[0001] 本发明属于转基因生物安全技术领域，具体涉及一种利用基因拆分控制转基因飘流的方法。

[0002] 随着转基因技术的兴起和快速发展，转基因生物的安全性问题相伴而生，由转基因生物引发的安全问题，逐渐成为国际社会广泛关注的热点和焦点。在科技界和公众关注的转基因作物(GMC)安全性问题中，转基因飘流及其可能引起的环境后果和对人类健康的影响是问题的焦点之一。虽然基因飘流历来存在，并非从GMC开始，且是植物物种进化的动力，但遗传上远缘的外源基因在导入到一个新的遗传背景中后会产生何种新的变化，对环境和食品安全性有何影响，需要根据基因的种类、基因所提供的表型性状、以及转基因植物释放的环境等因素进行个案分析。这是一个耗时、费力、需要投入的复杂过程，加之转基因产品要让公众接受，最好的办法是从根本上杜绝基因飘流，保障GMC的环境和食品安全。

[0003] 目前防止和减少转基因飘流的技术，主要是采取时空隔离(距离隔离、花期隔离)、摘除花器或限制开花、雄性不育等，这些可称为减少基因飘流的现有技术。时空隔离已进行了许多研究，如明确不同作物的最大基因飘流距离，提出相应的距离和花期隔离措施。雄性不育虽可使转基因作物不产生花粉，可有效地用于不需采收种子的植物如林木、牧草、花卉等，但对生产上应用杂交种的作物如杂交水稻而言，该法仍不能避免基因飘流，因为即便用于配制杂交种的父本不产生花粉，但杂种F1在大面积生产中仍将有花粉飘出。因此总体上说，以上现有技术只能限制或减少基因飘流，并不能从根本上解决基因飘流的问题。
探索研究用生物学限控措施防止基因飘流的新一代技术，已成为国际研究的热点和前沿课题，它不仅是一项为发展新一代技术的基础研究，而且对进一步促进和推动GMC的产业化具有重要的现实意义。

[0004] 基因拆分技术是建立在Intein(蛋白内含子)及其介导的蛋白剪接的基础上发展起来的，简单说就是将目的基因拆分成两个基因片段，分别与Intein两个剪接域的基因序列结合，形成融合基因，翻译后形成的两个融合蛋白通过Intein介导的蛋白剪接功能，将Intein从前体蛋白中切除，同时将两个基因片段编码的蛋白序列连接起来，形成一个完整的、有功能的蛋白。

[0005] Intein是一类介导翻译后蛋白剪接的内部蛋白元件，前体蛋白中Intein催化一系列反应，将其自身从前体蛋白中移去，并将两侧称为Extein的蛋白片段以正常的肽键连接起来形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接。蛋白剪接是一个非常快速的过程，Intein-Extein连接处的3个保守的氨基酸残基直接参与蛋白的拼接反应，包括Intein N末端的Ser或Cys(基序A的第一个氨基酸)，InteinC末端的Asn或Gln(基序G的最后一个氨基酸)，C-extein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中发现的。1990年Kane等在研究酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡H(+)2ATPase的69kD亚基基因vma1时，首次发现蛋白质的自我剪接现象(Kane PM，Yamashiro CT，Wolczyk DF，Neff N，Goebl M，Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFP1 gene product to the 69-kD subunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase.Science250：651-657)。Intein普遍存在于三界生物系统(古细菌、真细菌和真核生物)中，目前已发现了200多个(Thomas C，Evans Jr，Xu MQ，Pradhan S(2005)Protein splicing elements and plants：from transgene containment to protein purification.Annu Rev Plant Biol 56：375-392)。Intein一般由128-1650个氨基酸残基所组成，含有高度保守的基序A、B、F和G(Noren CJ，Wang J，Perler FB(2000)Dissecting the chemistry of protein splicing and its applications.Angew Chem Int Ed Engl 39(3)：450-466)。根据Intein是否含有居家核酸内切酶(homing endonuclease)结构域，可将其分为大Intein和小Intein，大Intein含有居家核酸内切酶结构域、N端和C端剪接域，其中居家核酸内切酶结构域不参与蛋白剪接，推测其功能是通过自导引的机制来促进Intein的转移(Gimble FS，Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae.Nature 357：301-306)。另外，根据N端和C端剪接域是否为共价连接，可将Intein分为cis-splicing inteins和trans-splicing inteins(Wu H，Xu MQ，Liu XQ(1998)Protein trans-splicing and functional mini-Inteins of a cyanobacterial DnaB Intein.Biochim Biophys Acta 1387：422-432)。

