[0001] 本发明涉及一种能有效地将生理活性物质导入肝实质细胞内、并使生理活性物质在肝实质细胞内有效作用的囊泡(小胞体，vesicle)及其用途。

[0002] 本发明涉及能将抗病毒剂、化疗剂、肽、核苷酸、寡核苷酸、反义核酸、适体、诱杀剂以及它们的类似物、小核酸分子例如siRNA、miRNA、dsRNA或shRNA等生理活性物质有效地导入肝实质细胞内，并使生理活性物质在肝实质细胞内有效作用的囊泡。

[0003] 已知在肝实质细胞内导入基因等核酸或抗肿瘤剂等生理活性物质而试图实现基因表达、基因调节、肿瘤缩小的例子。

[0004] 对于核酸相关的导入，作为使用了病毒载体的例子，有Scherr等的论文(非专利文献1)以及公开专利(专利文献1)，作为施加水压而导入细胞内的流体动力注入的例子，有Song等的论文(非专利文献2)和公开专利(专利文献2)。但是，使用病毒载体的导入方法对人的安全性存在问题，不适合广泛的普通治疗目的。另外，施加水压的导入方法虽然可以在生物体外导入至细胞，但也不适合以治疗目的应用于人。

[0005] 此外，作为向肝实质细胞的输送方法，已知利用以肝脏表面的糖受体为靶标的受体介导的胞吞作用的方法。脱唾液酸糖蛋白受体(非专利文献3)对肝细胞是特异性的，可以与具有半乳糖末端的糖蛋白例如脱唾液酸血清类黏蛋白结合。有介绍利用该原理的含有半乳糖修饰阳离子性胆固醇的脂质体组合物(专利文献3)。但是，在输送siRNA的实施例中，虽然与未修饰半乳糖的情况相比效果稍有提高，但是在肺、肾脏、脾脏以及心脏中也可见基因表达，因此可知不是对肝脏特异性地输送siRNA，不能说是有效的技术。

[0006] 还提出了将乳糖与磷脂的磷脂酰乙醇胺结合并与正离子脂质体配合的组合物(非专利文献4)、使用糖修饰肽并与脂质体同样以肝脏的糖受体为靶标的输送(专利文献4)。

[0007] 但是，以肝脏的糖受体为靶标的脂质体的输送中，通过胞吞作用进入后，在内体内发生核酸的分解，存在几乎不能发挥基因表达以及基因调节的效果的问题。

[0008] 另一方面，还介绍有以下的技术：避开作为生物体的防御系统的网状内皮系统(以下RES：reticulo-endothelial system)而提高血液滞留性，其结果提高了向肝实质细胞的输送效率(专利文献5)。使脂质体表面化学结合水溶性的聚合物(甲氧基聚乙二醇：mPEG)而避开由RES产生的异物识别的技术被称为被动靶向(passive targeting)，与作为抗癌药阿霉素的脂质体制剂而市售(Doxil)的技术相同。除了具有由于血管通透性的亢进而容易聚集在肿瘤组织或新生血管部位的特长外，一部分也会进入RES细胞，因此也不能说是向肝实质细胞的有效的输送技术。

[0009] 由于作为脂溶性维生素的维生素E(生育酚)具有抗氧化功能，因此能以在囊泡中少量(一般0.2％左右)添加的形式使用来达到防止脂囊泡中的不饱和脂肪酸氧化的目的(专利文献6、7)。

[0010] 另外，Nishina等报道了，使作为维生素E的主成分的α-生育酚与siRNA化学结合而将siRNA用于向肝脏的输送的例子，其中利用了以下事实：来源于食物的维生素E被小肠吸收并在血液中由血清成分的乳糜微粒运送至肝脏，而且来源于食物以外的维生素E在血液中容易被HDL(高密度脂蛋白)和LDL(低密度脂蛋白)运送(非专利文献5)。但是，由于使siRNA与α-生育酚以1∶1结合在工业范围上存在制造上的困难，而且作为前药要求高纯度，因此有必要除去未反应原料和副产物。由于这些制造工序和纯化工序引起的收率的降低，以及导入肝脏后由水解引起的siRNA的游离也是必然的，因此为了获得治疗效果，不得不大量使用高价的siRNA，从而存在经济上的问题。

[0011] 另外，已知将维生素A与市售的细胞导入用正离子脂质体以及质粒或siRNA之类的核酸混合制成乳液，向肝卫星细胞输送的方法(专利文献8)。肝卫星细胞与网状内皮系细胞一样是非实质细胞，在细胞内具有脂肪滴并贮藏有高浓度的维生素A。使用该维生素A的向非实质细胞的输送方法的情况下，如果血液中存在大量的维生素A，则由于容易由血液中的维生素A结合蛋白输送至肝卫星细胞(非实质细胞)，因此不必控制粒径和表面电荷等。但是，将生理活性物质特异性地输送至肝实质细胞内时，为了不使粒子被非实质细胞截留，有必要适当调节全部粒子的粒径和表面电荷。迄今为止，尚未开发出最适合向肝实质细胞输送用的输送粒子。

[0012] 背景技术文献

[0013] 专利文献

[0014] 专利文献1：日本特开2007-110995号

[0015] 专利文献2：日本特开2008-054681号

[0016] 专利文献3：日本特开2007-112768号

[0017] 专利文献4：日本特开1999-290073号

[0018] 专利文献5：日本特开2004-196675号

[0019] 专利文献6：日本特开2007-112768号

[0020] 专利文献7：日本特表2008-530215号

[0021] 专利文献8：日本特开2008-50375号

[0022] 非专利文献

[0023] 非专利文献1：Scherr，M.et al.，Oligonucleotides，2003；13：353-363[0024] 非专利文献2：Song，E.et al.，Nature Medicine，2003；9：347-351[0025] 非专利文献3：Wu，GY and Wu，CH，J.Biol.Chem.，1987；262：4429-4432[0026] 非专利文献4：Watanabe，T.et al.，J.Hepatol.，2007；47：744-750[0027] 非专利文献5：Nishina，K.et al.，Molecular Therapy，2008；16(4)：734-740发明内容

[0028] 发明要解决的课题

[0029] 本发明是鉴于以上的情况而进行的，其目的涉及一种组合物，该组合物能有效且特异性地将生理活性物质输送导入至肝实质细胞，并使生理活性物质在肝实质细胞内有效作用。

[0030] 解决课题用的手段

[0031] 本发明人对向肝实质细胞的输送技术进行了深入的研究，结果发现通过在含有生理活性物质的囊泡表面上吸附或化学结合充分量的维生素E来识别血清成分，从而血清成分极其有效地将含有生理活性物质的囊泡输送至肝实质细胞，且生理活性物质能快速发挥效果，从而完成了本发明。

