[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种农杆菌菌液喷雾转基因方法。

[0002] 棉花是重要的经济作物，改革开放以后中国已成为世界主要产棉大国。近60年以来，全球棉花种植总面积不断增加，美国、非洲、苏联及中亚、印度等是主要的出口国家和地区。1982年以后，中国的棉花产量一直位于世界之首，但国内棉花生产却无法满足国内需求。

[0003] 当前，转基因生物技术发展迅速，并全面推动育种技术的升级，引领了生物种业的重大变革，而且在农民创收、粮食安全和现代农业等多个方面发挥重要作用。美国所研制的抗虫棉大田种植面积已经超过棉花总种植面积的70%，中国和澳大利亚超过30%，世界转基因棉花种植总面积达680万公顷以上，占全球棉花种植总面积的20%。近年来，随着转基因技术的不断发展，利用生物技术开发棉花种质资源和培育新品种极大地推动了棉花遗传育种的研究进程。

[0004] 在棉花转基因方式中，主要有农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated gene transfer）、花粉管通道（Pollen tube pathway）和基因枪（Particle bombardment）三种转化方法。基因枪法是较为常见的棉花遗传转化方法，通常选用悬浮的胚性细胞作为受体材料，但是该方法对仪器设备要求很高，并且转基因后代多拷贝，整合效率低且遗传稳定性较差。农杆菌介导棉花胚性愈伤转化体系存在周期长、易受基因型限制、消耗人力和财力等问题。

[0005] 利用花粉管通道法导入外源基因技术是我国学者周光宇（1979，1980）设计了外源DNA直接导入受体的花粉管通道法，并提出了“DNA片段杂交”的假说，这是我国基因工程研究的一大特色。传统的花粉管通道技术方便、费用低，但是转化率不稳定。

[0006] 农杆菌菌液喷雾法又称喷花法，是近年来新兴的一种简单、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养转基因方法，是将农杆菌介导法和花粉介导转化法有效结合的转基因技术。

[0025] 以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。

[0026] 本发明用到的材料、试剂和仪器：

[0027] 植物材料：海岛棉品种新海20和新海24由新疆农业大学农业生物技术重点实验室提供。

[0028] 菌株材料：农杆菌菌株为LBA4404。

[0029] 质粒材料：PCAMB1300-p53:gfp，见图1。

[0030] 植物基因组DNA提取缓冲液：50mmol／L Tris-HCl，pH=8.0；

[0031] 100mmol／L EDTA，pH=8.0；

[0032] 1.5mmol／LNaCl；

[0033] 1% SDS；

[0034] 1% PVP40；

[0035] 30 μLβ-Mer。

[0036] 电泳缓冲液

[0037] 10×TBE：48.4g／L Tris碱，11.42mL冰乙酸，20mL的0.5mol／LEDTA（工作缓冲液为1×TBE）

[0038] Southern杂交配制溶液

[0039] 20×SSC：175.3g NaCl和88.2g柠檬酸钠，溶于1L去离子水中，pH=7.0；

[0040] Maleic Acid Buffer：11.067g马来酸和8.766g NaCl溶于1L去离子水中，pH=7.5；

[0041] Washing Buffer：Maleic Acid Buffer灭菌后加入3mL吐温-20；

[0042] 1mol／L Tris-HCl：12.114g Tris-base，溶于100mL去离子水中，pH=8.0；

[0043] Detection Buffer：1.1688g NaCl溶于100mL去离子水中，加20mL的1mol／L Tris-HCl（pH=8.0），定容至200mL，pH=9.5；

[0044] 10%SDS：10g SDS，溶于100mL水中，加热至68℃溶解，pH=7.2；

[0045] 低严谨洗膜液：2×SSC／0.5%SDS；

[0046] 高严谨洗膜液：0.5×SSC／0.5%SDS；

[0047] Blocking Solution：用Maleic Acid Buffer将10×Blocking solution稀释10倍；

[0048] Antibody Solution：将Anti-Digoxigenin-AP（10000r／min离心）按1:5000用Blocking Solution稀释；

[0049] MS培养基：。

[0050] 主要仪器：电热恒温水槽（DK-8D）、高速离心机（Centrifuge 5415R）、PCR仪（AG22331Hamburg）、电泳仪（DYY-6D）、凝胶成像系统（FluorChem FC2）。

