[0001] 本发明涉及以纤维蛋白原测定试剂为代表的凝血功能测定试剂、即含有凝血活化剂的试剂以及/或者凝血功能测定用样品稀释液中使用的凝血时间延长剂以及使用其的凝血功能测定试剂。

[0002] 凝血的机制通常大致分为两种途径。一种途径是由凝血因子Ⅻ与异物的接触活化开始，经过多步反应而最终生成凝血酶的内源性途径；另一种途径是由凝血因子Ⅶ和组织凝血激酶引发凝血因子Ⅹ活化开始，同样生成凝血酶的外源性途径(图1)。任一途径最终都可以在生成的凝血酶的作用下将纤维蛋白原转化成纤维蛋白而凝固。为探究上述凝血机制中是否有异常或产生异常的原因，有使用凝血活化剂的几种凝血功能检查，在临床检查现场被广泛使用。

[0003] 凝血活化剂以及使用该活化剂的凝血功能检查如下所述。

[0004] 1)使用凝血酶的凝血功能检查

[0005] 测定纤维蛋白原、测定ATIII、测定凝血酶时间

[0006] 2)使用组织凝血激酶的凝血功能检查

[0007] 测定凝血酶原时间、用凝血酶原时间测定凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ的活性、测定复合因子(凝血试验·肝促凝血酶原激酶试验等)

[0008] 3)使用磷脂的凝血功能检查

[0009] 测定部分凝血激酶时间，测定活化部分凝血激酶时间，利用活化部分凝血激酶时间测定来测定凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅻ、前激肽释放酶和大分子激肽原的活性，测定蛇毒时间，用蛇毒时间测定来定量凝血因子Ⅹ、用稀释蛇毒时间测定来测定狼疮抗凝物(LA)、测定蛋白C活性、凝血激酶生成试验

[0010] 在上述1)～3)中的任一检查中都是测定在患者样品中混合含有凝血活化剂等的试剂而引发凝固到最终纤维蛋白原转化为纤维蛋白并析出的时间。

[0011] 在凝血功能检查中检测凝固的方法可以大致分为力学检测法和光学检测法。力学检测法是指通过磁力等监控投入到反应液中的磁性物质等，检测因凝固引起粘性变大，磁性物质的移动变得迟缓的情况。光学检测法是将因凝固使反应液变白并浑浊的情况作为透过光或者散射光的变化量检出的方法，该方法由于比较简单而被最广泛地应用。现在这些检测方法通常都是通过自动化装置进行检测。图2给出通过散射光检测法所得的散射光强度变化曲线中的一例。图中，A点表示通过混合含有凝血活化剂的试剂而引发凝血的时间点，然后经过多步反应开始析出纤维蛋白，从而在B点以后出现散射光的强度变化。纤维蛋白原逐渐被消耗，当反应液中几乎没有纤维蛋白原时散射光的强度变化消失，曲线像C点那样变得平坦，凝固结束。基于该散射光的强度变化曲线，根据公知的计算参数算出凝固时间(专利文献1)。其中，如果散射光强度变化量的最大值为ΔH，则ΔH值大时凝固检测敏锐，能够更正确地检测是显而易见的。因此，希望使用的凝血功能测定试剂具有光学变化量较明显的特性。但是，从A点至C点的变化在很短时间内发生的情况下，无法精度良好地测定凝固时间。所以，通常添加延长凝固时间的物质，从而将凝固时间调节为所期望的长度。作为凝血时间延长剂，可以举出专利文献2中以氯化钠为代表的碱金属或者碱土类金属的卤化物盐、专利文献3中的丙酸钠。但是这些现有凝血时间延长剂同时存在添加量依赖性地使ΔH减小等负面结果。