[0032] 本发明人还发现了一种极其安全且有效的方法，该方法不通过与生理活性物质的结合，而是利用维生素E在血液中容易被运送至肝实质细胞的性质作为生理活性物质的输送因素。

[0033] 即，本发明涉及以下(1)～(24)的发明。

[0034] (1)一种囊泡，其特征在于，该囊泡含有下述(i)和(ii)，在该囊泡表面吸附有维生素E，或者维生素E化学结合至构成囊泡的两亲物，

[0035] (i)两亲物

[0036] (ii)包含具有阳离子性的物质和/或具有阴离子性的物质的有机物质。

[0037] (2)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述具有阳离子性的物质为阳离子脂质。

[0038] (3)根据(2)中记载的囊泡，其特征在于，前述阳离子脂质由下述式(I)表示。

[0039] 式(I)

[0040]

[0041] (式中，R1和R2表示相同或不同的碳原子数12～22的饱和或不饱和的烃基，R3表示碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的羟基烷基，m表示1～10的整数，X表示卤原子。)

[0042] (4)根据(2)中记载的囊泡，其特征在于，前述阳离子脂质含有选自下列物质中的至少1种以上：饱和或不饱和脂肪族伯胺(硬脂胺、油胺)、饱和或不饱和仲、叔胺(二硬脂酰三甲铵丙烷、二油酰三甲铵丙烷)、以及季胺盐(DODAC(双十八烷基二甲基氯化铵：dioctadecyldimethylamm onium chloride)、DTDAB(双十四烷基二甲基溴化铵：ditetradecyldimet hylammonium bromide)、DOTMA(N-(2，3-二油酰)丙基-N，N，N-三甲铵：N-(2，3-dioleyloxy)propyl-N，N，N-trimethylammonium)、DDAB(双十二烷基溴化铵：didodecylammonium bromide)、DTAB(双十四烷基溴化铵：ditetradecylammonium bromide)、DOTAP(1，2-二油酰氧基-3-三甲铵丙烷：1，2-dioleoyloxy-3-trimethylammonio propane)、O，O′-双十四酰-N-(α-三甲铵-乙酰基)-二乙醇胺氯化物：O，O′-ditetradecanoyl-N-(α-trimethyla mmonio-acetyl)-diethanolamine chloride、O，O′-双十六酰-N-(α-三甲铵-乙酰基)-二乙醇胺氯化物：O，O′-dihexadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride、O，O′-双十八酰-N-(α-三甲铵-乙酰基)-二乙醇胺氯化物：O，O′-dioctadecanoyl-N-(α-trimethylammonio-acetyl)-diethanolamine chloride、DC-Chol(3β-N-(N′，N′，-二甲氨基乙烷)氨甲酰基胆固醇盐酸盐：3β-N-(N′，N′，-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride)、DMRIE(1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙铵：1，2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium)、DO SPA(2，3-二油烯基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸胺：2，3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N，N-dime thyl-1-propanaminum trifluoroacetate))。

[0043] (5)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述两亲物为选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、甲氧基聚乙二醇(mPEG)加成(付加)磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、鞘磷脂、心磷脂以及缩醛磷脂中的至少1种以上的磷脂。

[0044] (6)根据(5)中记载的囊泡，其特征在于，

[0045] 前述磷脂酰胆碱选自蛋黄磷脂酰胆碱、氢化蛋黄磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰-油酰磷脂酰胆碱、二亚油酰(dilinoleoyl)磷脂酰胆碱、二亚麻酰(dilinolenoyl)磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二芥酰(ジエルシロイル，dierucicoyl)磷脂酰胆碱、双二十碳酰(dieicosanoyl)磷脂酰胆碱、双二十碳三烯酰(dieicosatrienoyl)磷脂酰胆碱、双二十碳五烯酰(dieicosapentaenoyl)磷脂酰胆碱、双二十二碳烯酰(ジドコサエノイル，didocosaenoyl)磷脂酰胆碱以及双二十二碳六烯酰(didocosahexaenoyl)磷脂酰胆碱；

[0046] 前述磷脂酰乙醇胺选自蛋黄磷脂酰乙醇胺、氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰-油酰磷脂酰乙醇胺、二亚油酰磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰磷脂酰乙醇胺、二癸酰磷脂酰乙醇胺、二芥酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳三烯酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳五烯酰磷脂酰乙醇胺、双二十二碳烯酰磷脂酰乙醇胺以及双二十二碳六烯酰磷脂酰乙醇胺；

[0047] 前述磷脂酰甘油选自蛋黄磷脂酰甘油、氢化蛋黄磷脂酰甘油、大豆磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、棕榈酰-油酰磷脂酰甘油、二亚油酰磷脂酰甘油、二亚麻酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、双二十碳酰磷脂酰甘油、双二十碳三烯酰磷脂酰甘油、双二十碳五烯酰磷脂酰甘油、双二十二碳烯酰磷脂酰甘油以及双二十二碳六烯酰磷脂酰甘油；

[0048] 前述磷脂酰丝氨酸选自蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰丝氨酸、氢化大豆磷脂酰丝氨酸、二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰磷脂酰丝氨酸、二亚油酰磷脂酰丝氨酸、二亚麻酰磷脂酰丝氨酸、二癸酰磷脂酰丝氨酸、二芥酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳三烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳五烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十二碳烯酰磷脂酰丝氨酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酰丝氨酸；

[0049] 前述磷脂酰肌醇选自蛋黄磷脂酰肌醇、氢化蛋黄磷脂酰肌醇、大豆磷脂酰肌醇、氢化大豆磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、棕榈酰-油酰磷脂酰肌醇、二亚油酰磷脂酰肌醇、二亚麻酰磷脂酰肌醇、二癸酰磷脂酰肌醇、二芥酰磷脂酰肌醇、双二十碳酰磷脂酰肌醇、双二十碳三烯酰磷脂酰肌醇、双二十碳五烯酰磷脂酰肌醇、双二十二碳烯酰磷脂酰肌醇以及双二十二碳六烯酰磷脂酰肌醇；

[0050] 前述甲氧基聚乙二醇(mPEG)加成磷脂酰乙醇胺选自mPEG2000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二油酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二油酰磷脂酰乙醇胺以及mPEG5000-二油酰磷脂酰乙醇胺；