[0051] 实施例1海岛棉农杆菌菌液喷雾转p53基因

[0052] 本方法，包括以下步骤：

[0053] 制备农杆菌菌液：将含有质粒PCAMB1300-p53:gfp的农杆菌LBA4404重悬于渗透培养基中，将菌液稀释到OD600值为0.6。渗透培养基配制：20%蔗糖、1／2MS、0.1%吐温-20，pH=6.0。

[0054] 喷洒农杆菌菌液：在北疆，于7月中旬棉花盛花期的晴天，北京时间10时左右，对刚开的花朵挂牌标记，花柄上系绳子，在棉花授粉之前，对标记花朵进行转基因喷洒。喷洒操作方式为：用食指和中指轻轻夹住花朵，只露出花柱的柱头，用喷壶对准花柱柱头喷洒菌液1~2mL／朵。喷洒过程中，应尽量避免菌液喷洒到花药上。喷洒后，用绳子绑住花瓣，以保持相对的湿度和菌液活性。处理时，绳子不要过紧，以免损坏柱头。对处理后花朵的花柄基部喷洒40μg／L赤霉素，防止落铃。

[0055] 本实施例所用棉花为新海24。

[0056] 实施例2转p53基因海岛棉植株检测

[0057] 1、标记基因检测

[0058] 对转基因植株的T1代进行卡那霉素田间筛选，在棉花真叶期用4000~5000mg／L卡那霉素涂抹第一或第二片真叶，一周后依据叶片颜色进行初步筛选。将叶片涂抹处不变色（没有斑点）的植株进一步进行室内分子鉴定。

[0059] 喷花处理对T0代成铃率的影响

[0060] 农杆菌菌液喷雾法处理的新海24的T0代植株成铃率为30.5%（见表1），与传统花粉管通道转化方法成铃率25%相比有所提高。

[0061] 表1农杆菌菌液喷雾处理T0代成铃率

[0062]

[0063] 大田卡那霉素筛选

[0064] T1代真叶期时，用4000~5000mg／L的卡那霉素涂抹第一或第二片真叶，一周后进行初步筛选，结果表明，1500个样品植株中有132株为阳性植株，阳性率为8.8%。

[0065] 从转化机理分析，农杆菌菌液喷雾对幼铃的处理、损伤程度等多个方面有所差异，这将直接影响到转化后幼铃的成铃率。传统的花粉管通道法在进行质粒注射时，在剥花过程和注射过程中分别对幼铃造成不同程度的伤害。传统的花粉管通道法技术不易掌握，对经验的依赖性较高，导致实验结果有较为显著的偏差。农杆菌菌液喷雾法，只需要对准花柱柱头喷洒，然后轻轻绑花，操作简单，速度快，操作上几乎不会造成机械性损伤。

[0066] 2、PCR电泳检测

[0067] 基因组DNA提取

[0068] 1）取样品200mg研磨充分后放入2.0mL离心管中，加入800μL提取液（65℃预热），β-巯基乙醇40μL，65℃水浴10min；

[0069] 2）加入1／3体积5mol／L的KAC，水浴30~60min；

[0070] 3）平衡后离心（12000r／min室温离心10min），取上清液约500μL，加入1／5体积的裂解液约200μL，混匀后65℃水浴10~20min，室温冷却5min；

[0071] 4）加入500μL氯仿／异戊醇（体积比为24:1），轻轻混匀1min后，离心12000r／min，5min，取上清600μL；

[0072] 5）重复上一步；

[0073] 6）用70%乙醇洗涤2次，风干；

[0074] 7）TE（pH=8.0）溶解DNA。

[0075] 根据p53基因序列设计特异引物和探针，引物序列如下：

[0076] PCR正向引物：5’-GGTGAAATACTCGCCATCCAG-3’

[0077] PCR反向引物：5’-CCCTGTCGTCCTTTGTCCCT-3’

[0078] PCR扩增程序为94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；72℃，10min；35个循环。PCR反应体系如表2。

[0079] 表2用于鉴定转基因植株的PCR反应体系（25μL）

[0080]

