[0001] 本发明涉及基因突变检测用探针。

[0002] “基因多态性”是指编码基因的碱基序列中的碱基变为与某个群体的大多数的性状不同的碱基，例如产生了单碱基取代、缺失、插入、基因融合等基因结构(碱基序列)的差异。

[0003] 另一方面，“基因多态性”是指作为“基因突变”的一部分的、某个群体中频率最高的突变或者等位基因(allele)为99％以下的状态，换言之，是指频率低的突变和/或等位基因的合计频率为1％以上的状态。该1％一值虽简单，但仍具意义。每代产生的大多数新的突变通过自然选择而从群体中被去除，因此可在逻辑上计算其平衡频率。将比该平衡频率高的值、1％作为“多态性”的基准。即，被视为多态性现象是指由于某种机理而导致群体中这些突变的频率变高并世代被维持的意思。

[0004] 已被指出基因突变与各种疾病的罹患率和/或由于施药而产生副作用的频率相关联，从而认为通过检测基因多态性，能够预测各种疾病发生频率和/或耐药性等。因此，人们期待正确且短时间、低成本地测定基因突变的方法。

[0005] 基因多态性和基因突变的种类中有由于碱基序列中的一个碱基被取代而产生的单碱基取代、缺失一个以上的碱基的缺失型突变、插入一个以上的碱基的插入型突变、或者基因融合等。以下，将基因多态性和基因突变统称为基因突变。

[0006] 目前，已知有下述测定基因突变的方法：将含有突变的区域用PCR法扩增之后，使用荧光染料标记的核酸探针与靶标核酸杂交，测定荧光染料的发光的减少量，并基于熔解曲线分析的结果来分析碱基序列的突变(参见特开2002-119291号公报)。

[0046] 本发明涉及的基因突变检测用探针包括从包括P1、P1-1、P1’及P1’-1的组中选择的至少一种寡核苷酸，用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的碱基序列中的该目标基因突变。

[0047] 由此，即使对基因进行编码的碱基序列含有多个基因突变，本发明涉及的基因突变检测用探针也不受检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。

[0048] 本发明涉及的基因突变检测方法包括：使用至少一种用于检测所述基因突变的基因突变检测用探针，即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变，也不受基因突变检测对象之外的基因突变的影响地进行检测。

[0049] 本发明涉及的基因突变检测用试剂盒含有用于检测目标基因突变的所述基因突变检测用探针。

[0050] 在本发明中，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、基因突变检测用探针或者引物的每个的碱基序列，基于它们的相互互补的关系所记述的事项，只要不特别指出，也分别适用于其互补碱基序列。在将特定碱基序列的说明适用于其互补碱基序列时，对由该特定的碱基序列识别的碱基序列的说明在本领域技术人员的技术常识的范围内应当如下地应用：视为由该特定碱基序列进行的识别被替换成该特定碱基序列的互补碱基序列进行的识别。

[0051] 在本发明中，“Tm值”是双链核酸解离的温度(解离温度：Tm)，一般定义为260nm处的吸光度由于双链核苷酸的完全解离而导致总吸光度增加50％时的温度。即，当加热含有双链核酸、例如双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度逐渐上升。这是因为双链DNA中的双链间的氢键通过加热而断裂，解离(DNA的熔解)成单链DNA。并且，当双链DNA全部解离形成单链DNA时，其吸光度显示加热开始时的吸光度(当全部DNA为双链DNA的形式时的吸光度)的约1.5倍左右，由此能够判断熔解完成。Tm值基于该现象来设定。

[0052] 在本发明中，关于寡核苷酸的序列，当称为“从3’末端起数的第1～3位”时，假定寡核苷酸链的3’末端的碱基为从3’末端起第1位碱基。同样地，当称为“从5’末端起数第1～3位”时，假定寡核苷酸链的5’末端的碱基为从5’末端起第1位碱基。

[0053] 在本说明书中，“步骤”一词不仅包含独立的步骤，也包含哪些不能与其他的步骤明确区别但达到了本步骤预期的效果的过程。

[0054] 在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示将“～”前后记载的数值分别作为最小值和最大值包含的范围。

[0055] 另外，在本发明中，组成物中的各成分的量在组成物中存在多种相当于各成分的物质的情况下只要不特别指出就是指组成物中存在的该多种物质的合计量。

[0056] 下面说明本发明。

[0057] <基因突变检测用探针>

[0058] 本发明涉及的基因突变检测用探针包括从包括下述P1、P1-1、P1’和P1’-1的组中选择的至少一种寡核苷酸，并用于检测对含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因进行编码的碱基序列中的该目标基因突变。

[0059] 由此，即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变，本发明涉及的基因突变检测用探针也不受检测对象之外的基因突变的影响地特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。

[0060] (P1)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列具有至少80％以上的同一性；

[0061] (P1-1)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基，而且其与和编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交；

[0062] (P1’)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其相对于与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分具有至少80％以上的同一性；以及

[0063] (P1’-1)寡核苷酸，其在对应于所述目标基因突变的碱基位置处具有与所述目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基，并且在对应于所述非目标基因突变的碱基位置处具有与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基，而且其与具有和编码所述对象基因的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸在严谨条件下杂交。

[0064] 本发明中“对应于目标基因突变的碱基位置”是指与当寡核苷酸的碱基序列与含有目标基因突变和非目标基因突变的试样碱基序列以使它们之间最匹配的方式进行比对时，寡核苷酸中与试样碱基序列中的目标基因突变的碱基位置相对应的碱基位置。

[0065] 腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)分别形成氢键。AT对形成两个氢键，而GC对形成三个氢键。也就是说在“A-T之间”、“G-C之间”形成氢键，并维持双螺旋结构。在这些碱基之外的碱基的组合中不能形成足以维持双螺旋结构的氢键。

[0066] 例如，在试样核酸中所含的非目标基因突变的碱基位置处的野生型和突变型的碱基的组合为A和T的组合、并且基因突变检测探针中与非目标基因突变的野生型和突变型均不互补的碱基为C或G的情况下，则非目标基因突变的突变型碱基和非目标基因突变中的野生型碱基(从A和T中选择的碱基)与跟非目标基因突变中的突变型碱基和非目标基因突变中的野生型碱基均非互补的碱基(C或G)不形成氢键，因此，该基因突变检测用探针的Tm值不受非目标基因突变的影响。另一方面，若将基因突变检测用探针中与非目标基因突变的野生型和突变型均不互补碱基替换成A，则该碱基在非目标基因突变的碱基位置处的碱基为A时试样核酸中的非目标基因突变的碱基位置处的碱基不形成氢键，而在非目标基因突变的碱基位置处的碱基为T的情况下形成氢键。在这种状况下，该基因突变检测用探针的Tm值不仅受到目标基因突变的影响，而且也受到非目标基因突变的影响，从而在使用该本发明的范围之外的基因突变检测用探针的情况下，不能适当地检测目标基因突变的状态。