[0051] 前述磷脂酸选自蛋黄磷脂酸、氢化蛋黄磷脂酸、大豆磷脂酸、氢化大豆磷脂酸、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二油酰磷脂酸、二亚油酰磷脂酸、棕榈酰-油酰磷脂酸、二亚麻酰磷脂酸、二癸酰磷脂酸、二芥酰磷脂酸、双二十碳酰磷脂酸、双二十碳三烯酰磷脂酸、双二十碳五烯酰磷脂酸、双二十二碳烯酰磷脂酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酸；

[0052] 前述鞘磷脂为来源于蛋黄的鞘磷脂或来源于牛乳的鞘磷脂；

[0053] 前述心磷脂选自蛋黄心磷脂、氢化蛋黄心磷脂、大豆心磷脂、氢化大豆心磷脂、二月桂酰心磷脂、二肉豆蔻酰心磷脂、二棕榈酰心磷脂、二硬脂酰心磷脂、二油酰心磷脂、棕榈酰-油酰心磷脂、二亚油酰心磷脂、二亚麻酰心磷脂、二癸酰心磷脂、二芥酰心磷脂、双二十碳酰心磷脂、双二十碳三烯酰心磷脂、双二十碳五烯酰心磷脂、双二十二碳烯酰心磷脂以及双二十二碳六烯酰心磷脂。

[0054] (7)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述具有阳离子性的物质为阳离子性聚合物。

[0055] (8)根据(7)中记载的囊泡，其特征在于，前述阳离子性聚合物为聚乙烯亚胺或聚赖氨酸。

[0056] (9)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述具有阴离子性的物质为酸性磷脂。

[0057] (10)根据(9)中记载的囊泡，其特征在于，前述酸性磷脂含有选自磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、甲氧基聚乙二醇加成磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸中的至少1种以上。

[0058] (11)根据(10)中记载的囊泡，其特征在于，

[0059] 前述磷脂酰甘油选自蛋黄磷脂酰甘油、氢化蛋黄磷脂酰甘油、大豆磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、棕榈酰-油酰磷脂酰甘油、二亚油酰磷脂酰甘油、二亚麻酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、双二十碳酰磷脂酰甘油、双二十碳三烯酰磷脂酰甘油、双二十碳五烯酰磷脂酰甘油、双二十二碳烯酰磷脂酰甘油以及双二十二碳六烯酰磷脂酰甘油；

[0060] 前述磷脂酰丝氨酸选自蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰丝氨酸、氢化大豆磷脂酰丝氨酸、二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰磷脂酰丝氨酸、二亚油酰磷脂酰丝氨酸、二亚麻酰磷脂酰丝氨酸、二癸酰磷脂酰丝氨酸、二芥酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳三烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳五烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十二碳烯酰磷脂酰丝氨酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酰丝氨酸；

[0061] 前述磷脂酰肌醇选自蛋黄磷脂酰肌醇、氢化蛋黄磷脂酰肌醇、大豆磷脂酰肌醇、氢化大豆磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、棕榈酰-油酰磷脂酰肌醇、二亚油酰磷脂酰肌醇、二亚麻酰磷脂酰肌醇、二癸酰磷脂酰肌醇、二芥酰磷脂酰肌醇、双二十碳酰磷脂酰肌醇、双二十碳三烯酰磷脂酰肌醇、双二十碳五烯酰磷脂酰肌醇、双二十二碳烯酰磷脂酰肌醇以及双二十二碳六烯酰磷脂酰肌醇；

[0062] 前述甲氧基聚乙二醇(mPEG)加成磷脂酰乙醇胺选自mPEG2000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二油酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二油酰磷脂酰乙醇胺以及mPEG5000-二油酰磷脂酰乙醇胺；

[0063] 前述磷脂酸选自蛋黄磷脂酸、氢化蛋黄磷脂酸、大豆磷脂酸、氢化大豆磷脂酸、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二油酰磷脂酸、二亚油酰磷脂酸、棕榈酰-油酰磷脂酸、二亚麻酰磷脂酸、二癸酰磷脂酸、二芥酰磷脂酸、双二十碳酰磷脂酸、双二十碳三烯酰磷脂酸、双二十碳五烯酰磷脂酸、双二十二碳烯酰磷脂酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酸。

[0064] (12)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述维生素E含有选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及δ-生育酚中的至少1种以上。

[0065] (13)根据(1)中记载的囊泡，其特征在于，前述维生素E为dl-α-生育酚。

[0066] (14)根据(1)～(13)中任一项记载的囊泡，其特征在于，以构成囊泡的物质的总摩尔数的10～50％的范围含有前述具有阳离子性的物质。

[0067] (15)根据(1)～(14)中任一项记载的囊泡，其特征在于，以构成囊泡的物质的总摩尔数的3～30％的范围吸附或化学结合前述维生素E。

[0068] (16)根据(1)～(14)中任一项记载的囊泡，其特征在于，以构成囊泡的物质的总摩尔数的5～20％的范围吸附或化学结合前述维生素E。

[0069] (17)根据(1)～(16)中任一项记载的囊泡，其特征在于，前述囊泡的粒径为50～150nm的范围。

[0070] (18)根据(1)～(17)中任一项记载的囊泡，其特征在于，囊泡包封选自质粒DNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、抗病毒剂和细胞毒性物质中的至少1种以上的生理活性物质，和/或该生理活性物质与囊泡的成分疏水结合或静电结合。

[0071] (19)根据(18)中记载的囊泡，其特征在于，囊泡表面的ζ电位为阴离子型。

[0072] (20)根据(18)中记载的囊泡，其特征在于，前述生理活性物质为抗病毒剂。

[0073] (21)根据(18)中记载的囊泡，其特征在于，前述细胞毒性物质含有选自抗代谢药、铂类药(platinating agent)、烷化剂、植物碱、分子靶向药、生物反应调节剂以及抗癌性抗生素中的至少1种以上。

[0074] (22)根据(21)中记载的囊泡，其特征在于，

[0075] 前述抗代谢药选自依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替吉奥(tegafur-gimeracil-oteracil potassium)、脱氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯基嘌呤以及甲氨蝶呤；

[0076] 前述铂制剂选自奥沙利铂、卡铂、顺铂以及奈达铂；

[0077] 前述烷化剂选自异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑以及雷莫司汀；

[0078] 前述植物碱选自伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、拓扑替康(nogitecan)、紫杉醇、长春烯碱、长春新碱、长春地辛、长春碱，分子靶向药选自伊马替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、帕尼单抗、贝伐珠单抗、硼替佐米；

[0079] 前述生物反应调节剂选自干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白介素；

[0080] 前述抗癌性抗生素选自阿柔比星、表柔比星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、丝裂霉素C以及米托蒽醌。