[0012] 为了解决上述现有方法的问题的目的，提出使用添加了聚乙二醇、聚乙烯醇、大分子多糖等大分子物质的试剂的方法(专利文献4和5)。

[0013] 现有技术文献

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1：日本特开平8-15263号公报

[0016] 专利文献2：日本专利2994557号公报

[0017] 专利文献3：日本专利3330685号公报

[0018] 专利文献4：日本专利3074611号公报

[0019] 专利文献5：日本特开平5-60763号公报

[0044] 本发明的凝血时间延长剂以上述式(1)所示的化合物或其盐为有效成分。式(1)1
中，R 表示氢原子、氨基或者可以具有取代基的烷基。此处，作为烷基，优选碳原子数为1～
6的烷基，更优选碳原子数为2～5的烷基。作为能够取代在该烷基上的基团，可以举出羧基、烷氧羰基、氨基，优选取代有羧基和氨基两取代基或者烷氧羰基和氨基两取代基的情况。

[0045] 作为式(1)所示的化合物的具体例，可以举出胍、氨基胍、精氨酸、精氨酸烷基酯，其中，从光学变化增强作用大、能够准确测定方面考虑，特别优选氨基胍。此外，作为式(1)的化合物的酸加成盐，可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐。

[0046] 本发明的凝血时间延长剂具有不仅延长凝血时间，而且增强在凝血功能测定中的反应液的浊度变化的作用。这表现为凝血的终产物纤维蛋白网的形成状态变得更加牢固。因此，本发明的凝血时间延长剂可以用于直接检测浊度变化的光学检测法和用磁性物质等监测纤维蛋白网形成状态的力学检测法等，优选用于光学检测法。此处，光学检测法有散射光量检测法和透过光量检测法，优选用于散射光量检测法。

[0047] 能够适用本发明的凝血时间延长剂的凝血功能检查只要测定从在患者样品中混合含有凝血活化剂等的试剂引发凝固到最终纤维蛋白原转化为纤维蛋白而析出的时间即可。作为例子，可以举出纤维蛋白原测定、ATIII测定、凝血酶时间测定、凝血酶原时间测定、使用凝血酶原时间的凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的活性测定、复合因子测定(凝血试验·肝促凝血酶原激酶试验等)、部分凝血激酶时间测定、活化部分凝血激酶时间测定、采用活化部分凝血激酶时间测定而测定凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、前激肽释放酶、大分子激肽原的活性、蛇毒时间测定、采用蛇毒时间测定而定量凝血因子Ⅹ、采用稀释蛇毒时间测定而测定狼疮抗凝物(LA)、蛋白C活性测定、凝血激酶生成试验、其它凝固异常检查等。

[0048] 上述凝血功能检查的测定是将含有凝血活化剂的试剂(例如，测定纤维蛋白原时含有凝血酶的试剂)添加于样品中，测定直到纤维蛋白析出的时间。根据需要采用样品稀释液对样品进行适当稀释。本发明的凝血时间延长剂只要包含在测定体系中即可，可以包含在含有凝血活化剂的试剂中，还可以包含在样品稀释液中。即，本发明的凝血时间延长剂例如在纤维蛋白原测定中，可以包含在含有凝血酶的试剂中，也可以包含在样品稀释液中。

[0049] 上述含有凝血活化剂的试剂只要是用于上述凝血功能检查的试剂即可。例如，可以举出含有凝血酶的试剂、含有组织凝血激酶的试剂、含有磷脂的试剂等。此外，上述样品稀释液只要是用于上述凝血功能检查的样品稀释液即可。例如，可以举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES等Good’s缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、咪唑缓冲液、巴比妥缓冲液、生理盐水和水等。

[0050] 为了得到在凝血检查中能够精度良好地测定的凝固时间，优选使本发明的凝血时间延长剂包含于反应液中。例如，在进行纤维蛋白原测定时，以测定正常血浆(浓度约300mg/dL)时能够得到5～50秒、优选7～20秒、更优选9～15秒的凝固时间的方式包含于反应液中。使用氨基胍作为凝血时间延长剂时，在纤维蛋白原测定的反应液中的浓度、即样品·样品稀释液·含凝血酶的试剂的混合溶液中的浓度为10～500mM，优选为20～
200mM，更优选为30～120mM。凝血时间延长剂包含在样品稀释液中时，样品稀释液的浓度为10～900mM，优选为30～400mM，更优选为50～200mM。

