊中或可以将它们压制成片剂或可以将它们直接掺入膳食食品。

[0106] 在一些实施方案中，将活性化合物与赋形剂掺合并且以可摄入片剂、口含片、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用(Mathiowitz等人,1997；Hwang等人,1998；美国专利Nos.5,641,515；5,580,579和5,792,451，将这些文献各自完整地引入本申请参考)。片剂、药片、丸剂、胶囊等还可以包含如下成分：粘合剂，例如黄蓍树胶、阿拉伯胶、明胶或其组合；赋形剂，例如磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合；润滑剂，例如硬脂酸镁；甜味剂，例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；矫味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃香精、橙香精等。当单位剂型是胶囊时，它除上述类型的材料外还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣衣料存在，否则就是改变剂型的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或它们两者给片剂、丸剂或胶囊包衣。当剂型是胶囊时，它除包含上述类型的材料外还可以包含载体，例如液体载体。可以给胶囊、片剂或丸剂包肠溶衣。肠溶衣防止组合物在胃或上部肠道中变性，其中pH是酸性的。参见，例如美国专利No.5,629,001。在达到小肠时，其中的碱性pH溶解包衣衣料并且使得组合物释放且被专门的细胞吸收，例如上皮肠细胞和集合淋巴小结M细胞。酏剂的糖浆可以包含作为甜味剂的活性化合物蔗糖和作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和矫味剂例如樱桃或橙香精。当然，用于制备任何单位剂型的任意材料应是药学纯的且基本上以无毒性的用量使用。此外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和配方。

[0107] 为了口服给药，可选地将本发明的组合物与一种或多种赋形剂掺合成漱口药、牙膏、口含片剂、口腔喷雾剂或舌下口腔给药制剂的形式。例如，可以通过将所需量的活性成分掺入适合的溶剂例如硼酸钠(多贝耳液)制备漱口药。或者，可以将活性成分掺入口腔用溶液，例如包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口腔用溶液，或者使其分散于牙膏中或以治疗有效量加入到可以包括水、粘合剂、磨料、矫味剂、起泡剂和保湿剂的组合物中。或者，可以将组合物制成片剂或溶液形式，可以将其置于舌下，否则就使其在口腔中溶解。

[0108] 适合于其他消化给药模式的另外的制剂包括栓剂。栓剂是不同重量和形状的固体剂型，其通常含药，用于插入直肠。在插入后，栓剂通常软化、熔化或溶于腔液。一般而言，对于栓剂，传统的载体可以包括，例如聚亚烷基二醇类、甘油三酯类或其组合。在一些实施方案中，栓剂可以由包含例如约0.5％－约10％且优选约1％－约2％的活性成分的混合物形成。

[0109] b.胃肠外组合物和制剂

[0110] 在另外的实施方案中，可以通过胃肠外途经给予所述组合物。本申请所用的术语“胃肠外”包括绕过消化道的途经。具体地，例如，可以通过静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内给予本申请公开的药物组合物，但不限于此：美国专利Nos.6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363(特别地将这些文献各自完整地引入本申请参考)。

[0111] 可以用适当地混合了表面活性剂例如羟丙基纤维素的水制备作为游离碱或药学上可接受的盐的活性化合物的溶液。还可以用甘油、液体聚乙二醇及其混合物和用油制备分散液。在常规的贮存和应用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适合于注射的药物剂型包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备可注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利No.5,466,468，特别地将该文献各自完整地引入本申请参考)。在所有情况中，所述剂型必须是无菌的且必须是流体以达到具有方便注射能力的程度。它在制备和贮存条件下必须是稳定的且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油。例如，可以通过使用包衣衣料例如卵磷脂、通过维持分散液中所需的粒度和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以用不同的抗菌剂和抗真菌剂防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可以通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶的组合物延长可组合物的吸收。

[0112] 为了用水溶液进行胃肠外给药，例如，如果必要，应适当地缓冲该溶液并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。在这方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本说明书已知的。例如，可以将一种剂量溶于等渗NaCl溶液并且加入皮下输液或在指定的输注部位注射(例如，参见"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版,1035-1038和1570-1580页)。一些剂量的变化必然取决于所治疗的受试者的疾病而出现。负责给药的人在任何情况下都可以确定用于个体受试者的适合的剂量。此外，对于人体给药，制剂应满足FDA Office生物制品标准所要求的无菌性、致热原性、一般的安全性和纯度标准。

[0113] 通过将活性化合物掺入所需量的含有上述其他成分的适合的溶剂，如果需要，随后通过过滤灭菌制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将不同的活性成分掺入包含碱性分散介质和来自上述的所需其他成分的无菌介质制备分散液。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分+任意另外来自上述其无菌过滤的溶液的所需的成分的粉末。将粉状组合物与液体载体例如水或盐水溶液与或不与稳定剂合并。