[0081] (23)用于在血清存在下将生理活性物质运送至肝实质细胞的试剂盒，该试剂盒含有(18)～(22)中任一项记载的囊泡以及药学上容许的载体。

[0082] (24)在对象中将生理活性物质运送至肝实质细胞的方法，该方法包含将(18)～(22)中任一项记载的囊泡给予对象的工序。

[0090] 本发明涉及一种囊泡，其特征在于，该囊泡含有下述(i)和(ii)，在该囊泡表面吸附有维生素E，或者维生素E化学结合至构成囊泡的两亲物，

[0091] (i)两亲物

[0092] (ii)包含具有阳离子性的物质和/或具有阴离子性的物质的有机物质。

[0093] 本发明中使用的两亲物，优选在水中互相聚集而形成纳米至亚微米的囊泡。另外，作为本发明的两亲物，可以列举选自以磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、聚乙二醇(PEG)加成磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、鞘磷脂、心磷脂、缩醛磷脂为代表的磷脂或胆固醇的多糖(普鲁兰多糖、甘露聚糖等)缩合物、聚乙二醇的聚氨基酸(聚天冬氨酸等)缩合物中的至少1种以上的磷脂和/或至少1种以上的聚合物缩合物。在本发明中，也可以将前述磷脂和/或前述聚合物缩合物与胆固醇并用作为两亲物。

[0094] 本发明中，作为磷脂酰胆碱，可以示例：蛋黄磷脂酰胆碱、氢化蛋黄磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰-油酰卵磷脂、二亚油酰磷脂酰胆碱、二亚麻酰磷脂酰胆碱、二癸酰磷脂酰胆碱、二芥酰磷脂酰胆碱、双二十碳酰磷脂酰胆碱、双二十碳三烯酰磷脂酰胆碱、双二十碳五烯酰磷脂酰胆碱、双二十二碳烯酰磷脂酰胆碱以及双二十二碳六烯酰磷脂酰胆碱等。

[0095] 作为磷脂酰乙醇胺，可以示例：蛋黄磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、二月桂酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰-油酰磷脂酰乙醇胺、二亚油酰磷脂酰乙醇胺、二亚麻酰磷脂酰乙醇胺、二癸酰磷脂酰乙醇胺、二芥酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳三烯酰磷脂酰乙醇胺、双二十碳五烯酰磷脂酰乙醇胺、双二十二碳烯酰磷脂酰乙醇胺以及双二十二碳六烯酰磷脂酰乙醇胺等。

[0096] 作为磷脂酰甘油，可以示例：蛋黄磷脂酰甘油、氢化蛋黄磷脂酰甘油、大豆磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、棕榈酰-油酰磷脂酰甘油、二亚油酰磷脂酰甘油、二亚麻酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、双二十碳酰磷脂酰甘油、双二十碳三烯酰磷脂酰甘油、双二十碳五烯酰磷脂酰甘油、双二十二碳烯酰磷脂酰甘油以及双二十二碳六烯酰磷脂酰甘油等。

[0097] 作为磷脂酰丝氨酸，可以示例：蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰丝氨酸、氢化大豆磷脂酰丝氨酸、二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰磷脂酰丝氨酸、二亚油酰磷脂酰丝氨酸、二亚麻酰磷脂酰丝氨酸、二癸酰磷脂酰丝氨酸、二芥酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳三烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳五烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十二碳烯酰磷脂酰丝氨酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酰丝氨酸等。

[0098] 作为磷脂酰肌醇，可以示例：蛋黄磷脂酰肌醇、氢化蛋黄磷脂酰肌醇、大豆磷脂酰肌醇、氢化大豆磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、棕榈酰-油酰磷脂酰肌醇、二亚油酰磷脂酰肌醇、二亚麻酰磷脂酰肌醇、二癸酰磷脂酰肌醇、二芥酰磷脂酰肌醇、双二十碳酰磷脂酰肌醇、双二十碳三烯酰磷脂酰肌醇、双二十碳五烯酰磷脂酰肌醇、双二十二碳烯酰磷脂酰肌醇以及双二十二碳六烯酰磷脂酰肌醇等。

[0099] 作为甲氧基聚乙二醇(mPEG)加成磷脂酰乙醇胺，可以选自：mPEG2000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二油酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二油酰磷脂酰乙醇胺以及mPEG5000-二油酰磷脂酰乙醇胺等。

[0100] 作为磷脂酸，可以示例：蛋黄磷脂酸、氢化蛋黄磷脂酸、大豆磷脂酸、氢化大豆磷脂酸、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二油酰磷脂酸、二亚油酰磷脂酸、棕榈酰-油酰磷脂酸、二亚麻酰磷脂酸、二癸酰磷脂酸、二芥酰磷脂酸、双二十碳酰磷脂酸、双二十碳三烯酰磷脂酸、双二十碳五烯酰磷脂酸、双二十二碳烯酰磷脂酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酸等。

[0101] 作为鞘磷脂，可以示例来源于蛋黄的鞘磷脂或来源于牛乳的鞘磷脂；

[0102] 作为心磷脂，可以示例：蛋黄心磷脂、氢化蛋黄心磷脂、大豆心磷脂、氢化大豆心磷脂、二月桂酰心磷脂、二肉豆蔻酰心磷脂、二棕榈酰心磷脂、二硬脂酰心磷脂、二油酰心磷脂、棕榈酰-油酰心磷脂、二亚油酰心磷脂、二亚麻酰心磷脂、二癸酰心磷脂、二芥酰心磷脂、双二十碳酰心磷脂、双二十碳三烯酰心磷脂、双二十碳五烯酰心磷脂、双二十二碳烯酰心磷脂以及双二十二碳六烯酰心磷脂等。

[0103] 此外，这里记载的仅为一例，只要是具有同种结构的物质，则可以不受这里记载的化合物的限制而加以使用。

[0104] 本发明中，使用核酸等聚阴离子性物质作为生理活性物质时，为了电偶联，可以使用具有阳离子性的物质作为囊泡的构成成分。作为具有阳离子性的物质，可优选示例阳离子脂质，更优选的，可示例由下述式(I)表示的化合物。

[0105] 式(I)

[0106]

[0107] (式中，R1和R2相同或不同，表示碳原子数12～22的饱和或不饱和的烃基，R3表示碳原子数1～6的烷基或碳原子数1～6的羟基烷基，m表示1～10的整数，X表示卤原子。)