[0067] 如此，在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中使用与和该碱基序列互补的碱基序列具有同源性的基因突变检测用探针来检测目标基因突变的情况下，通过将探针上对应于非目标基因突变的碱基位置处的碱基设为与该非目标基因突变的正常型和突变型中任何一者均不结合的碱基(非互补的碱基)，能够避免受到非目标基因突变的影响。本发明涉及的包括所述(P1)或(P1-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针能够不受非目标基因突变的碱基位置处的碱基型的影响而特异性地检测目标基因突变。

[0068] 同样地，在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中使用相对于与该碱基序列相同的碱基序列具有同源性的基因突变检测用探针来检测目标基因突变的情况下，通过将探针上对应于非目标基因突变的碱基位置处的碱基设为与该非目标基因突变的正常型和突变型中任何一者均不同的碱基(不同的碱基)，能够避免受到非目标基因突变的影响。本发明涉及的包括所述(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针能够不受非目标基因突变的碱基位置处的碱基型的影响而特异性地检测目标基因突变。

[0069] 本发明涉及的基因突变检测用探针能够识别包括单碱基取代型、缺失型以及插入型在内的突变中的任意一种突变。其中，从检测灵敏度的观点来说，本发明涉及的基因突变检测用探针作为识别单碱基取代型的突变(单碱基突变)的基因突变检测用探针尤其有用。

[0070] 本发明涉及的(P1)或(P1-1)寡核苷酸是除了对应于非目标基因突变的碱基位置处之外，相对于与编码含有目标基因突变的基因的碱基序列互补的碱基序列具有同源性的寡核苷酸。

[0071] 另一方面，(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸为除了对应于非目标基因突变的碱基位置处之外，相对于与编码含有目标基因突变的基因的碱基序列相同的碱基序列具有同源性的寡核苷酸。

[0072] 公知的所有基因均可以应用于本发明涉及的对象基因。另外，本发明的对象基因中含有结构基因和转录调控区中的某个。

[0073] 在本说明书中，转录调控区是指广泛存在于基因信号序列的5’上游区域(也可以存在于第一内含子)的序列，是在RNA聚合酶从基因转录RNA时控制其转录的序列。

[0074] 另外，在结构基因中，外显子的位点或内含子的位点可以存在基因突变。在更具体的实施例中，基因突变也可以存在于外显子的位点。

[0075] 在本发明中“具有同源性”例如可以是编码本发明的基因突变检测用探针的碱基序列和“与编码所述对象基因的碱基序列的全部或部分互补的碱基序列”之间具有80％～100％的同源性的寡核苷酸。另外，从检测灵敏度的观点来说，可以显示85％以上的同一性、
90％以上的同一性、95％以上的同一性、96％以上的同一性、97％以上的同一性、98％以上的同一性或者99％以上的同一性。

[0076] 如果同源性为80％以上，则针对含有包含作为检测对象的目标基因突变的对象基因的试样核酸的检测灵敏度变得良好。

[0077] 在一实施例中，根据本发明的P1或P1-1寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的部分碱基序列互补(完全互补)。在另一实施例中，根据本发明的P1或P1-1寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的全部碱基序列互补。

[0078] 在一实施例中，根据本发明的P1’或P1’-1寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的部分碱基序列相同。在另一实施例中，根据本发明的P1’或P1’-1寡核苷酸除了对应于非目标基因突变的碱基位置、以及可选地除了对应于目标基因突变的碱基位置之外，与编码含有目标基因突变和非目标基因突变的对象基因的全部碱基序列相同。

[0079] 下面说明本发明中的“在严谨条件下杂交”。

[0080] 杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如可以根据Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过参考被并入本说明书中。

[0081] 严谨条件是指发生特异性杂交而形成杂交体但非特异性杂交不发生的条件。典型的严谨条件是指，例如可以举出在钾浓度为约25mM～约50mM、以及镁浓度为约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的示例，例如可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、
25mM的KCl、以及1.5mM的MgCl2下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严谨条件被记载在Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过参考被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择上述条件。

[0082] 以下说明本发明涉及的(P1)、(P1-1)、(P1’)和(P1’-1)的寡核苷酸。根据需要，以序列编号1或序列编号2所示的碱基序列为例进行说明，但是本发明涉及的(P1)、(P1-1)、(P1’)和(P1’-1)的寡核苷酸不限于此。

[0083] 序列编号1所示的 碱基序列为对药 物代谢酶CYP3A4的基因突 变(CYP3A4*1Brs2740574)进行编码的碱基序列。对CYP3A4进行编码的CYP3A4基因位于人的第7染色体。CYP3A4基因突变例如被报告与免疫抑制剂他克莫司(Tacrolimus)等药物代谢相关联(Clin.Pharmacol.Ther.，2006年，Vol.80，p.179-191)。因此，CYP3A4基因的突变的检测结果在选择更有效的疾病治疗方法时等是极其重要的信息。

[0084] 这里，作为CYP3A4基因突变的rs2740574在序列编号1的第501位碱基处具有突变碱基。该rs编号表示National Center for Biotechnology Information的dbSNP数据库(//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)的登录编号(以下相同)。在CYP3A4基因的野生型中，与序列编号1所示的碱基序列的第501位对应的碱基为A(腺嘌呤)，在突变型中突变为G(鸟嘌呤)。

[0085] 序列编号2所示的碱基序列示出了用于检测序列编号1所示的碱基序列中第501位的目标基因突变的、本发明涉及的基因突变检测用探针的示例。

[0086] 本发明中的、编码对象基因的碱基序列含有多个基因突变。具体地，编码所述对象基因的碱基序列含有两个以上的基因突变，例如可以含有三个基因突变、四个基因突变。