[0051] 在进行凝血酶原时间测定时，优选以测定正常血浆(活性约100％)时得到9～60秒、优选9～30秒、更优选10～16秒的凝固时间的方式包含于反应液中。在活化部分凝血激酶时间测定中，优选以测定正常血浆时得到15～80秒、优选15～60秒、更优选20～50秒的凝固时间的方式包含于反应液中。关于其它凝血功能检查，只要以能够获得适合测定方法的凝固时间的方式包含于反应液中即可。

[0052] 在用于凝血功能检查的包含样品稀释液以及含有凝血活化剂的试剂的凝血功能测定试剂中，除含有本发明的凝血时间延长剂以外，还可以包含已知的大分子多糖类以及合成大分子类。

[0053] 作为大分子多糖类的具体例，可以举出葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖200000、葡聚糖500000等葡聚糖或FICOLL等。此外，这些大分子多糖类可以使用一种，也可以组合两种以上进行使用。对于这些大分子多糖类的添加量而言，优选上述凝血功能测定试剂中的浓度为0.01～10W/V％，更优选为0.1～5W/V％。

[0054] 作为合成大分子类物质的具体例，可以举出聚乙烯醇500、聚乙烯醇1500、聚乙烯醇2000等聚乙烯醇类，聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000等聚乙二醇类以及聚乙烯吡咯烷酮等。这些合成大分子类可以使用一种，也可以组合两种以上进行使用。这些合成大分子类的添加量没有特别限定，上述凝血功能测定试剂中的浓度优选为0.01～10W/V％，更优选为0.1～5W/V％。

[0055] 上述凝血功能测定试剂中，除含有本发明的凝血时间延长剂以外，还可以含有缓冲剂、钙离子、抗凝药的拮抗剂等。

[0056] 作为缓冲剂的具体例，适当选择使用在pH4～9范围内具有缓冲能力的缓冲剂。例如，可以选择MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES等Good’s缓冲液、柠檬酸、磷酸、醋酸、咪唑、巴比妥、GTA等中的一种或组合两种以上进行使用。这些缓冲剂的添加量只要是具有缓冲能力的量即可，无特殊限制，上述凝血功能测定试剂中的浓度优选为1～1000mM，更优选为5～500mM。

[0057] 作为钙离子，使用氯化钙、乳酸钙、葡糖酸钙、葡糖醛酸钙、酒石酸钙等水溶性的钙化合物。这些钙化合物可以使用一种或组合两种以上进行使用。钙化合物的使用量只要是能够辅助凝固反应的量即可，无特殊限制，上述凝血功能测定试剂中的浓度优选为5mM～100mM、更优选为10mM～50mM。

[0058] 作为抗凝剂的拮抗剂，使用鱼精蛋白、聚凝胺(Polybrene)(海美溴铵Hexadimethrine bromide)等。这些抗凝剂的拮抗剂可以使用一种或组合两种以上进行使用。抗凝剂的拮抗剂的使用量只要是能够充分中和样品血浆中含有的抗凝剂、例如肝素等-5 -2
的量即可，无特殊限制，上述凝血功能测定试剂中的浓度优选为10 ～10 W/V％、更优选为-4 -3
5×10 ～5×10 W/V％。

[0059] 此外，上述凝血功能测定试剂可以为液状品、冷冻品或者干燥品，进而干燥品通过加入蒸馏水或者缓冲液而溶解。

[0060] 此外，上述凝血功能测定试剂中可以添加合适的防腐剂。作为防腐剂，可以从环丙沙星(ciprofloxacin)、丙酸、苯甲酸钠、叠氮化钠、ProClin300等中选择一种或组合两种以上进行使用。此外，可以根据需要含有氯化钠等盐、氨基酸、糖等常规的稳定剂等。

[0061] 以上记载的浓度记载的是溶液品中的浓度，使用干燥品等时，记载的是用水或者缓冲液等进行溶解时的浓度。

[0062] 只要按照常规方法使用本发明的凝血功能测定试剂测定凝血功能即可。如果以纤维蛋白原测定为例，则将标准液用样品稀释液稀释5倍、10倍、20倍(可以适当调整稀释倍率)。然后，将2体积的各稀释标准液在37℃下加热3分钟，加入预先加热到37℃的1体积凝血酶试剂，测定凝固时间。然后将各稀释标准液的测定值绘制成曲线图。将血浆样品用样品稀释液稀释10倍(可以适当调整稀释倍率)，同样地测定稀释样品，基于得到的凝固时间，由曲线图求得浓度。

