[0001] 本发明涉及鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，尤其涉及一种通过水稻标志性代谢物含量的变化鉴别转基因水稻和非转基因水稻的方法，属于转基因植物的检测领域。

[0002] 人类基因组测序工作的完成后，基因功能的研究逐渐成为热点，现在已有一系列的组学研究，代谢组学是众多组学中的一种，它是通过考察生物体系受刺激或扰动(如将某个特定基因导入)，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门学科。所谓代谢组是基因组的下游产物即终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子。
植物代谢组学主要是通过研究植物细胞中的代谢组在基因变异或环境因素变化后的响应变化，去研究基因型和表型的关系及揭示一些沉默基因的功能。大多集中在代谢轮廓或代谢物指纹图谱上。2003年，Fiehn等人利用GC/MS技术通过对不同表型葫芦韧皮部的433种代谢物进行代谢组学分析，结合化学计量学方法对这些植物的表型进行了分类，找到了4种在分类中起着相当重要作用的代谢物质：苹果酸和柠檬酸、葡萄糖和果糖。最近，Arbona等人利用非靶标的LC-MS和GC-MS代谢物轮廓谱，结合化学计量学方法对柑橘属和李属的不同品种植物叶提取物进行了分型。

[0003] 随着各国转基因标识制度的相继建立和公众对转基因产品关注度的提高，截至2009年底，我国批准发放了转基因棉花、番茄、矮牵牛、辣椒、番木瓜、水稻、玉米等植物的安全证书。因此，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也就成了研究热点。常用的定性PCR检测技术仅鉴定筛选基因(如35S启动子、NOS终止子、报告基因等)极易出现假阳性，已经不能满足转基因产品检测的要求。因为35S启动子存在于天然花椰菜花叶病毒，NOS终止子存在于植物病毒Ti质粒中，抗生素类报告基因自然界中也普遍存在。对于含有相同外源DNA的不同转基因作物，不能鉴别出转基因同属植物是哪种转化事件，如Mon809和Mon810。对于复合性状的转基因杂交新品种，如最新获得安全证书的由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系转基因抗虫水稻“华恢
1号”与“珍汕97A”所配的杂交组合“Bt汕优63”。目前，全球还没有找到合适的品系特异性检测手段。随着新技术和新仪器的出现，转基因检测技术得到了不断发展，当转基因产品的化学成分较非转基因产品有很大变化时，利用色谱-质谱联用技术结合化学计量学方法可以鉴别转基因产品。目前尚未发现有关利用转基因水稻C418-Xa21与非转基因水稻C418的代谢物指纹图谱进行分型的专利。

[0014] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0015] 一、试验材料

[0016] 1、转基因水稻植物C418-Xa21可按照文献所公开的方法构建得到(李晓兵等：经基因工程改良的抗白叶枯病水稻梗型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻.生物工程学报，17卷4期，2001年7月)；

[0017] 2、非转基因水稻C418种子可通过商业途径购买得到，例如可购自辽宁农科院稻作所或北方杂交梗稻研究中心；

[0018] 实施例1转基因水稻C418-Xa21和非转基因水稻C418的鉴定

[0019] 分别提取转基因水稻C418-Xa21和非转基因水稻C418的DNA，以所提取的DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增(该PCR扩增的体系组成和PCR扩增的具体条件可参考文献方法：李晓兵等：经基因工程改良的抗白叶枯病水稻梗型恢复系“C418-Xa21”及其杂交稻.生物工程学报，17卷4期，2001年7月)

[0020] P1：5′-CGATCGGTATAACAGCAAAAC-3′

[0021] P2：5′-ATAGCAACTGATTGCTTGG-3′

[0022] 转基因水稻C418-Xa21和非转基因水稻C418的PCR扩增及鉴定结果见图1。

[0023] 实施例2

[0024] 将转基因水稻C418-Xa21种子和非转基因水稻C418种子在30℃暗室中水中浸-2 -1泡2天，萌发后在人工气候培养箱中土培，光强度为365μE m s ，光照时间为14h、温度为
28℃，暗培养时间为10h、温度为24℃；采集转基因水稻C418-Xa21和非转基因水稻C418人工气候培养箱培养生长至6周鲜叶约100mg，放在加有一钢珠的2mL圆底离心管中，立即液氮冷冻。随后将离心管放在液氮预冷的球磨仪适配器中进行25Hz，2min的震荡，在研磨后的样品中加入水/甲醇(1∶4)1mL，然后在热混合仪中进行1250rpm、4℃条件下提取
15min，重复提取两次，15000rpm，4℃离心30min，合并上清，并采用0.22上m的微孔滤膜过滤后取100μL进行真空浓缩干燥4h。然后加入40μL盐酸甲氧胺(20mg/mL溶于吡啶)在热混合仪中进行250rpm，30℃孵育90min，最后加入60μL MSTFA.1％TMCS在热混合仪中进行250rpm，37℃硅烷化反应30min，所有样品随机进样进行GC-MS分析。将获得的代谢物指纹图谱元数据直接导入AMDIS2.66进行处理获得.Elu和.Fin两种格式的数据文件，再合并这两种格式的文件导入MPP 2.0统计分析软件进行PCA分析。获得p＜0.05水平的导致转基因水稻C418-Xa21(□)和非转基因水稻C418(Δ)分型的标志代谢物为莽草酸(Shikimic acid)和半乳糖醛酸(Galacturonicacid)(图2)。

[0025] 在此基础上，本试验测定了12个批次的转基因水稻C418-Xa21叶中的莽草酸(Shikimic acid)和半乳糖醛酸，试验结果见表1。

[0026] 试验结果发现，所测定的12个批次的转基因水稻C418-Xa21叶中的莽草酸(Shikimic acid)和半乳糖醛酸含量相比于非转基因水稻C418均呈显著性下降(P＜0.05，其中，莽草酸的含量平均下降了3.1倍，半乳糖醛酸的含量平均下降了3.6倍。

[0027]

[0028] ↑or↓：表示相对C418，C418-Xa21中物质的量变化的高低水平。