[0087] 在编码对象基因的碱基序列中所含的多个基因突变中，可以根据需要从编码对象基因的碱基序列中适当选择目标基因突变。例如，在编码序列编号1的CYP3A4基因的碱基序列中，可以将第501位的基因突变选择为作为检测对象的目标基因突变。因此，以序列编号1为例，本发明涉及的“目标基因突变的突变型碱基”为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)，本发明涉及的“目标基因突变的野生型碱基”为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)中的另一者。

[0088] 在(P1)或(P1-1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，T(胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)对应于“对应于目标基因突变的碱基位置处的、与目标基因突变的碱基的野生型和突变型中任意一者互补的碱基”。

[0089] 在(P1)或(P1-1)寡核苷酸的示例中，以序列编号1所示的碱基序列为例，序列编号1所示的碱基序列的第507位的R对应于“非目标基因突变的突变型碱基”。第507位碱基位置处，R在野生型中为A(腺嘌呤)，在突变型中突变成了G(鸟嘌呤)。

[0090] 在(P1)或(P1-1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)对应于“对应于非目标基因突变的碱基位置处的、与非目标基因突变的碱基的野生型和突变型中任何一者均非互补的碱基”。

[0091] 在(P1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，与由编码CYP3A4基因的碱基序列中的第496位～第516位的碱基形成的碱基序列互补的碱基序列对应于“与编码所述对象基因的碱基序列互补的碱基序列”。

[0092] 在(P1-1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，具有与由编码CYP3A4基因的碱基序列中的第496位～第516位的碱基形成的碱基序列相同碱基序列的寡核苷酸对应于“与编码所述对象基因的碱基序列具有相同碱基序列的寡核苷酸”。

[0093] 在(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)对应于“与目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基”。

[0094] 在(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸中，以序列编号1所示的碱基序列为例，T(胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)对应于“与非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基”。

[0095] 关于(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸的与(P1)或(P1-1)寡核苷酸共同的除上述以外的方面，适用对所述(P1)或(P1-1)寡核苷酸描述的所有事项。

[0096] 此外，目标基因突变的碱基位置处的碱基是一个野生型的碱基和一个突变型的碱基的情况、是一个野生型的碱基和两个突变型的碱基的情况、以及是一个野生型的碱基和三个突变型的碱基的情况中的任意情况均被包括在本发明的“目标基因突变”中。

[0097] 本发明中的(P1)、(P1-1)、(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸可以举出满足下述(a)至(f)中任一关系的寡核苷酸。

[0098] (a)在所述非目标基因变异为从A和T中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基或所述不同的碱基为C或G。即，在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和T中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和T中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为C或G。

[0099] (b)在所述非目标基因变异为从C和G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基或所述不同的碱基为A或T。即，在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为C和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为C和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或T。

[0100] (c)在所述非目标基因变异为从A和C中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为A或C，所述不同的碱基为T或G。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为A和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或G。

[0101] (d)在所述非目标基因变异为从A至G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为A或G，所述不同的碱基为T或C。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为从A和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为A和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基或者与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为T或C。

[0102] (e)在所述非目标基因变异为从T和C中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为T或C，所述不同的碱基为A或G。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和C中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和C中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基所述非互补的碱基为T或C，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或G。

[0103] (f)在所述非目标基因变异为从T和G中选择的碱基的情况下，所述非互补的碱基为T或G，所述不同的碱基为A或C。在所述非目标基因突变的碱基位置的野生型碱基为T和G中的一者，并且所述非目标基因突变的突变型碱基为T和G中的另一者的情况下，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均非互补的碱基为T或G，与所述非目标基因突变的野生型碱基和突变型碱基中任何一者均不同的碱基为A或C。

[0104] 另外，本发明中的寡核苷酸中也包含通过插入、缺失或取代了至少一个碱基来修饰所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸而获得的寡核苷酸。

[0105] 通过插入、缺失或取代了至少一个碱基来修饰所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸而获得的寡核苷酸只要显示与所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸同等程度的作用即可。在插入、缺失或取代了碱基的情况下，该插入、缺失或取代的位置无特别限定。作为插入、缺失或取代了的碱基的数量，可以举出一个碱基或两个碱基以上，根据寡核苷酸全体的长度而不同，例如可以举出1碱基～10碱基或1碱基～5碱基。

[0106] 作为本发明的所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸的长度，可以举出为11mer～60mer的情况。在为该范围的情况下，基因突变的检测灵敏度变得良好。

[0107] 另外，作为本发明的所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸的长度，可以为12mer～55mer、15mer～45mer、或18mer～40mer。能够设置为12mer～55mer的范围。
由此，例如有检测灵敏度变高等的倾向。

[0108] 另外，通过改变所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸的碱基长，例如能够将所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸与其互补链(靶标序列)所形成的杂交体的解离温度、即Tm值调节至期望的值。

[0109] 以下，对用于设计本发明的基因突变检测用探针的方法，举出具体例进行说明。但是，本发明不限于这些。

[0110] 序列编号3所示的碱基序列为含有rs20542的序列。在序列编号3所示的碱基序列中，含有第251位碱基的目标基因突变和其附近的第256位碱基的非目标基因突变。

[0111] 在这种情况下，在相当于所述(P1)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第251位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为P1或P1-1中对应碱基位置处的碱基，而将第256位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。

[0112] 具体地，在表1中，可举出序列编号4或序列编号5所示的基因突变检测用探针。

[0113] 另外，在相当于所述(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第251位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为P1’或P1’-1中对应碱基位置处的碱基，而将第256位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。

[0114] 具体地，在表1中，可举出序列编号6或序列编号7所示的基因突变检测用探针。

[0115] 通过使用所得到的序列编号4～序列编号7所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当检测有无序列编号3所示的碱基序列中的第251位的目标基因突变时，即使在该第251位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该第251位的目标基因突变。

[0116] 在表1中，带下划线的大写字母表示作为检测对象的目标基因突变，未带下划线的大写字母表示非目标基因突变。以下相同。

[0117] 表1

[0118]序列编号4 (荧光染料)-cTccagCagggcgagga
序列编号5 (荧光染料)-cAccagCagggcgagga
序列编号6 (荧光染料)-cctcgccctActggAgct
序列编号7 (荧光染料)-cctcgccctActggTgct

[0119] 序列编号8所示的碱基序列为含有rs11881222的序列。在序列编号8所示的碱基序列中，含有第355位中的目标基因突变和其附近的第364位的非目标基因突变。

[0120] 在这种情况下，在相当于所述(P1)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第355位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为P1或P1-1中对应碱基位置处的碱基，而将第364位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表2中，可以举出序列编号9或序列编号10所示的基因突变检测用探针。