[0006] Synechocystis sp.PCC6803 DnaE Intein(Ssp DnaE Intein)是目前发现的唯一一个天然存在的trans-splicing intein，它存在于编码复制DNA聚合酶III的催化亚基α的DnaE基因中，有123个氨基酸残基的In(Intein N端)和36个氨基酸残基的Ic(Intein C端)两个片段组成，In和Ic间插入了745kb的DNA间隔区域(Wu H，Hu Z，Liu XQ(1998)Protein trans-splicing by a split Intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp.PCC6803.Proc Natl Acad Sci USA 95：9226-9231)。与人工合成的Intein相比，DnaE Intein催化的蛋白剪接反应有效率高和反应条件温和等特点，且SsP DnaE Intein片段In和Ic离体条件下不经尿素处理也能进行剪接(Yamazaki T，Otomo T，Oda N，et al.(1998)Segmental isotope labeling for protein NMR using peptide splicing.J Am Chem Soc 120：5591-5592)。实验证明Ssp DnaE Intein在离体、活体条件下均能进行蛋白质的剪接反应(Evans TC，Martin D，Kolly R，et al.(2000)Protein trans-splicing and cyclization by a naturally split intein from the DnaE gene of Synechocystis species PCC6803.J Biol Chem 275：9091-9094)，使分开的两个基因片段表达后的蛋白片段重新组装成有功能的完整蛋白质，如Chin等将抗除草剂基因(EPSPS)的N端部分(含有一个叶绿体定位信号)与Ssp DnaE intein N-端整合形成EPSPSn-In，利用根癌农杆菌介导的转化方法整合到烟草核基因组DNA中；EPSPS基因片段的C-端部分(EPSPSc)和intein C-端融合形成Ic-EPSPSc，通过同源重组的方法将其整合到烟草叶绿体基因中。Western blot分析显示转基因植物中存在全长的EPSPS，且这些转基因植物和野生型受体烟草相比，对草甘膦的抗性有了提高。该研究用Ssp DnaE intein证明了intein介导的转剪接可在烟草叶绿体中发生，并且无论intein基因片段均在叶绿体中表达还是被分开在叶绿体和核基因组中表达，intein的转剪接都能发生(Hang GC，Gun-Do Kim，Ivan Marin et al.(2003)Protein trans-splicing in transgenic plant chloroplast：reconstruction of herbicide resistance from split genes.PNAS 100：4510-4515)。
Yang 等 (Yang J，Fox GCJr，Henry-Smith TV(2003)Intein-mediated assembly of a functional beta-glucuronidase in transgenic plants.Proc Natl Acad Sci USA 100：
3513-3518)将Ssp DnaE Intein的N端和C端序列分别与拆分的β-葡糖醛酸苷酶(GUS)基因的N端或C端连接组成融合基因，GUSn/In与Ic/GUSc质粒通过共转化、或分别转化后通过杂交同时被导入拟南芥基因组时，GUS基因表达了β-葡糖醛酸苷酶的活性。

[0007] 因此从理论上推测，蛋白质转剪接有可能用于阻止转基因作物中的转基因向近缘种的基因飘流。将目的基因拆分成没有活性的N-端与C-端两部分，然后分别与intein的N-端与C-端相融合，在预定的细胞器或组织中表达后，通过intein的自我剪接功能将它们连在一起，形成有功能活性的蛋白质(Evans TC，Xu MQ，Sriharsa P(2005)Protein splicing elements and plants：from transgene containment to protein purification.Annu Rev Plant Biol，56：375-392；Muhammad SK，Khalid AM，Malik KA(2005)Intein-mediated protein trans-splicing and transgene containment in plastids.Trends Biotech，23(5)：217-219)。研究发现植物叶绿体中有强烈的蛋白质拼接现象，这一发现为阻断转基因飘流提供了美好的前景(Dale PJ，Clarke B，Fontes EM(2002)Potential for the environmental impact of transgenic crops.Nature Biotechnology，20：567-574)。

[0032] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书，实施例中所述百分浓度如无特别说明均为质量百分浓度。