[0108] 作为该化合物，可以示例：N-(α-三甲铵乙酰基)-二月桂基-D-谷氨酸氯化物、N-(α-三甲铵乙酰基)-二月桂基-L-谷氨酸氯化物、N-(α-三甲铵乙酰基)-双十八烷基-D-谷氨酸氯化物、N-(α-三甲铵乙酰基)-二油烯基-D-谷氨酸氯化物、N-ω-三甲铵癸酰基双十六烷基(デヘキサデシル)-D-谷氨酸溴化物、N-ω-三甲铵癸酰基双十六烷基-L-谷氨酸溴化物等，它们可以使用市售品(相互药工株式会社)。作为其他的阳离子性物质，也可以使用硬脂胺、油胺等饱和或不饱和脂肪族伯胺；二硬脂酰三甲铵丙烷、二油酰三甲铵丙烷等饱和或不饱和仲、叔胺；或选自DODAC(双十八烷基二甲基氯化铵)、DOTMA(N-(2，3-二油酰)丙基-N，N，N-三甲铵：N-(2，3-dioleyloxy)propyl-N，N，N-trimethylammonium)、DDAB(双十二烷基溴化铵)、DOTAP(1，2-二油酰氧基-3-三甲铵丙烷)、DC-Chol(3β-N-(N′，N′，-二甲氨基乙烷)氨甲酰基胆固醇盐酸盐：3β-N-(N′，N′，-dimethyl-aminoethane)-carbamol cholesterol hydro chloride)、DMRIE(1，2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-二甲基羟基乙铵)、DOSPA(2，3-二油烯基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸胺)中的至少1种以上的混合物。

[0109] 另外，还可以使用聚乙烯亚胺或聚赖氨酸作为聚阳离子。

[0110] 本发明中，使用细胞毒性物质、低分子抗病毒剂等非极性物质或者不含较多极性基团的物质作为生理活性物质时，可以使用(1)内包在囊泡内部、或者(2)与膜构成成分疏水结合而进入膜中的任一种方法。这时可以使用具有阴离子性的物质，达到利用静电排斥来防止囊泡之间凝集的目的。作为具有阴离子性的物质，可优选示例酸性磷脂。

[0111] 作为酸性磷脂，可以示例：磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、甲氧基聚乙二醇加成磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸。

[0112] 作为磷脂酰甘油，可以示例：蛋黄磷脂酰甘油、氢化蛋黄磷脂酰甘油、大豆磷脂酰甘油、氢化大豆磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、棕榈酰-油酰磷脂酰甘油、二亚油酰磷脂酰甘油、二亚麻酰磷脂酰甘油、二癸酰磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油、双二十碳酰磷脂酰甘油、双二十碳三烯酰磷脂酰甘油、双二十碳五烯酰磷脂酰甘油、双二十二碳烯酰磷脂酰甘油以及双二十二碳六烯酰磷脂酰甘油。

[0113] 作为磷脂酰丝氨酸，可以示例：蛋黄磷脂酰丝氨酸、氢化蛋黄磷脂酰丝氨酸、大豆磷脂酰丝氨酸、氢化大豆磷脂酰丝氨酸、二月桂酰磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰-油酰磷脂酰丝氨酸、二亚油酰磷脂酰丝氨酸、二亚麻酰磷脂酰丝氨酸、二癸酰磷脂酰丝氨酸、二芥酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳三烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十碳五烯酰磷脂酰丝氨酸、双二十二碳烯酰磷脂酰丝氨酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酰丝氨酸。

[0114] 作为磷脂酰肌醇，可以示例：蛋黄磷脂酰肌醇、氢化蛋黄磷脂酰肌醇、大豆磷脂酰肌醇、氢化大豆磷脂酰肌醇、二月桂酰磷脂酰肌醇、二肉豆蔻酰磷脂酰肌醇、二棕榈酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、二油酰磷脂酰肌醇、棕榈酰-油酰磷脂酰肌醇、二亚油酰磷脂酰肌醇、二亚麻酰磷脂酰肌醇、二癸酰磷脂酰肌醇、二芥酰磷脂酰肌醇、双二十碳酰磷脂酰肌醇、双二十碳三烯酰磷脂酰肌醇、双二十碳五烯酰磷脂酰肌醇、双二十二碳烯酰磷脂酰肌醇以及双二十二碳六烯酰磷脂酰肌醇。

[0115] 作为甲氧基聚乙二醇(mPEG)加成磷脂酰乙醇胺，可以选自：mPEG2000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化蛋黄磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-氢化大豆磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二月桂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG5000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、mPEG2000-二油酰磷脂酰乙醇胺、mPEG3400-二油酰磷脂酰乙醇胺以及mPEG5000-二油酰磷脂酰乙醇胺。

[0116] 作为磷脂酸，可以示例：蛋黄磷脂酸、氢化蛋黄磷脂酸、大豆磷脂酸、氢化大豆磷脂酸、二月桂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二油酰磷脂酸、二亚油酰磷脂酸、棕榈酰-油酰磷脂酸、二亚麻酰磷脂酸、二癸酰磷脂酸、二芥酰磷脂酸、双二十碳酰磷脂酸、双二十碳三烯酰磷脂酸、双二十碳五烯酰磷脂酸、双二十二碳烯酰磷脂酸以及双二十二碳六烯酰磷脂酸。

[0117] 本发明中，吸附或化学结合于囊泡表面的维生素E，没有特别的限定，可优选示例选自α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚以及δ-生育酚中的至少1种以上的维生素E。另外，作为维生素E的更优选的例子，可以列举：dl-α-生育酚。

[0118] 吸附或化学结合于囊泡表面的维生素E的量是足够血清中的粒子识别的量，具体优选的是，需要以构成囊泡的物质的总摩尔数的3～30％的范围吸附或化学结合；更优选的是，以构成囊泡的物质的总摩尔数的5～20％的范围吸附或化学结合。它们结合的比例小时，血清粒子对维生素E的识别力弱，向肝实质细胞的输送效率低。过多时，吸附的维生素E之间由于疏水结合而使囊泡之间容易聚集，因此平均粒径增大。由于平均粒径增大，从而容易被血液中的RES截留，其结果导致向肝实质细胞的输送效率也降低。在结合的情况下，作为两亲物的磷脂酰乙醇胺的氨基的前端与戊二酸等二元酸结合，可以利用一方的羧酸与维生素E的羟基缩合而成的酯等。只要血清成分能识别即可，因此也可以使用末端用活性基团取代的聚乙二醇来代替二元酸。使维生素E结合的方法不限于此，也可以使用一般公知的方法中的任一种。

[0119] 通过在上述的范围内添加维生素E，使血清粒子的识别力适当化，也能防止囊泡之间的聚集，因此可以实现向肝实质细胞的有效的输送。

[0120] 在向生物体外的实质肝细胞输送时，囊泡的粒径即使是20～500nm也足够了，但对生物体内静脉给予时，通过控制在50～150nm，可以不被RES截留，由血清中的以LDL为代表的粒子运送至肝实质细胞。