[0114] c.混合型药物组合物和制剂

[0115] 在本发明的其他优选的实施方案中，可以为通过各种混合途经给药配制活性化合物，例如局部(即透皮)给药、粘膜给药(鼻内、阴道等)和/或吸入。

[0116] 用于局部给药的药物组合物可以包括为含药施用配制的活性化合物，例如软膏剂、糊剂、霜剂或粉末。用于局部施用的软膏剂包括所有的油性吸收乳剂和基于水溶性的用于局部施用的组合物，而霜剂和洗剂是那些仅包括乳剂基质的组合物。局部给药的药物可以包含渗透促进剂以促进活性成分通过皮肤吸收。适合的渗透促进剂包括甘油、醇类、烷基甲基亚砜类、吡咯烷酮类和luarocapram。用于局部施用的组合物的可能的基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷膏和凡士林油以及任意其他适合的吸收乳剂或水溶性软膏剂基质。局部制剂还可以包括乳化剂、胶凝剂和如果必要的抗微生物防腐剂以对活性成分防腐并且提供均匀的混合物。本发明的透皮给药还可以包含使用"贴剂"。例如，该贴剂可以以预定速率和连续方式在固定时间期限内提供一种或多种活性物质。

[0117] 在一些实施方案中，可以通过滴眼液、鼻内喷雾剂、吸入和/或其他气雾剂递送介质递送药物组合物。例如，在美国专利Nos.5,756,353和5,804,212(将所述文献各自完整地引入本申请参考)中描述了通过鼻用气雾剂将组合物直接递送至肺的方法。同样，使用鼻内微粒树脂递送药物(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰-甘油化合物(美国专利No.5,725,871，特别完整地引入本申请参考)也是制药领域众所周知的。同样，以聚四氟乙烯支持基质形式跨粘膜递送药物描述在美国专利No.5,780,045中(特别完整地引入本申请参考)。

[0118] 本申请所用的术语气雾剂是指分散液液化或加压气体抛射剂的液体颗粒的细粉固体的胶体系统。用于吸入的本发明典型气雾剂由活性成分在液体抛射剂或液体抛射剂和适合的乳剂的混合物中的混悬液组成。适合的抛射剂包括烃类和烃醚类。适合的容器将根据抛射剂的压力需求的不同而改变。气雾剂的给药将根据受试者年龄、体重和症状严重性和响应的不同而改变。

[0119] V.本发明的药盒

[0120] 药盒中可以包含本申请所述的任意组合物。在非限制性实例中，药盒中可以包含在适合的容器用具中的PKR抑制剂。

[0121] 例如，可以将药盒的成分包装在水性介质中或以冻干形式包装。药盒的容器用具一般包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器用具，其中可以放入且优选适当地等分放入成分。如果药盒中存在一种以上成分，则该药盒一般还可以包含第二种、第三种或其他另外的容器，其中可以分别放入另外的成分。然而，小瓶中可以包含不同成分的组合。本发明的药盒还可以典型地包括密闭环境的包含PKR抑制剂的用具和任意其他试剂容器，其用于商业销售。这种容器可以包括其中固定期望小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。

[0122] 当以一种和/或液体溶液的形式提供药盒的成分时，液体溶液是水溶液，其中特别优选无菌是水溶液。还可以将组合物配制成可注射组合物。就此而言，容器用具自身可以是注射器、吸管和/或其他这样的装置，从其中可以将制剂施用于身体受感染的表面，注入动物和/或甚至施用于药盒的其他成分和/或与药盒的其他成分混合。在一些实施方案中，将药盒的成分作为干粉提供。当将试剂和/或成分制成干粉时，可以通过添加适合的溶剂再溶解该粉末。预计还可以将溶剂提供在另一个容器用具中。实施例

[0123] 包括下列实施例是为了显示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解下文实施例中公开的技术代表发明人为在实施本发明过程充分起作用所覆盖的技术，且由此可以将其视为构成优选的实施方式。然而，本领域技术人员应理解，根据本说明书的教导，可以在所公开的具体的疏水阀案中进行许多改变，且仍然得到类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

[0124] 实施例1

[0125] 总体脑形态在PKR敲除(PKR-/-)小鼠中未改变

[0126] PKR敲除(Pkr-/-)小鼠是活的、有繁殖力的并且具有正常的大小并且在表型方面与其野生型(WT)同窝出生仔畜不能区分(Abraham等人,2008)。囊泡谷氨酸盐转运蛋白1(VGLUT1；突触前谷氨酸能末端标记)、突触后密度蛋白95(PSD95；突触后末梢标记)和谷-/-
氨酸脱羧酶67(GAD67，γ-氨基丁酸能末端)的尼氏染色和突触标记未显示Pkr 小鼠脑中的总体异常(图8)。PKR正常地在整个海马中的锥体细胞和内在神经元中表达(图8e)。
-/-
正如所预计的，在Pkr 脑中不可检测到PKR蛋白，正如通过免疫组织化学和蛋白质印迹所测定的(图8e,f)。由于PKR在哺乳动物脑中的丰富程度相对较低(与其他eIF2α激酶相-/-
比(Costa-Mattioli等人,2009))，所以 磷酸化在来自Pkr 小鼠的海马中未改
变，这并不令人意外(图8f)。