[0121] 另外，在相当于所述(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第355位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为P1’或P1’-1中对应碱基位置处的碱基，而将第364位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表2中，可举出序列编号11或序列编号12所示的基因突变检测用探针。

[0122] 通过使用所得到的序列编号9～序列编号12所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当检测有无序列编号8所示的碱基序列中的第355位的目标基因突变时，即使在该第355位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该355位的目标基因突变。

[0123] 表2

[0124]序列编号9 tccAtctctcctCtcccc-(荧光染料)
序列编号10 tccGtctctcctCtcccc-(荧光染料)
序列编号11 gggaGaggagagaTggac-(荧光染料)
序列编号12 gggaGaggagagaCggac-(荧光染料)

[0125] 序列编号13所示的碱基序列为含有rs80230660的序列。在序列编号13所示的碱基序列中，含有第201位的目标基因突变和其附近的第187位的非目标基因突变。

[0126] 在这种情况下，在相当于所述(P1)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第201位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为P1或P1-1中对应碱基位置处的碱基，而将第187位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基具体地，在表3中，可举出序列编号14或序列编号15所示的基因突变检测用探针。

[0127] 另外，在相当于所述(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第201位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为P1’或P1’-1中对应碱基位置处的碱基，而将第187位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表3中，可举出序列编号16或序列编号17所示的基因突变检测用探针。

[0128] 通过使用所得到的序列编号14～序列编号17所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当在序列编号13所示的碱基序列中检测有无第201位的目标基因突变时，即使在该第201位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该第201位的目标基因突变。

[0129] 表3

[0130]序列编号14 gctGccccaggaagacaCcaac-(荧光染料)
序列编号15 gctGccccaggaagacaGcaac-(荧光染料)
序列编号16 ttgCtgtcttcctggggCagcccc-(荧光染料)
序列编号17 ttgGtgtcttcctggggCagcccc-(荧光染料)

[0131] 在序列编号13所示的碱基序列中，含有第187位的目标基因突变和其附近的第201位的非目标基因突变。

[0132] 在这种情况下，在相当于所述(P1)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第187位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为P1或P1-1中对应碱基位置处的碱基，而将第201位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表4中，可举出序列编号18所示的基因突变检测用探针。

[0133] 另外，在相当于所述(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针中，将第187位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为P1’或P1’-1中对应碱基位置处的碱基，而将第201位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表4中，可举出序列编号19所示的基因突变检测用探针。

[0134] 通过使用所得到的序列编号18或序列编号19所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当检测有无序列编号13所示的碱基序列中的第187位的目标基因突变时，即使在该第187位的碱基的附近存在非目标基因突变的情况下，也能够特异性地检测有无该187位的目标基因突变。

[0135] 表4

[0136]序列编号18 ctAccccaggaagacaTcaac-(荧光染料)
序列编号19 tgAtgtcttcctggggGagcc-(荧光染料)

[0137] 序列编号20所示的碱基序列为含有rs74182491的序列。在序列编号20所示的碱基序列中，含有第247位的目标基因突变和其附近的第251位的非目标基因突变。

[0138] 在这种情况下，相当于所述(P1)或(P1-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针，将第247位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者互补的碱基选择作为P1或P1-1中对应碱基位置处的碱基，而将第251位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不互补的碱基，选择作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表5中，可举出序列编号21或序列编号22所示的基因突变检测用探针。

[0139] 另外，相当于所述(P1’)或(P1’-1)的寡核苷酸的基因突变检测用探针，将第247位的碱基处与野生型碱基和突变型碱基中任意一者相同的碱基选择作为P1’或P1’-1中对应碱基位置处的碱基，而将第251位碱基处与非目标基因突变的野生型碱基或突变型碱基均不同的碱基，选择作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基。具体地，在表5中，可举出序列编号23或序列编号24所示的基因突变检测用探针。

[0140] 通过使用所得到的序列编号21～序列编号24所示的基因突变检测用探针中的任意一种探针，当在序列编号20所示的碱基序列中检测有无第247位的目标基因突变时，即使在该第247位的碱基附近存在非目标基因突变的情况下，也可以特异性地检测有无该第247位的目标基因突变。

[0141] 表5

[0142]序列编号21 ggtTgccAtgtgactttc-(荧光染料)
序列编号22 ggtGgccAtgtgactttc-(荧光染料)
序列编号23 aagtcacaTggcAacc-(荧光染料)
序列编号24 aagtcacaTggcCacc-(荧光染料)

[0143] 此外，不仅在存在于目标基因突变的附近的非目标基因突变为上述那样的单碱基取代突变的情况，而且在存在缺失型突变或插入型突变的情况下，根据本发明也能够提供检测灵敏度高的基因突变检测用探针。

[0144] 在非目标基因突变为缺失型突变的情况下，选择与缺失的碱基非互补的碱基作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1或P1-1中位于对应于缺失的碱基的碱基位置处的碱基)，除此之外通过按照上述的方法，能够获得相当于本发明涉及的(P1)或(P1-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针。具体地，在缺失了A的突变的情况下，P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1或P1-1中位于对应于缺失的碱基A的碱基位置处的碱基)可以为从与A非互补的碱基的A、C和G中选择的碱基的至少一种碱基。

[0145] 同样地，在非目标基因突变为缺失型突变的情况下，选择与缺失的碱基不同的碱基作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1’或P1’-1中位于对应于缺失的碱基的碱基位置处的碱基)，除此之外，通过按照上述的方法，能够获得相当于本发明涉及的(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针。具体地，在缺失了A的情况下，P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1’或P1’-1中位于对应于缺失的碱基A的碱基位置处的碱基)可以为从作为与A不同的碱基的G、T和C中选择的碱基的至少一种碱基。

[0146] 在非目标基因突变为插入型突变的情况下，选择与插入的碱基非互补的碱基作为P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1或P1-1中位于对应于插入的碱基G的碱基位置处的碱基)，除此之外，通过按照上述的方法，能够获得相当于本发明涉及的(P1)或(P1-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针。具体地，在插入了G的情况下，P1或P1-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1或P1-1中位于对应于插入的碱基G的碱基位置处的碱基)可以为从作为与G非互补的碱基的A、T和G中选择的碱基的至少一种碱基。