[0121] 囊泡的粒径过小时，输送生理活性物质的效率低，过大时，会被生物体内的RES截留而难以输送至肝实质细胞。因此，为了在体内(vivo)充分发挥输送效果，更优选具有50～150nm粒径的囊泡为总体的60％以上。本发明也包含一种囊泡集团，其特征在于，具有50nm～150nm粒径的囊泡为囊泡集团总体的60％以上。

[0122] 本发明涉及一种囊泡，该囊泡包封选自质粒DNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、抗病毒剂和细胞毒性物质中的至少1种以上的生理活性物质，和/或该生理活性物质与囊泡的成分疏水结合或静电结合。

[0123] 本发明涉及囊泡表面的ζ电位为阴离子型的囊泡。优选该生理活性物质通过与囊泡的成分静电结合而成为阴离子型，但其形态没有特别的限定。

[0124] 本发明中作为生理活性物质使用的siRNA没有特别的限定，优选地可以示例：含有序列号：1中记载的寡核糖核苷酸和序列号：2中记载的寡核苷酸的siRNA。

[0125] 本发明中作为生理活性物质使用的抗病毒剂，只要是抗HCV剂或抗HBV剂等以治疗病毒性肝病为目的的药剂即可，没有特别的限定，但优选为抗HCV剂。作为本发明的抗病毒药，不仅是抗HCV或HBV的质粒DNA、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸等核酸类的药物，还包括低分子抗病毒剂等。低分子抗病毒剂没有特别的限定，只要是病毒基因编码的聚合酶或蛋白酶等的抑制剂、其他具有抗病毒活性的低分子化合物即可，作为具体的化合物，可以示例利巴韦林(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)等。

[0126] 本发明中，作为细胞毒性物质，可以示例含有选自抗代谢药、铂类药、烷化剂、植物碱、分子靶向药、生物反应调节剂以及抗癌性抗生素中的至少1种以上的细胞毒性物质。

[0127] 作为抗代谢药，可以示例：依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷酯、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替吉奥、脱氧氟尿苷、奈拉滨、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯基嘌呤以及甲氨蝶呤。

[0128] 作为铂制剂，可以示例：奥沙利铂、卡铂、顺铂以及奈达铂。

[0129] 作为烷化剂，可以示例：异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、美法仑以及雷莫司汀。

[0130] 作为植物碱，可以选自伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、拓扑替康、紫杉醇、长春烯碱、长春新碱、长春地辛、长春碱；分子靶向药可以示例：伊马替尼、厄洛替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗、索拉非尼、帕尼单抗、贝伐珠单抗、硼替佐米。

[0131] 作为生物反应调节剂，可以示例：干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、白介素。

[0132] 作为抗癌性抗生素，可以示例：阿柔比星、表柔比星、柔红霉素、阿霉素、吡柔比星、博来霉素、丝裂霉素C以及米托蒽醌。

[0133] 本发明还涉及一种用于在血清存在下将生理活性物质运送至肝实质细胞的试剂盒，该试剂盒含有该囊泡以及药学上容许的载体。

[0134] 本发明的药物组合物以及试剂盒中，还可以含有药学上容许的载体。作为药学上容许的载体，例如可以列举：灭菌水、生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、柠檬酸、其他的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(PEG、Tween等)、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。另外，还可以包括其他的低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白等蛋白质，甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸以及赖氨酸等氨基酸，多糖以及单糖等糖类或碳水化合物，甘露醇、山梨醇等糖醇。制成注射用的水溶液时，例如可以列举：生理盐水、含有葡萄糖或其他的辅助药的等渗液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，还可以与适当的增溶剂，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子表面活性剂(聚山梨酯80、HCO-50)等并用。

[0135] 另外，根据需要，还可以封入微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微胶囊)，或者制成胶体释药系统(脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米粒以及纳米胶囊等)。

[0136] 另外本发明的试剂盒，还附有记载有试剂盒使用方法的操作说明书。

[0137] 本发明还涉及一种在对象中将生理活性物质运送至肝实质细胞的方法，该方法包含将该囊泡给予对象的工序。本发明的囊泡被给予对象后，由对象内的血清成分选择性地运送至肝实质细胞。

[0138] 本发明中对对象的给药，可以是口服给药、胃肠外给药中的任意一种，优选胃肠外给药。作为包含本发明的囊泡的组合物的形态(剂型)，没有特别的限制，可以列举：注射剂型、经鼻给药剂型、经肺给药剂型、透皮给药剂型、冻干剂型、溶液剂型等。

[0139] 作为注射剂型的例子，例如，可以通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部给药。另外，可以根据对象的状态(对象为人患者时，患者的年龄、症状)来选择适当的给药方法。

[0140] 含有由血清粒子输送的生理活性物质的囊泡，在肝实质细胞内直接发挥生理活性作用。例如生理活性物质为siRNA时，相对于以往技术中的经由肝细胞表面的糖蛋白受体而被输送的生理活性物质在溶酶体内会代谢分解，根据本发明技术则在48小时以内可见击倒作用(knockdown effect)。

[0141] 另外，一般已知在囊泡的表面静电结合有siRNA的正离子脂质体，但为了与细胞表面的相互作用，以低于阳离子脂质或阳离子聚合物的量添加作为阴离子的siRNA，使囊泡表面的ζ电位为阳性(阳离子性)而使用。但是，以残留阳离子性的状态直接给药至血中时，容易被肺中存在的RES截留或与血清中的白蛋白等结合，因此向肝实质细胞的输送效率变低。为了避免这种情况，使囊泡的表面的ζ电位变成负电位是极其重要的，必须采用如下方式：siRNA等核酸类生理活性物质在囊泡中的添加量高于阳离子脂质或阳离子聚合物的等电点。

[0142] 此外本说明书中引用的所有的背景技术文献，作为参照引入本说明书。实施例

[0143] 1.siRNA向生物体外肝实质细胞的输送(in vitro)

[0144] [实施例1]

[0145] 将N-(α-三甲铵乙酰基)-二油烯基-D-谷氨酸氯化物(相互药工株式会社、日本；商品名：DC-3-18:1)、二油酰磷脂酰乙醇胺(日油株式会社、日本)以及胆固醇(和光纯药株式会社、日本)按照配合比40∶30∶30(摩尔比)溶解在适量的氯仿中，使其一边在减压下蒸馏除去溶剂一边干固，制成脂质混合物。