[0127] 实施例2

[0128] PKR的遗传缺失或药理学抑制导致体内和体外同步网状构造放电

[0129] 令人意外地，脑电描记术(EEG)在自由活动的Pkr-/-小鼠中监测到的自发性海马和皮质脑节律揭示出间歇异常棘波放电(图1a和图9a)，其并不伴随明显的行为表现。在来自WT小鼠的记录中也没有出现异常(图1b和图9b)。发作间事件的非典型特征在于所述事件由尖峰组成，然后是重复性的波后放电，而不是单独的尖峰，这启示尖峰后抑制缺-/-
乏。当这种在Pkr 小鼠中的兴奋性失衡可能在发育过程中出现时，发明人通过全身注射选择性PKR抑制剂(PKRi)在成年WT小鼠中抑制了PKR活性(Jammi等人,2003)。紧急给
-/-
予PKRi诱导发作间的尖峰(图1d)和异常EEG节律突发活动(图1e)，与在Pkr 小鼠自
发出现的那些类似(比较图1e与图1a)。这些观察结果揭示出这种激酶作为神经元网状构造节律性调节剂的中枢新作用。

[0130] 为了确定是否可以在体外概括Pkr-/-切片或用PKRi处理的WT小鼠中的同步网状-/-构造活动，发明人记录了来自WT、Pkr 小鼠的海马切片(CA1中)或用PKRi处理的WT切-/-
片中的同步网状构造活动。对放线层的单一电刺激引起来自WT和Pkr 小鼠的切片中的类似场EPSP和群峰电位(图2a,b；插图)。然而，在极低浓度荷苞牡丹碱(2μM)的存在下，-/-
相同的刺激仅在来自Pkr 小鼠的切片中引起突出的后放电(比较图2a与图2b，还参见图-/-
2d,e)，从而揭示出Pkr 切片中潜伏的海马网状构造的超兴奋性。此外，当将PKRi施用于来自WT小鼠的切片时，得到类似的效果(图2c；还参见图2d,2e)，从而证实当以药理学方式抑制PKR时，还诱导了相差无几的潜伏的超兴奋性。

[0131] 实施例3

[0132] PKR的遗传缺失或药理学抑制导致抑制性突触传递减少

[0133] 由于抑制受损是癫痫症的遗传模型的常见特征(Noebels,2003)，所以发明人考虑-/-是否它可以解释在Pkr 小鼠中观察到的超同步活动。为了进一步表征这一结果，在对来-/-
自WT、Pkr 小鼠和用PKRi处理的WT小鼠的海马切片进行的一系列实验中研究抑制性突触传递。首先，在来自CA1神经元的全细胞膜片钳记录中，自发性和微型抑制性突触后电-/-
流(sIPSCs和mIPSCs)频率(但不是幅度)在Pkr 切片(图3a和图10a)或用PKRi处
理的WT切片中显著降低(图3b和图10b)。不存在mIPSC幅度改变是一种强烈的指示，即PKR不影响锥体细胞对突触释放的GABA的敏感性；由此正在进行的γ-氨基丁酸能活动减少–显示为mIPSCs频率下降–可能是因GABA释放抑制导致(正如图3d中结果支持
-/-
的)。第二，在来自Pkr 小鼠和用PKRi处理的WT切片的CA1神经元中，引起的IPSCs幅度-电[即保持膜电位在0mV(图10c)]和/或药理学(通过阻断谷氨酸盐-介导的EPSCs)
分离的-在宽泛刺激强度内减少(图3c)。此外，与其在WT切片中相反，PKRi不改变来自-/-
Pkr 小鼠的切片中引起的IPSCs的幅度(比较图4a与图4b)，证实PKRi的作用并非归因于脱靶作用。第三，成对抑制即引起的GABA释放改变的敏感指标反应(Thomson,2000)在缺乏PKR的切片和在用PKRi处理的切片中显著减少(图3d)，表明PKR调节GABA释放的可概率。令人惊奇地，PKR显然调节抑制性突触后传递而非抑制性突触前传递，因为在来自WT、-/-
Pkr 小鼠或用PKRi处理的WT小鼠的切片中在sIPSCs和mIPSCs的上升时间或衰减时间
常数方面无差异(图3a，b，图10和表1)，这一结果与在突触后受体相关机制中无改变一致s。第四，在来自WT小鼠的切片中，CA1群峰电位幅度在短串高频刺激过程中快速下降(图
11a,11e)。GABAA拮抗剂荷苞牡丹碱主要抑制这种急剧衰减，这显然归因于累积的突触抑制-/-
(图11b,11e)。相反，在来自Pkr 或用PKRi处理的WT小鼠的切片中，存在波峰幅度的最小或非高频刺激诱导的下降(图11c-e)。这些数据提供了当阻断PKR功能时γ-氨基丁酸能抑制的有效性较低的进一步的证据。第五，尽管PKRi对WT切片中的传入性排放或场EPSPs的起始斜率没有影响(图12a)，但是它提高了群峰电位的幅度(图12b)，正如可以预-/-
计锥体细胞神经元是否可以作为抑制减少的结果而增加一样。此外，PKRi对来自Pkr 小鼠的切片中的群峰电位没有影响，其中PKRi的靶标(PKR)不存在(图12c)或此时γ-氨基丁酸能突触传递已经被阻断(图12d)。这些数据一起提供了PKR选择性增强γ-氨基丁酸能突触传递的强有力的遗传和药理学证据。