[0063] 实施例

[0064] 以下举出实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明不限定于以下实施例。

[0065] 实施例1

[0066] (1)凝血时间延长作用的确认

[0067] 采用凝血酶时间法测定血浆样品中的纤维蛋白原浓度时，一般来说将凝血酶加入血浆中测定凝固时间，然后由利用纤维蛋白原浓度已知的标准液绘制的标准曲线求得浓度。顺序是向10μL的样品血浆中加入90μL的样品稀释液进行混合后，作为含有凝血活化剂的试剂，加入含有凝血酶的试剂50μL，测定凝固时间。

[0068] 在本实施例中，血浆样品使用的是市售正常血浆(Coagtrol N、Sysmex公司制)，含有凝血酶的试剂使用的是Coagpia Fbg凝血酶试剂(积水Medical公司制)，此外凝固时间测定装置使用的是全自动凝血时间分析仪Coagulex 800(Sysmex公司制)。该机器采用散射光检测法，可以获得凝固时间和散射光强度的经时变化数据。

[0069] 当使用HEPES缓冲液(pH7.5)作为样品稀释液时，市售正常血浆在几秒内凝固(4.6秒)。如果将氨基胍盐酸盐作为凝血时间延长剂添加于HEPES缓冲液(pH7.5)中，则与现有方法中添加氯化钠和溴化钠的效果相同，凝固时间与添加浓度依赖性地延长(结果示于图3)。即，认为本发明具有与现有方法同等的延长凝固时间的作用。

[0070] (2)光强度变化量的确认

[0071] 将散射光强度变化量的极大值作为ΔH算出，该值与凝固时间的关系示于图4。随着凝固时间延长，使用现有方法的氯化钠和溴化钠时ΔH显著降低，与之相反，使用本发明时仍然可以维持大的ΔH。即，可知如果以同等程度的凝固时间进行比较，则与现有方法相比，本发明的散射光强度的变化量增大，可以更准确地测定凝固时间。

[0072] 实施例2

[0073] 使用以获得同等程度的凝固时间的方式调节了凝血时间延长剂的添加浓度的样品稀释液(HEPES缓冲液pH7.5)，采用与实施例1同样的方式测定正常市售血浆。现有方法和本发明的散射光强度变化量极大值ΔH和测定的同时再现性的比较结果示于表1。可知与现有方法相比，本发明的凝血时间延长剂，即精氨酸盐酸盐、精氨酸甲酯、胍盐酸盐、胍磷酸盐、胍氨基磺酸盐、氨基胍盐酸盐使ΔH显著提高，并且测定的精度(同时重现性等)也提高。此外，在提高测定精度(同时重现性等)的效果方面，氨基胍盐酸盐特别优异。

[0074] 【表1】

[0075]

[0076] 现有方法②～⑤为1次测定，其它为10次测定

[0077] *无法算出

[0078] 实施例3

[0079] 现有方法A使用含有氯化钠作为凝血时间延长剂的样品稀释液，现有方法B使用在现有方法A中进一步含有聚乙二醇(分子量20000)(以下称为PEG20000)作为光强度变化量增强剂的样品稀释液，与使用兼具凝血时间延长剂和光强度变化量增强剂的功能的氨基胍盐酸盐(本发明)的样品稀释液进行比较。另外，任一种情况下均采用HEPES缓冲液(pH7.5)作为缓冲液。此外，现有方法B中，如果PEG20000的添加量多，则可能导致粘性增大，分取精度下降，因此，将添加浓度定为0.1％。使用各样品稀释液，采用与实施例1同样的方式测定市售正常血浆的凝固时间，结果得到图5所示的散射光的强度变化曲线。此外，凝固时间和ΔH示于表2。可以看出添加PEG20000的现有方法B与未添加该物质的现有方法A相比，散射光强度的变化量变大，但采用本发明使得散射光强度变化量更显著地增大，可以更加准确地测定凝固时间。

[0080] 【表2】

[0081]

[0082] 3次测定的平均值