[0147] 同样地，在非目标基因突变为插入型突变的情况下，选择与插入的碱基不同的碱基作为P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1’或P1’-1中位于对应于缺失的碱基的碱基位置处的碱基)，除此之外，通过按照上述的方法，能够获得相当于本发明涉及的(P1’)或(P1’-1)寡核苷酸的基因突变检测用探针。具体地，在插入了G的情况下，P1’或P1’-1寡核苷酸中的对应碱基位置的碱基(即，P1或P1-1中位于对应于插入的碱基G的碱基位置处的碱基)可以为从作为与G不同的碱基的A、T和C中选择的碱基的至少一种碱基。

[0148] 本发明的P1、P1-1、P1’或P1’-1可以是荧光标记寡核苷酸。所述荧光标记寡核苷酸例如也可以是与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。其中，可以是与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。这种利用了荧光淬灭现象(Quenching phenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe(注册商标)。其中，也可以是如下的寡核苷酸：以使3’末端或5’末端为胞嘧啶(C)的方式设计寡核苷酸，并用荧光染料标记该末端的C使其靠近G时发光变弱。

[0149] 除了使用Q Probe的检测方法之外，也可以应用公知的检测方式。作为这种检测方式，可举出Taq-man探针法、杂交探针(Hybridization Probe)法、分子信标(Molecular Beacon)法或MGB探针法等。

[0150] 作为所述荧光染料无特别限制，例如可以为荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。这些荧光染料的市售产品例如有Pacific Blue、BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3和Cy5、TAMRA等。

[0151] 所述荧光标记寡核苷酸的检测条件无特别限制，可以根据使用的所述荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在波长445～480nm下检测，TAMRA能够在波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在波长520～555nm下检测。

[0152] 如果使用具有这种荧光染料的探针，则能够根据各个荧光信号的变动来容易地确认杂交和解离。可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报等中记载的方法，来将所述荧光染料结合至寡核苷酸。

[0153] 另外，所述荧光标记寡核苷酸例如也可以在3′末端添加有磷酸基。通过在所述荧光标记寡核苷酸的3’末端添加磷酸基，能够充分抑制探针自身由于基因扩增反应而延长。如后面所述，检测有无突变的DNA(靶标DNA)可以通过PCR等基因扩增法来制备。此时，通过使用在3’末端添加了磷酸基的荧光标记寡核苷酸，能够使即使扩增反应的反应也中存在寡核苷酸，也能够进行扩增反应。另外，通过在所述探针的3’末端例如添加前述那样的标记物质(荧光染料)，也能够得到同样的效果。

[0154] 所述P1、P1-1、P1’或P1’-1寡核苷酸能够用作如下的基因突变检测用探针：即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变，也不受检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。

[0155] 另外，所述基因突变检测用探针能够用作熔解曲线分析用的探针。

[0156] <引物>

[0157] 在后述的本发明涉及的基因突变检测方法中，当通过PCR法扩增含有作为检测对象的目标基因突变的序列时，使用引物。

[0158] 在本发明中可以使用的引物只要能够扩增含有作为检测对象的目的基因的基因突变的位点、例如含有与序列编号1所示的碱基序列中的第501位的碱基和第507位的碱基对应的碱基的核酸，则无特别限制。

[0159] 应用于PCR法的引物只要能够扩增本发明的基因突变检测用探针能够杂交的区域则无特别限制，例如对于本领域技术人员而言，能够基于序列编号1所示的碱基序列而适当设计。引物的长度和Tm值通常可以设为12mer～40mer和40℃～70℃、或16mer～30mer和55℃～60℃。

[0160] 另外，虽然引物对的各引物的长度可以不同，但是两引物的Tm值可以基本相同(或者两引物之间的Tm值之差为5℃以内)。

[0161] 基因突变的检测方法只要是将所述荧光标记核苷酸作为探针使用的方法则无特别限制。作为将所述P1、P1-1、P1’或P1’-1的寡核苷酸作为探针使用的基因突变检测方法的示例，以下对利用了Tm分析的基因突变检测方法进行说明。

[0162] <基因突变检测方法>

[0163] 本发明涉及的基因突变检测方法是一种基因突变检寡核苷酸测方法，其包括：使用至少一种含有所述荧光标记了的P1、P1-1、P1’或P1’-1的基因突变检测用探针(以下也称“被荧光标记的基因突变检测用探针”)来检测基因突变。

[0164] 通过本发明涉及的基因突变检测方法，可以通过包括至少一种所述荧光标记了的基因突变检测用探针来简便、高灵敏度地检测基因突变。

[0165] 另外，本发明的基因突变检测方法可以用作检测各种人类基因的基因突变的检测方法，能够包括下述步骤(I)～(IV)，也可以含有下述步骤(V)。此外，本发明的基因突变检测方法的特征在于使用所述基因突变检测用探针，其他的结构和条件等不限于以下的记载。

[0166] (I)使所述荧光标记了的基因突变检测用探针和试样中的单链核酸接触，来获得杂交体。

[0167] (II)通过改变含有所述杂交体的试样的温度，来使所述杂交体解离，并测定基于所述杂交体的解离的荧光信号的变动。

[0168] (III)基于所述荧光信号的变动来测定杂交体的解离温度，即Tm值。

[0169] (IV)基于所述Tm值来检测所述试样中的单链核酸中的、目标基因突变的存在。

[0170] (V)基于基因突变的存在，确定所述试样中所含的总体的单链核酸中具有基因突变的单链核酸中的丰度比。

[0171] 另外，在本发明中，除了所述步骤(I)～(IV)或所述步骤(I)～(V)之外，还可以包括在获得步骤(I)的杂交体之前或者与获得步骤(I)的杂交体的同时扩增核酸。

[0172] 此外，在所述(III)中测定Tm值时，例如，不仅测定杂交体的解离温度，还可以包括测定在杂交形成体熔解时根据温度而变动的荧光信号的微分值的大小。

[0173] 在本发明中，所述试样中的核酸可以是单链核酸也可以是双链核酸。

[0174] 在所述核酸为双链核酸的情况下，例如可以包括：在与所述荧光标记了的寡核苷酸杂交之前，通过加热使所述试样中的双链核酸熔解(解离)成单链核酸。通过将双链核酸解离成单链核酸，可与所述荧光标记了的基因突变检测用探针进行杂交。