[0134] 表1.来自WT、Pkr-/-和用PKRi处理的WT切片的CA1神经元中sIPSCs和mIPSCs的特性

[0135]上升时间10％-90％(ms) τW(ms)
sIPSCs
WT 1.70±0.09 23.29±1.013
Pkr-/- 1.66±0.08 22.35±0.62
PKRi 1.68±0.18 22.89±0.78
mIPSCs
WT 1.41±0.1 20.60±1.01
-/-
Pkr 1.38±0.06 21.15±0.81
PKRi 1.36±0.07 21.28±1.24

[0136] 令人惊奇的是，PKR特异性地调节抑制性突触传递，因为自发性兴奋性突触后电流-/-(sEPSCs)、小EPSCs(mEPSCs)或诱发的EPSCs(eEPSCs)的幅度或频率在来自Pkr 小鼠的切片或用PKRi处理的WT切片中无显著性改变(图5)。

[0137] 实施例4

[0138] PKR的遗传缺失或药理学抑制促进L-LTP

[0139] 因为诱导长时程增强(LTP)因GABA协调减少而得以促进(Abraham等人,1986；-/-
Davies等人,1991；Wigstrom和Gustafsson,1983)，所以发明人解决了来自Pkr 小鼠的切片或用PKRi处理的WT切片中的突触抑制减少是否可以增强诱导LTP的问题。典型地由单串高频(强直)刺激诱导的早期LTP(E-LTP)仅持续1-2hr并且取决于预先存在的蛋白质修饰，而一般由几个(典型地4个)间隔5–10min的强直串诱导的晚期-LTP(L-LTP)持续许多小时并且需要新的蛋白质合成(Kandel,2001)。在WT切片中，单一高频刺激串(100Hz，-/-
1s)仅引起短效蛋白质合成-独立的增强E-LTP(图6a)。相反，在来自Pkr 小鼠的切片中，相同的刺激生成了长效晚期-LTP(L-LTP)(图6a)，其被蛋白质合成抑制剂茴香霉素阻-/-
断(图6b)。然而，4个强直串(在100Hz)在来自WT和Pkr 小鼠的切片中引起类似的
-/-
L-LTP(图14a)。促进来自Pkr 小鼠的切片中的L-LTP是不能归因于基底突触传递的改变，因为场EPSPs的输入-输出相关性(作为刺激强度的函数)、成对脉冲促进幅度(PPF)和传-/- -/-
入纤维排放大小在来自Pkr 与WT小鼠的切片之间无显著性差异(图13)。与在Pkr 切
片中的发现一致，与PKRi一起温育将WT切片中的瞬时E-LTP转化成持续L-LTP(图6c)，但-/-
不会诱导来自Pkr 小鼠的切片中的任何进一步增强，从而证实PKR抑制剂的特异性(图
14b)。这些数据显示PKR的遗传缺失或药理学抑制降低了诱导L-LTP的阈值。
-/-

[0140] 如果在来自Pkr 小鼠的切片中L-LTP因抑制减少而得到促进，则强化这些切片中γ-氨基丁酸能调谐应将来自长效的单串转化成短效。实际上，与增强GABAA作用-/-(Haefely,1990)的低浓度的地西泮(1μM)一起温育显著地减少了来自Pkr 小鼠的切片中的L-LTP(图6d)，但对WT切片中4个强直串诱导的L-LTP没有影响(图6e)。需要远高浓度的地西泮(50μM)来防止来自WT小鼠的切片中的L-LTP(图6f)。这些数据证实了我-/-
们的推定：来自Pkr 小鼠的切片中促进的L-LTP是γ-氨基丁酸能调谐减少的结果。

[0141] 实施例5

[0142] PKR的遗传缺失或药理学抑制增强学习和记忆

[0143] γ-氨基丁酸能功能在记忆巩固中起决定性作用(Izquierdo和Medina,1991；-/-
McGaugh和Roozendaal,2009)。发明人考虑了学习和记忆是否可能在Pkr 小鼠中得到增强，其中海马GABA-介导的抑制减少。首先，在Morris水迷宫中测试小鼠的海马-依赖性空间记忆，其中动物使用视觉线索找到环形水池中的隐藏平台(Morris等人,1982)。当消-/-
弱强直刺激(在100Hz1个串)揭示出来自Pkr 小鼠的切片中的长效LTP时，发明人使用消弱方案训练小鼠(每天仅训练1个期限)8天。Pkr-/-小鼠找到平台的速度明显比WT对-/-
照组同窝出生仔畜快(图7a)；而在第9天时进行的探头测试中，当移去平台时，仅Pkr 小鼠记忆平台的位置(目标四分体)(图7b)。因此，PKR的遗传缺失强化了长期空间记忆。