[0146] 用干燥器干燥至能可靠地除去溶剂，然后在该脂质混合物中加入9％蔗糖溶液，在65℃加热下，用超声发生器间接地进行超声波照射，由此得到总脂质浓度为2.5mM的脂质体粗分散液。接着，为了使脂质体的粒径均匀，将两片孔径0.2μm的过滤器重叠并装入挤压机，在约65℃加热加压下挤压(挤出过滤)。进而用2片孔径0.1μm的过滤器同样进行挤压，将其制成空的脂质体分散液。平均粒径为136.1nm。

[0147] 以相对于DL-α-生育酚(东京化成株式会社、日本)5μmol、乙醇为400μL的比例溶解DL-α-生育酚，制备经0.2μm的过滤器过滤的滤液(生育酚液)。

[0148] 在50mL小瓶中加入脂质体分散液10mL，进而加入生育酚液400μL(相对于总脂质摩尔数为20％)，以涡流混合搅拌20秒。进而在室温下1小时进行1小时孵化，得到吸附有维生素E的脂质体分散液。平均粒径为124.2nm。

[0149] [实施例2]

[0150] 以相对于DL-α-生育酚(东京化成株式会社、日本)2.5μmol、乙醇为400μL的比例溶解DL-α-生育酚，制备经0.2μm的过滤器过滤的滤液(生育酚液)。

[0151] 在50mL小瓶中，加入[实施例1]中制成的脂质体分散液10mL，进而加入生育酚液400μL(相对于总脂质摩尔数为10.0％)，以涡流混合搅拌20秒。进而在室温下进行1小时孵化，得到吸附有维生素E的脂质体分散液。平均粒径为136.7nm。

[0152] [实施例3]

[0153] 以相对于DL-α-生育酚(东京化成株式会社、日本)3.75μmol、乙醇为400μL的比例溶解DL-α-生育酚，制备经0.2μm的过滤器过滤的滤液(生育酚液)。

[0154] 在50mL小瓶中，加入[实施例1]中制成的脂质体分散液10mL，进而加入生育酚液400μL(相对于总脂质摩尔数为15.0％)，以涡流混合搅拌20秒。进而在室温下1小时进行1小时孵化，得到吸附有维生素E的脂质体分散液。平均粒径为133.5nm。

[0155] [实施例4]

[0156] 将N-(α-三甲铵乙酰基)-二油烯基-D-谷氨酸氯化物(相互药工株式会社、日本；商品名：DC-3-18:1D)、二油酰磷脂酰乙醇胺(日油株式会社、日本)以及胆固醇(和光纯药株式会社、日本)按照配合比40∶30∶30(摩尔比)溶解在适量的氯仿中，使其一边在减压下蒸馏除去溶剂一边干燥，制成脂质混合物。用干燥器干燥至能可靠地除去溶剂，然后在该脂质混合物中加入9％蔗糖溶液，在65℃加热下，用超声发生器间接地进行超声波照射，由此得到总脂质浓度为2.5mM的脂质体粗分散液。接着，为了使脂质体的粒径均匀，将两片孔径0.2μm的过滤器重叠并装入挤压机，在约65℃加热加压下挤压(挤出过滤)。进而用2片孔径0.1μm的过滤器同样进行挤压，将其制成空的脂质体分散液。平均粒径为
138.7nm。

[0157] 然后，在100MPa的加压下使脂质体分散液通过Nano-Mizer mark II NM2-L200(吉田机械兴业株式会社、日本)3次，进行进一步的微粒化处理，结果平均粒径为55.7nm。

[0158] 以相对于DL-α-生育酚(东京化成株式会社、日本)5μmol、乙醇为400μL的比例溶解DL-α-生育酚，制备经0.2μm的过滤器过滤的滤液(生育酚液)。

[0159] 在50mL小瓶中加入脂质体分散液10mL，进而加入生育酚液320μL(相对于总脂质摩尔数为16％)，以涡流混合搅拌20秒。进而在室温下1小时进行1小时孵化，得到吸附有维生素E的脂质体分散液。平均粒径为58.0nm。

[0160] [比较例1]

[0161] 直接使用[实施例1]中制成的平均粒径136.1nm的脂质体分散液(未添加生育酚)。

[0162] [比较例2]

[0163] 将DL-α-生育酚(东京化成株式会社、日本)20μmol溶解在400μL的乙醇中，制备经0.2μm的过滤器过滤的滤液(生育酚液)。

[0164] 在50mL小瓶中加入[实施例1]中制成的脂质体分散液5mL，进而加入制得的生育酚液200μL(相对于总脂质摩尔数为80.0％)，以涡流混合搅拌20秒。进而在室温下进行孵化1小时，得到吸附有维生素E的脂质体分散液。平均粒径为190.1nm。

[0165] 使用上述制备的各种脂质体(上述[实施例1]～[实施例3])以及[比较例1]～[比较例2])，进行生物体外的向肝实质细胞的导入试验(体外试验)以及对小鼠的导入试验(体内试验)，将实施例与比较例进行比较，以下表示本发明的效果。

[0166] 此外，实施例不仅局限于此，载明了其只不过是一例。

[0167] [细胞试验实施例1]设计的siRNA的丙型肝炎小鼠(HCV)复制子复制抑制活性的研究

[0168] 丙型肝炎在日本国内有200万人，全世界有高达2亿人以上的感染者，是一种很严重的传染病。其明显的特征在于：如果人感染了丙型肝炎病毒(HCV)，则有高达80～90％的比例会持续感染，会引发慢性肝炎、甚至肝细胞癌。虽然通过现行的聚乙二醇化干扰素-利巴韦林联合疗法有提高的治疗效果，但还不能说治疗效果充分，开发更有效且副作用少的疗法是当务之急。因此，尝试了用短的双链RNA(siRNA)来控制HCV。

[0169] 从发现短的双链RNA(siRNA)能避开哺乳类细胞的干扰素(IFN)应答，引起RNAi开始，作为基因敲减法至今仍广泛使用。但是近年来有报道称siRNA还能利用脱靶(Off Target)效应来诱导IFN应答，不仅研究了缩短双链RNA(dsRNA)的长度，而且还研究了序列、核酸修饰等改良。本发明人促进了作为新型的抗病毒疗法被期待的RNA干涉(RNAi)产生的HCV复制抑制，以及面向治疗应用的由siRNA产生的HCV靶向。但是，很难有效地将siRNA导入靶脏器即肝脏，开发药物释放系统(DDS)成为当务之急。为了解决该问题进行了以下的研究。

[0170]