[0175] 在本发明中，作为检测对象的试样中包含的核酸例如可以是生物试样中本来含有的核酸，但也可以是以生物试样中本来含有的核酸为模板、通过PCR等扩增含有突变了的位点的目标基因的区域而得到的扩增产物，因为这样能够提高检测精度。所述扩增产物的长度无特别限制，例如可以设为50mer～1000mer或者80mer～200mer。另外，试样中的核酸例如可以是从源自生物试样的RNA(总RNA、mRNA等)通过RT-PCR(Reverse Transcription PCR)合成的cDNA。

[0176] 在本发明中，本发明的基因突变检测探针相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)无特别限制。相对于试样中的DNA，例如可以为1倍以下。另外，从充分确保检测信号的观点来说，可以将本发明的基因突变检测相对于所述试样中的核酸的添加比例(摩尔比)设为0.1倍以下。

[0177] 这里，试样中的核酸例如可以是发生了检测目标基因突变的检测对象核酸和未发生所述基因突变的非检测对象核酸的合计，也可以是含有发生了检测目标基因突变的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述基因突变的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的核酸中的所述检测对象核酸的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)可使所述基因突变检测探针的添加比例(摩尔比)为10倍以下。另外，可以将所述基因突变检测探针的添加比例(摩尔比)相对于检测对象核酸(含有检测对象序列的扩增产物)，设为5倍以下或3倍以下。另外，其下限无特别限制，但是可以设为0.001倍以上，0.01倍以上或0.1倍以上。

[0178] 本发明的被荧光标记的基因突变检测用探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链核酸的摩尔比，也可以是相对于单链核酸的摩尔比。

[0179] 在本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定也可以基于前述那样的原理，通过测定260nm的吸光度来进行，但假定测定如下信号：所述信号是基于所述荧光标记了的基因突变检测探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据单链DNA与所述基因突变检测探针的杂交体的形成程度而变动。因此，可以使用前述的荧光标记寡核苷酸来作为所述荧光标记了的基因突变检测探针。作为被荧光标记的P1、P1-1、P1’或P1’-1寡核苷酸(以下，也总称“荧光标记寡核苷酸”。)，例如可举出与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸、或者与靶标序列杂交时的荧光强度比未与靶标序列杂交时的荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸。

[0180] 如果是前者那样的荧光标记寡核苷酸，则在荧光标记寡核苷酸与检测对象序列形成了杂交体(双链DNA)时，不显示荧光信号或荧光信号弱，但通过加热而荧光标记寡核苷酸解离时就会显示荧光信号或者荧光信号增加。

[0181] 另外，如果是后者的荧光标记寡核苷酸，则通过荧光标记寡核苷酸与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示荧光信号，通过加热而荧光标记寡核苷酸解离时荧光信号减少(消失)。因此，通过在荧光标记特有的条件(荧光波长等)下检测基于该荧光标记的荧光信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地，监视熔解的过程以及Tm值。

[0182] 接着，关于本发明的多态性检测方法，举出检测基于来自荧光染料的信号的信号的变化的方法的具体例来进行说明。此外，使用所述荧光标记了的基因突变检测用探针这本身即为本发明的多态性检测方法的特征，其他的步骤和条件没有任何限制。

[0183] 作为含有进行核酸扩增时的模板的试样，只要是含有核酸尤其是目标基因即可，无特别限制。例如可以举出大肠或肺等的组织、白血球细胞等血球、全血、血浆、吐出的痰、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、尿、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。此外，试样的采集方法、含有核酸的试样的制备方法等无特别限制，均可采用现有的公知方法。另外，作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经前处理之后使用。

[0184] 例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。

[0185] 接着，向含有分离出的基因组DNA的试样中添加含有所述荧光标记寡核苷酸的被荧光标记的基因突变检测用探针。

[0186] 所述荧光标记了的基因突变检测用探针可以添加到含有分离出的基因组DNA的液体试样中，也可以在适当的溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特别限制，例如可以是Tris-HCl等缓冲液、含有KCl、MgCl2、MgSO4、甘油等的溶剂、PCR反应液等目前公知的溶剂。

[0187] 所述荧光标记了的基因突变检测用探针的添加时机无特别限制，例如在进行后述的PCR等扩增处理的情况下，可以在扩增处理之后添加到PCR扩增产物中，也可以在扩增处理前添加。

[0188] 在如此利用PCR等进行扩增处理前添加所述荧光标记了的基因突变检测用探针的情况下，例如，如前所述，优选在该检测用探针的3’末端添加荧光染料，或者添加磷酸基。

[0189] 作为核酸扩增的方法，例如可以为利用聚合酶的方法等。作为其示例，有PCR法、ICAN法、LAMP法、NASBA法等。作为通过使用聚合酶的方法进行扩增的情况的示例，可以在本发明的被荧光标记的基因突变检测用探针存在的情况下进行扩增。根据使用的被荧光标记的基因突变检测用探针和聚合酶来调节扩增的反应条件等，这对于本领域技术人员来说是容易的。由此，在核酸扩增后分析被荧光标记的基因突变检测用探针的Tm值即能检测基因突变，因此在反应结束之后不需要分离扩增产物。由此，不用担心扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器，容易自动化。

[0190] 另外，作为使用于PCR法的DNA聚合酶，无特别限制，可以使用通常所用的DNA聚合酶。例如可以为GeneTaq(NIPPON GENE公司制)、PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。

[0191] 作为聚合酶的使用量，可以采用通常使用的浓度，无特别限制。例如，在使用Taq聚合酶的情况下，相对于反应溶液量50μl，例如可以为0.01U～100U的浓度。由此，具有目标基因突变的检测灵敏度变高等的倾向。

[0192] 另外，PCR法可以通过适当选择通常所用的条件来进行。

[0193] 此外，在扩增时，例如也可以通过实时PCR来监视扩增，调查试样中包含的DNA(检测对象序列)的拷贝数。即，随着DNA(检测对象序列)通过PCR而扩增，形成杂交体的探针的比例增加，因此荧光强度发生变动。通过对此进行监视，能够检测试样中包含的检测对象序列(正常DNA或突变DNA)的拷贝数或丰度比。

[0194] 在本发明的多态性检测方法中，使所述荧光标记寡核苷酸和试样中的单链核酸接触，来使两者杂交。试样中的单链核酸例如可以通过将前述那样得到的PCR扩增产物解离而制备。

[0195] 所述PCR扩增产物解离(解离步骤)时的加热温度只要是所述扩增产物能够解离的温度即可，无特别限制。所述温度例如为85～95℃。加热时间也无特别限制。加热时间例如可以为1秒～10分钟，或1秒～5分钟。