[0144] 在两种形式的Pavlovian恐惧条件形式研究小鼠。通过使场景(条件刺激；CS)与足电击(非条件刺激；US)配对，而美国在听觉恐惧条件中与音调呈现(CS)配对诱导场景恐惧条件。场景恐惧条件涉及海马和杏仁核，而听觉恐惧条件仅需要杏仁核(LeDoux,2000)。当随后使小鼠暴露于CS时，将恐惧响应(“僵直不动”)定为CS-US关联-/-
强度指数。尽管首次用于实验的WT和Pkr 小鼠显示在消弱训练方案前相似数量的强直-/-
(单一配对的音调与0.35mA足电击)，但是在随后24hr测试时，Pkr 小鼠显示比WT对照-/-
组同窝出生仔畜更为僵直不动(图7c)。类似地，Pkr 小鼠显示增强的长效听觉恐惧记忆-/-
(图7d)。在Pkr 小鼠中对恐惧的非特异性响应是不可能的，因为在高架十字迷宫和开放-/-
区域(图15)中Pkr 小鼠的基线强直(图7c,7d)和焦虑反射行为均正常。因此，缺乏PKR改善了听觉和场景长效恐惧记忆。

[0145] 当动物再次(几次试验以上)以不再使用足电击暴露于测试场景时，增强的认知-/-还与快速记忆消失相关(Lee和Silva,2009)。因此，Pkr 小鼠显示快于WT对照组的消失(图7e)。

[0146] 如果PKR涉及认知过程，则PKR的紧急药理学抑制也增强长期恐惧记忆。为了测试这种预测，在Pavlovian恐惧条件后即刻给WT小鼠注射介质或PKRi。实际上，当在训练后24hr测定时，场景和听觉恐惧记忆在PKRi-处理的小鼠中均得到增强(图7f,7g)。

[0147] 由于PKR缺乏增强了长时记忆储存，即储存“分配”–通过该过程神经元或突触在-/-学习过程中的神经回路中被特异性活化(或并入)(Silva等人,2009)–也可以在Pkr 小鼠中得到增强。为了鉴定神经元选择性活化和由此参与恐惧学习编码，发明人分析了即刻早期基因Egr-1(也称作Zif/268)的表达。Egr-1已经广泛地用于该目的(Frankland等人,2004；Hall等人,2000)，且起缺失阻断L-LTP和记忆巩固(Jones等人,2001)。对WT和-/-
Pkr 小鼠实施消弱恐惧条件方案(音调与0.35mA足电击单一配对)和CA1区中的Egr-1
表达根据免疫组织化学定量，如上所述(Frankland等人,2004)。当两种基因型的动物暴-/-
露于单独的场景中时，Egr-1表达不显著。相反，消弱练训练方式仅增加了来自Pkr 小鼠-/-
的CA1神经元中的Egr-1水平(并且推定记忆巩固)(图7h)并且在Pkr 小鼠中触发了
比WT同窝出生仔畜更强的长效记忆(图7c)。因此，缺乏PKR有利于海马神经元补充入编码过程。

[0148] 实施例6

[0149] 本发明一些实施方案的重要性

[0150] 本发明提供了新的遗传学、生理学、药学、行为和分子证据，即PKR通过强化γ-氨基丁酸能突触传递反向调节脑节律性、突触可塑性和记忆储。γ-氨基丁酸能抑制不仅控制对锥体细胞的兴奋性突触输入的效力和可塑性，而且使主细胞在一些优选的频率下的大量组装放电同步化(Mann和Paulsen等人,2007)。缓慢的θ和较快的γ振荡和波动显然决定性地涉及记忆过程(Buzsaki,2006；Maurer和McNaughton,2007)。几线证据支持了如下构思：突触可塑性的γ-氨基丁酸能控制是记忆贮存的关键机制(Paulsen和Moser,1998；Mann和Paulsen,2007)。首先，减少的γ-氨基丁酸能介导的抑制有利于诱导LTP(Abraham,1986；Davies等人,1991；Wigstrom和Gustafsson,1983)。第二，亚组CA1锥体细胞的长期脱抑制与空间记忆获取相关(Gusev和Alkon,2001)。第三，γ-氨基丁酸能传递的适度的药理学减少促进记忆巩固(Izquierdo和Medina,1991；McGaugh和Roozendaal,2009)。最后，中层隔膜的γ-氨基丁酸能神经元驱动海马网状构造中的θ节律性(Hangya等人,2009)，这决定性地促成了海马-依赖性记忆过程(Buzsaki,2006)。