[0081]

[0082] 以质粒和空白为正、负对照。琼脂糖凝胶电泳分析，检测的132株中有10株为阳性植株，转化率为7.6%。结果如图2所示，在716bp处有明显的目的条带，说明目的基因已经存在于转化体中。

[0083] 3、转化体的Southern杂交检测

[0084] 基因组DNA提取

[0085] 用上述方法提取转基因棉花新海24基因组DNA，取30μgDNA用于Southern杂交检测。

[0086] 探针的标记

[0087] 将1μg质粒PCAMB1300-p53:gfp模板加入灭菌去离子水至16μL，混匀。变性DNA模板，在95℃，10min（PCR仪中进行）或是煮沸10min，立即冰浴冷却。加4μL的Dig-High prime（vial 1），用灭菌去离子水补足到20μL，稍离心，37℃孵育20h，65℃处理10min，在-20℃保存。

[0088] DNA的酶切和电泳

[0089] 取将30μg棉花基因组DNA，用BamH Ⅰ于37℃酶切过夜，用1.0%琼脂糖凝胶电泳40V低压电泳8h至出现弥散条带。成像后在凝胶左上角切掉一小块，作为标记。

[0090] 尼龙膜的准备

[0091] 剪出一张长度和宽度均比琼脂糖凝胶大约1mm的尼龙膜，将膜浸泡于去离子水中，直至由上而下完全湿润，然后将其放入变性转移液（20×SSC）中5min，用刀子切去膜左上方的一角，使其和凝胶切角相对应。

[0092] 转膜

[0093] 将凝胶翻转使其背面朝下放于滤纸中央，注意保持滤纸湿润，滤纸与凝胶之间不能滞留气泡。凝胶上部再附一层滤纸，上面加500g重物，DNA片段过夜可完全转移到尼龙膜上。转膜结束后，取出滤膜，泡于2×SSC摇洗5min，取出后用滤纸吸干；然后用滤纸包住，外面再包一层锡箔纸，于80℃烤箱烘烤2h。

[0094] 预杂交和杂交

[0095] 首先将64mL灭菌去离子水加入到DIG EASY Hyb Granules中，37℃，温浴5min；将膜置于容器中，轻轻摇动预杂交30min。取探针加50μL双蒸水，沸水浴5min后迅速置于冰上。取5~7mL，42℃预热的DIG Easy Hyb Granule（3.5mL液／100cm2膜），轻轻混匀，将变性探针加入其中，防止气泡产生。倒去预杂交液，加入杂交液，杂交4h以上，摇床上50r／min轻轻晃动。

[0096] 洗膜

[0097] 将杂交完成的膜取出来，放入塑料盒中，用37℃低严谨洗膜液漂洗两次，每次15min；68℃，高严谨洗膜液两次，每次20min；室温下，50mL Washing Buffer漂洗10min；室温下，50mL封阻液Blocking Solution浸泡45min；室温下，10mL Antibody Solution浸泡
45min（用前10000r／min离心5min）；吸取适量表层液按1:5000加入Blocking Solution；
50mL Washing Buffer漂洗两次，每次20min。

[0098] 压片、放射自显影

[0099] 在黑暗中，将膜上滴加1mL的CSPD后，用保鲜膜包上，并压平保证里面没有气泡，放入夹子中；然后在暗室中将X光片压在膜上；扣紧夹子，放射自显影4h以上。取出X光片后，放入显影液中显影20s，置红光灯下看到明显的杂交带，立即拿出冲洗后放入定影液即可。

[0100] 为进一步鉴定目的基因是否单拷贝整合，对以上10个转化植株进行Southern杂交。部分结果如图3显示：3~9号和11号泳道均为单拷贝，10和13号泳道为双拷贝，12号泳道为三拷贝。结果表明，随机抽取的转化植株T1代后代中，单拷贝植株所占比例较多。农杆菌菌液喷雾法遗传稳定性相对较好。农杆菌菌液喷雾法同样利用农杆菌介导过程中根癌农杆菌Ti质粒这一有效天然载体的转化机理，常以低拷贝整合到棉花基因组中。因此，可得出农杆菌菌液喷雾法是一种稳定性较好且简单易行的转化方式。