[0196] 另外，解离的单链DNA与所述荧光标记寡核苷酸的杂交例如可以在所述解离步骤之后通过降低所述解离步骤中的加热温度来进行。温度条件例如为40～50℃。

[0197] 杂交步骤的反应液中各组成的体积和浓度无特别限制。作为具体例，所述反应液中的DNA的浓度例如可以为0.01μM～1μM，或0.1μM～0.5μM。所述荧光标记寡核苷酸的浓度例如是满足相对于所述DNA的添加比例的范围，例如可以为0.001μM～10μM，或0.001μM～1μM。

[0198] 然后，将所得到的所述单链DNA与所述荧光标记寡核苷酸的杂交体慢慢加热，测定随温度上升的荧光信号的变动。例如，当使用了Q Probe时，在与单链DNA杂交了的状态下，与解离的状态相比荧光强度减少(或淬灭)。因此，例如将荧光减少(或淬灭)的杂交体慢慢加热并测定随温度上升的荧光强度的增加即可。

[0199] 对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温～85℃，或25～70℃。结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。

[0200] 接着，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dT)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，也可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在标记探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。

[0201] 另外，在本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(优选荧光强度的增加)，但替代该方法，例如也可以检测杂交体形成时的信号变动。即，可以检测在降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体时随所述温度下降的荧光信号变动。

[0202] 作为具体例，在使用Q Probe的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热了的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。

[0203] 另一方面，在使用由于杂交体形成而信号增加的标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但当由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。

[0204] 作为在单一体系中检测多个基因突变的方法，无特别限制。例如，可以预先混合能够检测基因突变的各个探针，并添加到试样中，也可以将能够检测基因突变的各个探针连续添加到含有单链核酸的试样中。

[0205] 这里，“体系”是指由含有荧光标记寡核苷酸和单链核酸所杂交的杂交体的试样形成的一个独立的反应体系。

[0206] <基因突变检测用试剂盒>

[0207] 本发明的基因突变检测用试剂盒含有上述的基因突变检测用探针。

[0208] 该基因突变检测用试剂盒含有至少一种即使编码基因的碱基序列含有多个基因突变、也能够不受检测对象之外的基因突变的影响而特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变的上述基因突变检测用探针，由此具有能够更简便地进行基因突变的检测的倾向。

[0209] 在含有两种以上的寡核苷酸作为基因突变检测用探针的情况下，各个寡核苷酸既可以以被混合的状态被包含，也可以单独被包含。

[0210] 两种以上的所述荧光标记寡核苷酸也可以用发光波长互不相同的荧光染料被标记。

[0211] 如此通过改变荧光染料的种类，即使在单一反应体系中，也可以同时进行每个荧光标记寡核苷酸的检测。

[0212] 另外，本发明的基因突变检测用试剂盒还可以含有用于扩增具有与所述基因突变检测用探针杂交的区域的碱基序列的引物。

[0213] 此外，关于多态性检测用试剂盒中可以含有的探针和引物，可以直接适用前述的事项。

[0214] 另外，本发明的基因突变检测用试剂盒除了所述基因突变检测用探针和所述引物之外，还可以含有进行本发明检测方法中的核酸扩增所需的试剂类。另外，基因突变检测用探针、引物及其他试剂类既可以被单独容纳，它们的一部分也可以形成混合物。

[0215] 此外，“单独容纳”是指只要各试剂被分开以维持非接触状态即可，不一定非要容纳在可独立处理的单独的容器中。

[0216] 通过包括用于扩增含有显示基因突变的碱基的碱基序列(与基因突变检测用探针杂交的区域)的引物对，例如能够更高灵敏度地检测基因突变。

[0217] 另外，本发明的多态性检测用试剂盒可以含有记载了使用所述基因突变检测用探针对含有作为检测对象的核酸的试样创建微分熔解曲线、并进行其Tm值分析来检测编码基因的碱基序列中的基因突变的使用说明书，或者是记载了基因突变检测用试剂盒中可包含或者添加包含的各种试剂的使用说明书。

[0218] 实施例

[0219] 下面说明本发明的实施例。但是本发明不限于下述实施例。

[0220] [实施例1]

[0221] 使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表6所述的处方的检查用试剂进行了Tm分析。

[0222] 表6

[0223]

[0224] ※NI PPON GENE公司制

[0225] 此外，上述表6中使用的探针(序列编号2)的详细示于下面的表7，模板(互补链)(ID-1～ID-16)的详细示于下面的表8和表9。此外，探针中的3’末端的括号内示出荧光染料的种类。

[0226] Tm值是使用Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/)在设定条件：Oligoconc[μM]0.2、Na eq.[mM]50的条件下计算的。

[0227] 在表7中，Tm(WT)表示当针对检测对象的基因突变模板为野生型时的Tm值，Tm(mt)表示当针对检测对象的基因突变模板为突变型时的Tm值。Δ表示mt(突变型)和WT(野生型)的Tm值之差。

[0228] 表7

[0229]

[0230] 带下划线的大写字母：*1B(目的SNP)大写字母：*1B之外的变异(目的外SNP)[0231] 表8

[0232]CYP3A4*1B-AA-40-F AGCCATAGAGACAAGGGCAAGAGAGaGGCGATTTAATAGA 序列编号25
CYP3A4*1B-GA-40-F AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGaGGCGATTTAATAGA 序列编号26
CYP3A4*1B-AG-40-F AGCCATAGAGACAAGGGCAAGAGAGgGGCGATTTAATAGA 序列编号27
CYP3A4*1B-GG-40-F AGCCATAGAGACAAGGGCAGGAGAGgGGCGATTTAATAGA 序列编号28[0233] 表9

[0234]

[0235] 在Tm分析中，在95℃下处理1秒，在40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒使温度从40℃上升到80℃，并测定了其间的荧光强度随时间的变化。

[0236] 此外，荧光染料Pacific Blue的激发波长为365nm～415nm，检测波长为445nm～480nm，通过各波长分别针对每个样品测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。