[0151] PKR缺乏如何能够促进脑节律性且同时增强LTP和认知性能？在一些实施方案中，两者均为兴奋性增加的结果。当PKR活性得到抑制时(以遗传方式或药理学方式)，脱抑制增强了突触可塑性并且有利于长时记忆储存，可能是通过神经元网状构造中的同步化活动进行(Beenhakker和Huguenard,2009；Buzsaki,2006；Girardeau等人,2009；Sohal等人,2009；Maurer和McNaughton,2007；Shirvalkar等人,2010)。

[0152] 在具体的实施方案中，这种长期的(尽管是适度的)的抑制消弱的副产物是电图-/-的癫痫发作的风险增加。而Pkr 脑中脱抑制保持在低于可能损害可塑性和记忆过程的病理性癫痫发作的阈值。因此，PKR控制细调谐的网状构造节律性，其必须优化以便在学习过程中封存指定的发作，而不使线路交叉进入异常或失控的兴奋。

[0153] 神经元兴奋性增加显然是神经元中记忆巩固的关键体重。根据近期的报告，CREB导致的神经元兴奋性的选择性增强反映出杏仁核中恐惧记忆的分配和储存(Han等-/-人,2007；Han等人,2009；Zhou等人,2009)。在消弱训练过程中，其特异性地增强Pkr 小-/-
鼠或紧急用PKRi处理WT小鼠中的记忆(图7)，仅Pkr 小鼠显示选择性神经元活化和补充入记忆痕迹(图7h)。因此，当PKR受到抑制时，神经元兴奋性得到增强且神经元放电同步地编码学习方式过程指定的发作。

[0154] 总之，数据揭示出Pkr缺乏产生新的癫痫实验性小鼠，其中网状构造超同步和增强的长效突触可塑性和认知共存。最终，PKR在优化高级脑功能中的作用表明抑制PKR的活性剂在治疗上可用于治疗阈记忆丧失的人体疾病，例如阿尔茨海黙病，其中PKR活性异常升高(Couturier等人,2010；Peel和Bredesen,2003；Chang等人,2002)且γ-氨基丁酸能传递受到破坏(Palop等人,2007)。

[0155] 实施例7

[0156] 典型方法和材料

[0157] Pkr-/-小鼠

[0158] Pkr敲除(Pkr-/-)小鼠(Abraham等人,1999)是反向交配至少8代至129SvEv小鼠。在出生后第3周给小鼠断奶并且通过PCR鉴定基因型。简言之，通过4-引物PCR测定法检测突变体和相应的WT等位基因，其中Oligo-1(5’-GGAACTTTGGAGCAATGGA-3’)和Oligo-2(5’-TGCCAATCAGAAAATCTAAAAC-3’)得到了225个碱基-对片段的WT带，且Oligo-3(5’-TGTTCTGTGGCTATCAGGG-3’)和Oligo-4(5’-TGAGGAGTTCTTCTGAGGG-3’)得到了432个碱基+/S51A对的来自缺失的等位基因的片段。eIF2α 小鼠如上所述(Costa-Mattioli等人,2007；
Scheuner等人,2001)。全部实验对8-16周龄的雄性进行。将小鼠保持在12h光照/黑暗周期中，始终在该循环的光照期间进行行为实验。小鼠可以随意取食和饮水，除外在测试过程中。根据来自Baylor College of Medicine的动物保护委员会的批准进行动物护理和实验操作。

[0159] 长期脑动电流描记(EEG)记录

[0160] 如所述的进行EEG记录(Price等人,2009)。用阿佛丁(1.25％三溴乙醇/戊-/-
醇溶液,i.p.)以0.02ml/g的剂量麻醉WT和Pkr 小鼠。将与微型连接器焊接的特氟隆
涂敷的银线电极(120μm直径)双侧植入额、中心的、顶骨和枕叶皮质上的硬膜下腔。在延长和随机2hr样品记录过程中每日得到数字化的EEG数据，持续至多2周(Stellate Systems,Harmonie软件5.0b版本)。

[0161] 将阻断PKR自磷酸化的PKR的有效ATP-结合位点定向抑制剂(Jammi等人,2003；Shimazawa和Hara,2006)PKRi(Calbiochem,San Diego)制备成20mM在DMSO(二甲亚砜)中的溶液。将PKRi新鲜地溶于盐水，然后以0.1mg/kg的剂量腹膜内注射(i.p.)，并且在注射后1hr记录EEG。在EEG记录过程中用数字电视摄像机同时监测行为。在对测试笼中自有活动的小鼠实施手术后至少24hr进行全部记录。