[0033] 实施例1、基因拆分技术限控转G2-aroA基因烟草的基因飘流(单独转化)[0034] 1)转基因烟草的获得

[0035] 根据G2-aroA基因的可拆分位点F295/T296，利用PCR方法将G2-aroA基因分成N端和C端两部分，并分别与Ssp DnaE intein的N端和C端连接，形成融合基因片段EnIn和IcEc。将融合基因片段EnIn和IcEc分别转入植物表达载体pG2，构建成EnIn和ICEC融合基因片段的植物表达载体pEnIn和pICEC。构建的植物表达载体基因表达框如图1所示，外源基因前面带有Rubisco小亚基的叶绿体导肽，并由Rubisco小亚基启动子驱动，3’末端为Rubisco小亚基的终止子，筛选标记基因为nptII。农杆菌介导法转化烟草，获得单独含有EnIn和单独含有ICEC的转基因烟草，PCR检测(图2)证明基因已整合到烟草基因组中(PCR引物根据GeneBank上公布的G2-aroA基因、Ssp DnaE Intein N端和Ssp DnaE Intein C端核苷酸序列设计，检测EnIn融合基因片段的引物为R1、L1，其序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，检测ICEC融合基因片段的引物为R2、L2，其序列如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示)。

[0036] 2)转基因烟草拷贝数分析

[0037] 将单独含有EnIn基因片段、单独含有IcEc基因片段的转基因烟草T1代种子经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素的MS0培养基上进行培养，观察幼苗的生长情况，生长正常的幼苗为卡那抗性苗，萌发后即黄化死亡的幼苗为非卡那抗性苗。20天后统计卡那抗性苗和非卡那抗性苗的数量。统计数据如表1所示。结果分析发现，含有EnIn片段的转基因烟草中有4株、含有IcEc片段的转基因烟草中有6株符合3∶1的分离比，推测这些转基因烟草中的基因是以单拷贝的形式插入的(表1)。

[0038] SYBR Green实时荧光定量PCR的方法是测定外源基因拷贝数的一种好方法。本研究通过绘制rnr2(烟草核基因组上已知的单拷贝内源基因)和nptII(转基因烟草中含有的筛选标记基因的)的标准曲线，并根据标准曲线确定了样品中rnr2和nptII的含量，再利用两者之间的比例关系乘以内源性rnr2基因的拷贝数来确定外源基因nptII的整合拷贝数。通过分析发现EnIn基因片段(编号为N-33)和IcEc(编号为C-11)基因片段均为单拷贝，与在与在培养基上获得的结果相吻合。

[0039] 表1 不同类型转基因烟草T1代种子在含100mg/L卡那霉素培养基上的抗感分离情况

[0040]2

[0041] N：含有EPSPSn-In的转基因烟草；C：含有Ic-EPSPSc的转基因烟草；χ0.05＝3.84[0042] *表示卡方值小于3.84的，即其分离比与理论值之间没有显著差异。

[0043] 将单独含有EnIn基因片段(编号为N-33)、单独含有IcEc基因片段(编号为C-11)的转基因烟草T2代种子经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素的MS0培养基上进行培养，观察幼苗的生长情况，生长正常的幼苗为卡那抗性苗，生长特别小的为非卡那抗性苗。20天后统计卡那抗性苗和非卡那抗性苗的数量，全部为卡那抗性苗的为纯合系，结果得到了单独含有EnIn基因片段和单独含有IcEc基因片段的纯合系。

[0044] 4)基因拆分后的重新组装效率分析和杂交种纯系植株的筛选

[0045] 通过单独含有EnIn基因片段(编号为N-33)、单独含有IcEc基因片段(编号为C-11)的转基因烟草纯合系的有性杂交，获得了同时含有EnIn和IcEc基因片段的转基因烟草杂交种。将收获的杂交种种子(T1代)经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素和0.3mM草甘膦的MS0培养基上进行培养，能够在草甘膦培养基上生长的为草甘膦抗性苗。

[0046] 20天后统计草甘膦抗性苗与非抗性苗之间的比例，计算基因拆分后蛋白的重新组装效率。每皿接种40粒，每个样本接3皿。结果发现杂交种种子在0.3mM草甘膦培养基上100％能够生长，进一步证明基因拆分后的重新组装效率很高，可达100％。

[0047] 将T1代抗性苗种植于大田直到成熟，分单株收获种子，将收获的杂交种种子(T2代)经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素和0.3mM草甘膦的MS0培养基上进行培养，能够在草甘膦培养基上生长的为草甘膦抗性苗，全部为抗性苗的株系为纯系，若本代未能筛选出纯系，分单株收获T2代植株种子(T3代)，继续采用上述筛选方法直至筛选出纯系。