[0237] 通过Tm分析获得了示出探针的荧光值的变化量的图2的(A)～(P)。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。在图2中，(A)为示出使用ID-1作为模板时的荧光值的变化量的图，(B)为使用ID-2作为模板时的荧光值的变化量的图，(C)为使用ID-3作为模板时的荧光值的变化量的图，(D)为使用ID-4作为模板时的荧光值的变化量的图，(E)为使用ID-5作为模板时的荧光值的变化量的图，(F)为使用ID-6作为模板时的荧光值的变化量的图，(G)为使用ID-7作为模板时的荧光值的变化量的图，(H)为使用ID-8作为模板时的荧光值的变化量的图，(I)为使用ID-9作为模板时的荧光值的变化量的图，(J)为使用ID-10作为模板时的荧光值的变化量的图，(K)为使用ID-11作为模板时的荧光值的变化量的图，(L)为使用ID-12作为模板时的荧光值的变化量的图，(M)为使用ID-13作为模板时的荧光值的变化量的图，(N)为使用ID-14作为模板时的荧光值的变化量的图，(O)为使用ID-15作为模板时的荧光值的变化量的图，(P)为使用ID-16作为模板时的荧光值的变化量的图。

[0238] 从图2的(A)～(P)的结果可知，在使用了序列编号2所示的探针的情况下，不论有无非目标基因突变，都能够对序列编号1所示的碱基序列中作为检测对象的第501位的碱基，检测基因突变的有无。

[0239] [实施例2]

[0240] 使用全自动SNPs检查装置IS-5310(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表10中记载的处方的检查用试剂进行了Tm分析。另外，将处方中的实施例1的探针变更成实施例2中使用的探针并进行相同的实验也能够获得同等的结果。

[0241] 表10

[0242] 处方)

[0243](反应液量：50μl)
1×PCR缓冲液
dNTP 0.2mM
MgCl2 1.5mM
Taq聚合酶(爱科来公司制) 0.0376U
探针：5FL-ABCG2Q126X-T-R1 0.2μM
模板 0.2μM

[0244] 在Tm分析中，在95℃下处理1秒、40℃下处理60秒，接着以温度上升速度1℃/3秒将温度从40℃上升到75℃，并测定了其间的荧光强度随时间的变化。将激发波长设为420nm～485nm，将测定波长设为520nm～555nm，来分别测定了源自荧光标记探针的荧光强度的变化。

[0245] 表11

[0246]

[0247] 下面示出上述记载的探针和单链核酸的详细。

[0248] 表12

[0249]

[0250] 其结果能够确认：通过使用本发明涉及的基因突变检测用探针，能够检测野生型(序列编号29的第234位的碱基为G)1和2、以及突变型(序列编号29的第234位的碱基为C)1和2两者的峰。并且能够确认：

[0251] 即使在使用将人类基因组类型为野生型的单链核酸和突变型的单链核酸以1∶1混合了的混合型1～4的情况下，通过使用本发明涉及的基因突变检测用探针，也能够检测到峰。

[0252] 野生型1和野生型2的Tm值均为50℃，突变型1和突变型2的Tm值均为57℃。

[0253] 另外，混合型1的Tm值为50℃和56℃，混合型2的Tm值为50℃和56℃，混合型3的Tm值为48℃和56℃，混合型4的Tm值为49℃和57℃。

[0254] 在图3中分别示出通过Tm分析而得到的野生型1(A)、野生型2(C)、突变型1(B)、突变型2(D)、混合型1(E)、混合型2(F)、混合型3(G)和混合型4(H)的曲线图。此外，纵轴表示荧光强度的温度微分值，横轴表示温度。

[0255] [比较例1]

[0256] 使用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)和下述表13记载的处方的检查用试剂进行了Tm分析。

[0257] 表13

[0258]

[0259] ※NI PPON GENE公司制

[0260] 此外，上述表13中使用的探针(序列编号35)的详细示于以下的表14，模板(互补链)(ID-17～ID-32)的详细示于以下的表15。此外，探针中的3’末端的括弧内示出荧光染料的种类。

[0261] 表14

[0262]名称 序列 mer Tm(WT) Tm(mt) Δ
GC(％)
3PB-CYP3A4*1B-R3TK taaatcgccTctctcCtgccc-(Pacific Blue) 21 48.9 57.6 57.1
8.7

[0263] 下划线大写字母：*1B(目的SNP)大写字母：*1B之外的突变(目的外SNP)[0264] 表15

[0265]

[0266] 在Tm分析中，在95℃下处理1秒、在40℃下处60秒，接着以温度上述速度1℃/3秒使温度从40℃加热到80℃，并测定了其间的荧光强度随时间的变化。

[0267] 通过Tm分析获得了示出探针荧光值的变化量的图4的(A)～(P)。图中，纵轴表示每单位时间的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴表示温度(℃)。在图4中，(A)为示出使用ID-17作为模板时的荧光值的变化量的图，(B)为示出使用ID-18作为模板时的荧光值的变化量的图，(C)为示出使用ID-19作为模板时的荧光值的变化量的图，(D)为示出使用ID-20作为模板时的荧光值的变化量的图，(E)为示出使用ID-21作为模板时的荧光值的变化量的图，(F)为示出使用ID-22作为模板时的荧光值的变化量的图，(G)为示出使用ID-23作为模板时的荧光值的变化量的图，(H)为示出使用ID-24作为模板时的荧光值的变化量的图，(I)为示出使用ID-25作为模板时的荧光值的变化量的图，(J)为示出使用ID-26作为模板时的荧光值的变化量的图，(K)为示出使用ID-27作为模板时的荧光值的变化量的图，(L)为示出使用ID-28作为模板时的荧光值的变化量的图，(M)为示出使用ID-29作为模板时的荧光值的变化量的图，(N)为示出使用ID-30作为模板时的荧光值的变化量的图，(O)为示出使用ID-31作为模板时的荧光值的变化量的图，(P)为示出使用ID-32作为模板时的荧光值的变化量的图。

[0268] 从其结果可知，在使用了比较例1中使用的探针的情况下，由于受到有无非目标基因突变的影响，对于序列编号1所示的碱基序列中作为检测对象的第501位的碱基，难以检测基因突变的有无。

[0269] 如上文所述，通过本发明，能够从编码基因的碱基序列中包含的多个基因突变中不受非目标基因突变的碱基型的影响而仅特异性地检测作为检测对象的特定的基因突变。

[0270] 日本申请特愿2011-102987(申请日2011年5月2日)以及日本申请特愿2011-218114(申请日2011年9月30日)公开的全部内容通过参考并入本说明书中。

[0271] 本说明书中记载的全部文献、专利申请以及技术规格与每个文献、专利申请以及技术规格通过参考并入的具体并且分别记载的情况同等程度地通过参考并入本说明书中。