[0162] 电生理学

[0163] 场记录：在4℃人工脑脊液(ACSF)中从WT或年龄匹配的Pkr-/-同窝出生仔畜的脑中切下海马横切片(350mm)并且如所述的(Zhu等人,2005)在记录前保持在室温下的ACSF中至少1hr。将切片维持在灌注了充氧的ACSF(95％O2和5％CO2)的界面型室内，所述充氧的ACSF(95％O2和5％CO2)包含以mM计的如下成分：124NaCl、2.0KCl、1.3MgSO4、2.5CaCl2、1.2KH2PO4、25NaHCO3和10葡萄糖(2-3ml/min)。将双极刺激电极置于CA1放线层中以刺激Schaffer侧和连合纤维。使用ACSF-填充的微量移液器在28-29℃记录场电位。将记录电极置于防线层中用于场兴奋性突触后电位(fEPSPs)和锥体层中用于群峰电位。调整0.1ms脉冲的刺激强度以引起对fEPSPs30-35％的最大响应和对群峰电位50％的最大响应。在
0.033Hz建立稳定的响应基线至少30min。通过作为单一串或间隔5min的4个串施加的短暂串高频刺激(100Hz,1s)诱导强直LTP。短串由5次刺激(突发内100Hz)。当显示时，给ACSF补充茴香霉素(Calbiochem,CA)、PKRi(Calbiochem,CA)、荷苞牡丹碱(Tocris)或地西泮(Sigma-Aldrich)。应注意发明人使用仅阻断GABAA受体的荷苞牡丹碱游离碱而不是荷苞牡丹碱-M(甲碘荷包牡丹碱、甲溴化物或甲基氯化物)，其除GABAA受体外还阻断小电导(SK)钙活化钾通道(Debarbieux等人,1998)。PKRi以1μM(0.01％DMSO)的终浓度使用，已知其阻断离体PKR活性(Page等人,2006；Wang等人,2007)。为了减少日间变异，无论-/-
是否可能，都从来自Pkr 小鼠和用药物或介质处理的WT同窝出生仔畜的切片中得到同时的记录(在相同的室内)。使用t-检验和两种方式ANOVA进行统计学分析。将全部数据表示为平均值±SEM且“n”表示切片的数量。

[0164] 全细胞记录：如上所述切下海马横切片。使用常规的膜片钳技术和Axopatch200B放大器(Molecular Devices,Union City,CA)在28-29℃得到全部记录。在直立式显微镜(Axioskope FS2,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)台面上通过红外鉴别干涉对比电视显微镜检查在视觉上鉴定CA1神经元。给膜片吸管(电阻4-6MΩ)充(以mM计)：110葡糖酸K、10KCI、10HEPES、10磷酸肌酸Na2、2Mg3-ATP、0.2Na3-GTP；将pH调整至7.2并且使用Wescor5500蒸汽压渗透压计(Wescor,Logan,UT)将容积渗克分子浓度调整至290mOsm。用位于防线层中的双极刺激电极引起突触响应。为自发性抑制性突触后电流(sIPSCs)用KCl替代葡糖酸盐。在2mM犬尿烯酸的存在下记录sIPSCs，同时在犬尿烯酸(2mM)和河豚毒素(TTX；1μM)的在下记录微型IPSCs。在D-AP5(50μM)、CNQX(10μM)和CGP55845(10μM)存在或不在它们的存在下记录引起的IPSCs。在10μM荷苞牡丹碱或100μM印防己毒
素的存在下记录兴奋性突触后电流(EPSCs)。在5kHz在线过滤电信号并且在10kHz数字化。在刺激前施加-5mV x25ms测试脉冲的记录过程中连续测定串联电阻(Rs)和输入电阻(Ri)。如果Rs的改变曾经出现±20％以上，则取消该记录并且清除该数据。全部药物获自Tocris(Ellisville,MO)。以1μM的终浓度使用PKRi。

[0165] 场景和听觉恐惧条件

[0166] 实验者不了解用于全部行为测试的基因型。如上所述进行恐惧条件设定(Costa-Mattioli等人,2007)。首先将小鼠处理3-5min，持续3天，然后使其习惯于设定条件的室20min，再经过3天。在训练的当天，在设定条件的室内2min后，小鼠接受音调(2800Hz,85db,30s)与共同终止的足电击(0.35mA,1s)对，此后，将它们保持在室内再经过
2min，然后放回到其居住的笼中。在训练后24hr测试小鼠“僵直不动”(除外呼吸不活动)作为对音调(它们在未设定条件的室内)和训练场景(训练室)的响应。

[0167] 在测试听觉恐惧条件过程中，将小鼠放入室内并且在最初的2min过程中(前-CS期)和在放出音调时的最后3min过程中记录僵直不动响应。在音调结束后30s将小鼠放回到其笼。为了测试场景恐惧条件，将小鼠放回到条件室内5min。为了进行消弱练习，在训练后5min、24hr、48hr、72hr和96hr评价对条件设定的场景响应的僵直不动，并且对在24hr得到的僵直不动的数量校准。对于全部测试，在5min期限过程中的5s间隔测定僵直不动行为。将小鼠僵直不动花费的时间百分比定为学习和记忆指数。将PKRi新鲜地溶于盐水，然后在恐惧条件后即刻以0.1mg/kg的剂量i.p注射，已知它可阻断体内海马中的PKR活性(Ingrand等人,2007)。基于重复措施ANOVA和通过图基检验的组间对比进行统计学分析。