[0171] 本实施例中，使用R6 FLR41-14细胞(Watanabe，T.et al.，Gene Theraphy 13：883-892(2006))作为含有荧光素酶基因的HCV复制子细胞，进行siRNA试验。对各细胞的细胞数进行计数，混悬于含有10％灭活FCS的DMEM+GlutaMax-I中，R6FLR41-14细胞以4500细胞/100μL/孔接种于96孔中，第二天进行siRNA的转染。siRNA使用si197-1(有义链
5′-AUCAUGAGCACAAAUCCUAAA-3′、序列号：1；反义链3′-CGUAGUACUCGUGUUUAGGAU-5′、序列号：2)。siRNA的终浓度为0.01、0.04、0.11、0.33、1、1.1、3、3.3、10、30、90nM。

[0172] 将各siRNA样品用含有0.23％的NaHCO3的opti-MEM由90nM以3倍阶段稀释制成10阶段的稀释系列。在50μL的siRNA溶液中分别添加0.5μL的[比较例1]的脂质体分散液、或者加入了生育酚而制备的[实施例1]和[实施例2]记载的脂质体分散液。充分混合后，在室温孵化20分钟，制成siRNA-脂质体复合体。在荧光素酶分析用的细胞培养用多板96FII(白)(住友Bakelite、日本cat.#MS-8096W)和细胞毒性测定用的96孔板(BD，cat.#353072)中分别以n＝3且10μL/96-孔加入各稀释系列的样品。将分别只添加[比较例1]的脂质体分散液或者加入了生育酚而制备的[实施例1]和[实施例2]记载的脂质体分散液的孔(Lipo CTRL)作为对照。在37℃、5％CO2的条件下进行孵化，72小时后进行荧光素酶分析以及采用WST-8的细胞毒性试验。

[0173] 将各接合(conjugation)前后的粒径和ζ电位示于表1。

[0174] [表1]

[0175] 囊泡的粒径和ζ电位

[0176]

[0177] *：NICOMP(Particle Sizing Systems，Inc.Calif.USA)使用体积重量；由数据使用ZPW388(Particle Sizing Systems，Inc.Calif.USA)

[0178] 由表1可知，在接合siRNA前后，ζ电位可以由阳离子变成阴离子。

[0179] <荧光素酶活性测定方法>

[0180] 在荧光素酶活性测定中，使用Bright-Glo荧光素酶分析体系(Promega，cat.#E2620)。方法依据论文(Watanabe，T.et al.，Gene Therapy13：883-892(2006))。

[0181] 将荧光素酶分析用96孔板的所有孔的培养基全部废弃，以75μL/孔加入含有5％灭活FCS的DMEM+GlutaMax-I，进行培养基交换。以75μL/孔加入Bright-Glo荧光素酶分析体系，用Mithras LB 940(Berthold)振摇1分钟后，测定荧光素酶活性。

[0182] <细胞毒性测定>

[0183] 在细胞毒性测定中，使用细胞计数试剂盒-8(Dojindo，cat.#343-07623)。

[0184] 将细胞计数试剂盒-8溶液用含有5％灭活FCS的DMEM+GlutaMax-I稀释至7％，制成试验用的溶液。将细胞毒性试验用的96孔板的所有孔的培养基全部废弃，以100μL/孔加入上述的试验用的溶液，在37℃、5％CO2的条件下孵化1小时。使用微板读出器(microplate reader，Bio-Rad model 550)，在波长450nm(参照波长655nm)测定。

[0185] 由其结果可知，添加有生育酚的[实施例1]和[实施例2]中制造的脂质体分散液显示出很强的HCV复制子复制抑制活性，而细胞毒性轻微。与[比较例1]的脂质体分散液相比，[实施例2]中制造的脂质体显示出约100倍、[实施例1]中制造的脂质体分散液显示出约1000倍的HCV复制子复制抑制活性(图1、图2)。

[0186] 2.siRNA向生物体内肝实质细胞的输送(in vivo)

[0187] [动物试验实施例1]设计的siRNA在HCV基因导入小鼠中的抑制活性的研究[0188]

[0189] 为了解HCV的持续感染成立机理、向慢性肝炎/肝硬化/肝癌的转变机理，进行了病态模型的转基因(Tg)小鼠制作。作为与HCV感染更接近的模型，建立了HCV结构蛋白区表达Tg小鼠(CN2小鼠)，其中使用了能在任意时期开关表达HCV基因的Cre/loxP重组系统。迄今为止作为开关的方法，进行过表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)的静脉内给药。但在AxCANCre法中，也会引起小鼠对腺病毒的免疫应答。因此本发明人通过将用Cre/loxP系统导入了HCV基因的转基因小鼠与诱导Cre的Mx-Cre转基因小鼠进行交配，从而制成能在任意时期开关表达HCV基因的转基因(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg)小鼠。在MxCre Tg小鼠中，Cre DNA重组酶通过干扰素(IFN)反应性Mx1启动子进行表达，因此通过给予poly-IpC(以下记为pIpC、双链RNA)而产生的IFN的诱导会引起开关。对该小鼠每隔1天腹腔内给予pIpC 3次。从初次给予后第0.5天开始可见HCV核心蛋白质的表达，在第7天达到915pg/mg(肝总蛋白质量)的峰值。之后，虽然有减少倾向，但在第21天也有435pg/mg，表达持续。而且，该表达即使经过6个月也可以维持相同的水平(图3、图4)。

[0190] <向HCV基因导入小鼠给予siRNA>

[0191] 对基因表达43天后的Cre/loxP/HCV-MxCre Tg小鼠给予[实施例1]制造的脂质体分散液和si197-1复合体(0.3mg siRNA/kg体重)，评价其RNAi活性。在给药后第2天剖检，进行肝脏组织的采样。使用ELISA法(Ortho HCV核心蛋白ELISA试剂盒)对该肝脏中的HCV核心蛋白质量进行定量，评价RNAi活性。与siCTRL(Dharmacon公司；siCTRL3)给药组相比，禁食、非禁食组的HCV核心蛋白质量均可见显著降低(图5)。这表明，与迄今为止报道的物质(Watanabe，T.et al.，J.Hepatology 47：744-750(2007))相比，显示出50倍以上的强抑制活性。

[0192] 产业上的可利用性

[0193] 使用本发明的组合物时，可以在血清存在下将生理活性物质非常有效地导入至生物体外和生物体内的肝实质细胞，因此不仅作为试剂，作为药物也非常有用。

[0194] 另外，本发明具有以下特征：通过使维生素E吸附或化学结合于粒子，从而血清中的LDL(低密度脂蛋白)等识别维生素E，并通过肝实质细胞的受体而将粒子运送至肝实质细胞内。由于具有最优化的粒子粒径以及表面电荷，因此这些粒子不会进入非实质细胞，可以特异性地将囊泡粒子运送至肝实质细胞内。