[0048] 5)转基因烟草杂交种基因飘流研究

[0049] 转基因烟草杂交种与受体材料NC89回交，收获的种子播种到0.3mM草甘膦的MS培养基上进行培养，未发现抗草甘膦苗，证明利用这种方法获得的转基因材料不存在基因飘流的风险。

[0050] 实施例2、基因拆分技术限控转G2-aroA基因烟草的基因飘流(共转化)[0051] 1)转基因烟草的获得

[0052] 根据G2-aroA基因的可拆分位点F295/T296，利用PCR方法将G2-aroA基因分成N端和C端两部分，并分别与Ssp DnaE intein的N端和C端连接，形成融合基因片段EnIn和IcEc。分别构建了EnIn和ICEC融合基因片段的植物表达载体pEnIn和pICEC。构建的植物表达载体基因表达框如图1所示，外源基因前面带有Rubisco小亚基的叶绿体导肽，并由Rubisco小亚基启动子驱动，3’末端为Rubisco小亚基的终止子，筛选标记基因为nptII。农杆菌介导法共转化烟草，获得含有EnIn和ICEC的转基因烟草，PCR检测证明基因已整合到烟草基因组中。

[0053] 2)转基因烟草纯合系的获得

[0054] 将含有EnIn基因片段和IcEc基因片段的转基因烟草T1代种子经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素的MS0培养基上进行培养，观察幼苗的生长情况，生长正常的幼苗为卡那抗性苗，生长特别小的为非卡那抗性苗。

[0055] 将T1代抗性苗种植于大田直到成熟，分单株收获种子，将收获的杂交种种子(T2代)经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素的MS0培养基上进行培养，全部为抗性苗的株系为纯系，若本代未能筛选出纯系，分单株收获T2代植株种子(T3代)，继续采用上述筛选方法直至筛选出纯系。

[0056] 3)转基因烟草杂交种基因飘流研究

[0057] 转基因烟草杂交种与受体材料NC89回交，收获的种子播种到100mg/L卡那霉素的MS培养基上进行培养，未发现抗卡那霉素苗，证明利用这种方法获得的转基因材料不存在基因飘流的风险。

[0058] 实施例3：基因拆分技术与叶绿体转化技术相结合限控转基因烟草基因飘流[0059] 1)转基因烟草的获得

[0060] 根据G2-aroA基因的可拆分位点F295/T296，利用PCR方法将G2-aroA基因分成N端和C端两部分，并分别与Ssp DnaE intein的N端和C端连接，形成融合基因片段EnIn和IcEc。分别构建了EnIn的核转化载体pEnIn和ICEC融合基因片段的叶绿体转化载体pICEC。利用农杆菌介导法将EnIn导入烟草核基因组中，基因枪法将ICEC融合基因片段导入烟草叶绿体基因组中。

[0061] 2)同时含有2个基因片段的转基因烟草的获得

[0062] 以含有ICEC融合基因片段的转基因烟草为母本，以含有EnIn融合基因片段的转基因烟草纯合系为父本进行杂交，获得同时含有2个基因片段的转基因烟草杂交种。

[0063] 3)转基因烟草杂交种草甘膦抗性分析和纯系筛选

[0064] 收获的杂交种种子(T1代)，2个亲本的种子播种到含有0.3mM草甘膦的MS培养基上进行培养，发现2个亲本均不抗草甘膦，而杂交种100％抗草甘膦。

[0065] 将T1代抗性苗种植于大田直到成熟，分单株收获种子，将收获的杂交种种子(T2代)经NaClO消毒灭菌后，接种到含有100mg/L卡那霉素和0.3mM草甘膦的MS0培养基上进行培养，能够在草甘膦培养基上生长的为草甘膦抗性苗，全部为抗性苗的株系为纯系，若本代未能筛选出纯系，分单株收获T2代植株种子(T3代)，继续采用上述筛选方法直至筛选出纯系。

[0066] 4)转基因烟草杂交种基因飘流研究

[0067] 转基因烟草杂交种与受体材料NC89回交，收获的种子播种到0.3mM草甘膦的MS培养基上进行培养，未发现抗草甘膦苗，证明利用这种方法获得的转基因材料不存在基因飘流的风险。