[0168] Morris水迷宫

[0169] 如上所述在环形不透明水池中进行测试(Moris等人,1982)。使用相对消弱训练方案训练WT和I同窝出生仔畜，每天练习1次(Costa-Mattioli等人,2007)。通过自动化视频跟踪系统(HVSImage,Buckingham,UK)监测从水中逃逸至隐藏(水下)平台上的潜伏期。对于探头试验，从水池中取出平台并且使动物寻找60s。记录花费在水池的每个分支的-/-时间％(四分体停留时间)。在WT与Pkr 小鼠之间无显著性差异。在动物光照期间白天同时训练动物。基于重复措施ANOVA和通过图基检验的组间对比进行统计学分析。

[0170] 高架十字迷宫实验

[0171] 高架十字迷宫装置由两个开放臂(35×5cm)和相同大小的两个封闭臂(具有15cm高的不透明壁)组成。所述臂和中心方块由塑料板构成并且高于地板升起40cm。将小鼠置于迷宫的中心方块(5×5cm)中。在5-min期间记录行为。使用ANYMAZE软件自动进行数据采集和分析。

[0172] 免疫组织化学和蛋白质印迹

[0173] 如上所述进行海马细胞裂解、蛋白质印迹和免疫组织化学(Costa-Mattioli等人,2007)。深度麻醉小鼠并且通过贲门内灌注冷PBS，随后灌注4％低聚甲醛(PFA)在冰冷0.1M磷酸酶缓冲液(PBS)中的溶液。从颅骨中取出脑，贮存在4％PFA溶液中过夜(在4℃)，用切片机(Leica VT1000S,Germany)切下40μm横切片。使用自由漂浮法，同时在步骤间进行冲洗。首先在室温将切片放入封闭溶液(5％BSA、0.3％Triton和4％正常山羊血清在磷酸盐缓冲盐水中的溶液)1小时，与初级抗体[PKR(Santa Cruz Biotechnology,CA)、GAD67(Millipore,Billerica,MA)、V-Glut1(Synaptic Systems,Goettingen,Germany) 和PSD95(NeuroMab,CA)]一起温育过夜，然后用PBS冲洗4次(20min)，然后与二次抗体一起温育(4hr)。用PBS4次洗涤后(各20min)，将切片固定在 Plus载玻片
上(VWR,West Chester,PA)。最终，用 Hard Set包埋剂(Vector
Lab,Burlingame,CA)滑动覆盖切片。使用Zeiss LSM510激光共焦显微镜得到数字相片。

[0174] Egr-1染色：在场景恐惧条件设定前，将WT和Pkr-/-小鼠(n＝6，2组)处理连续的3天。然后如上所述训练它们。使对照组暴露于所述场景，除外它们在训练期间不接受电击。训练后90分钟，如上所述切下脑切片并且用0.3％H2O2的PBS溶液预处理。然后将切片与抗Egr-1(1:7500)初级家兔多克隆抗体(Cell Signaling Technologies,Denver,MA)在封闭溶液(1％BSA、0.3％triton和4％正常山羊血清的PBS溶液)一起温育48hr；然后在室温与生物素标记的山羊抗家兔抗体(1:500；Vector Laboratories,Burlingame,CA)一起温育60min，然后与抗生物素蛋白–生物素–辣根过氧化物酶(HRP；ABC kit；Vector Laboratories,Burlingame,CA)一起温育。通过在室温将切片在0.1％3,3’-二氨基联苯胺(DAB)和0.025％H2O2中温育5–10min定位结合的过氧化物酶，生成可见的底物。如上所述(Frankland等人,2004；Hall等人,2001)，在指定区域内计数免疫反应性CA1神经元2
(0.07mm)。

[0175] 参考文献

[0176] 本说明书中举出的全部专利和出版物表示本发明所属技术领域普通技术人员的水平。将全部专利和出版物完整地引入本申请参考，其引用程度就如同将每一出版物各自特别地和单独地引入参考相同。

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[0252] 尽管已经详细描述了本发明及其优点，但是应理解，可以在不脱离如待批权利要求所定义的本发明精神和范围的情况下进行各种改变、取代和变型。此外，不预以将本发明的范围限于本说明书中所述的方法、装置、制备、物质组合物、方式、方法和步骤的具体实施方案。正如本领域技术人员易于从本发明的公开内容所理解的，可以根据本发明利用目前存在或随后研发的执行基本上与本申请所述的相应实施方案相同功能或基本上实现与之相同效果的方法、装置、制备、物质组合物、方式、方法或步骤。因此，待批权利要求预以在其范围内包括这样的方法、装置、制备、物质组合物、方式、方法或步骤。