技术领域 本发明涉及一种改进的液化含淀粉原料(starch containing material)的 方法，该方法适合作为生产糖浆或发酵产物优选乙醇的方法中的步骤。本 发明还涉及生产发酵产物，优选乙醇的方法，包含根据本发明的液化方法 液化含有淀粉的起始原料。 背景技术 在从含淀粉原料中生产糖浆和发酵产物如乙醇的技术领域中，液化是 一熟知的工序。在液化过程中，淀粉转化为链较短和粘性较小的糊精。一 般来说，液化包括淀粉的凝胶化，并在凝胶化的同时或之后加入α-淀粉酶。 WO 94/18314公开了一种用于淀粉液化作用的氧化稳定的芽孢杆菌 (Bacillus)α-淀粉酶变体，该淀粉液化作用包括在105-107℃时蒸汽加压 蒸煮(jet cooking)，接着95℃次级液化90分钟。 WO 99/19467公开了使用芽孢杆菌α-淀粉酶变体液化含淀粉原料的方 法，其中初级液化在105℃进行5分钟，次级液化在95℃、初始pH为5.5 的条件下进行。 尽管液化方法已经得到了显著的改进，但仍然有必要改进适于在糖浆 和发酵产物生产过程中使用的液化含淀粉原料的方法。 发明概要 本发明的目的是提供改进的适于作为生产糖浆或发酵产物(如特别是 乙醇)过程中的步骤的液化含淀粉原料的方法。本发明还提供生产发酵产 物，优选乙醇的方法，其包括本发明的液化方法。 本发明第一个方面涉及液化含淀粉原料的方法，包含在65-75℃范围 内用细菌α-淀粉酶处理含淀粉原料1-2个小时。 在优选的实施方案中，液化在约70℃下进行约90分钟。本发明的液化 方法可以在pH4.5-6.5下进行，特别是在pH5-6之间。细菌α-淀粉酶可以 是下文“α-淀粉酶”部分描述的任何α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶来源于芽孢杆 菌属菌株。 本发明另一方面提供一种通过发酵从含淀粉原料中生产乙醇的方法， 所述的方法包括： (i)根据本发明的液化方法液化含淀粉原料。 (ii)糖化在步骤(i)中获得的醪液(mash)。 (iii)用发酵微生物发酵原料。 术语“醪液”用于指经过液化处理的(liquefied)含淀粉原料，如经过液 化处理的整谷粒(whole grain)。糖化和发酵顺序地进行，或者优选同时进 行(SSF方法)。任选的，发酵后回收乙醇。 附图说明 图1显示在不同温度下液化(分别为50℃，70℃和85℃)，经过SSF 后乙醇的产量。 发明详述 本发明提供了改进的适于作为生产发酵产物，如特别是乙醇，或糖浆， 如葡萄糖或麦芽糖的过程中的步骤的液化方法。本发明还涉及生产发酵产 物优选乙醇的方法，该方法包括本发明的液化方法。当终产物是乙醇时， 其可用作，如燃料酒精、饮用酒精，也就是适于饮用的精制酒精(potable neutral spirits)，或工业酒精。 本发明的液化方法 “液化”是将含淀粉原料分解(水解)成麦芽糊精(糊精)的过程。 因为通常要将含淀粉原料加热到凝胶化温度以上，所以液化还可以使含有 淀粉的浆液(Slurry)变稀(thinning)而有利于操作。液化通常在85℃以上利 用细菌α-淀粉酶进行。发明人吃惊地发现在液化过程中当将温度降低到约 70℃时，同时进行糖化和发酵(SSF)后的乙醇的产量提高了(参见实施例 1)。尽管高温(如85℃)可以增加凝胶化作用以及通常可以增加细菌α-淀 粉酶反应速率，但事实上还是获得了乙醇产量的改善。据信，将液化温度 降低至70℃左右时，酶动力学可能已经发生了改变，从而液化醪液的可溶 性糖的特征谱(profile)也随之发生了改变。发明人发现，在70℃液化比在 85℃利用同样的α-淀粉酶进行液化产生了更多的小的发酵性糖，特别是葡 萄糖和麦芽糖。另一种解释可能是淀粉和/或释放糖的化学结构发生了变化。 释放的糖可能在高温如85℃时发生改变，而在较低的温度如70℃时，释放 的糖可能是自然形态。在85℃时，淀粉凝胶化，形成酶可以接近的较松散 结构。在70℃时，淀粉颗粒较不易接近，导致酶只能从游离端水解糖单位， 因而产生了较小的糖。 本发明第一个方面涉及液化含淀粉原料的方法，包含在65-75℃范围 内用细菌α-淀粉酶处理含淀粉原料1-2个小时。 在优选的实施方式中，液化在约70℃下进行约90分钟。本发明的液化 方法可以在pH4.5-6.5下进行，特别是在pH5-6之间。在本发明的一个实 施方案中，在用或不用细菌α-淀粉酶液化之前，将含淀粉原料在90-120℃ 优选1 05℃左右下蒸汽加压蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是5分钟 左右。应当理解，实施本发明的方法也可以不进行蒸汽加压蒸煮(jet cooking)步骤。在本发明的实施方案中，在液化或蒸汽加压蒸煮(如果进 行)前，制备含有优选10-40％重量，特别是25-35％重量的含淀粉原料 的含水浆液。在本发明液化方法的进一步的实施方案中，可以在液化过程 中加入0.005-2AGU/g DS，优选0.01-0.3AGU/g DS，例如特别是0.05 AGU/g DS左右的葡糖淀粉酶(Glucoamylase)。葡糖淀粉酶可以是下文“葡 糖淀粉酶”部分提到的任意葡糖淀粉酶。 含淀粉原料 根据本发明所使用的含淀粉原料可以是任意的含淀粉原料，优选自： 块茎、根和整谷粒；以及以上的任意组合。在一个实施方案中，含淀粉原 料取自禾谷类(cereals)。含淀粉原料可以例如选自玉米、玉米穗轴(cob)、 小麦、大麦、木薯(cassava)、高粱、黑麦、买罗高粱(milo)和马铃薯或 其任意组合。 如果在本发明的乙醇生产过程中包括本发明的液化方法，则含淀粉的 原材料优选整谷粒或至少主要是整谷粒。用作原材料的含淀粉谷类农作物 有多种，包括：玉米(corn或maize)、买罗高粱、马铃薯、木薯、高粱、 小麦、大麦或者其任意组合。在优选的实施方案中，含淀粉原料是选自玉 米、小麦和大麦或其任意组合的整谷粒。 原料可以包含淀粉加工过程中的物料支流(side-stream)或由其组成， 如含6碳糖(C6 carbohydrate)而不适于例如糖浆等的生产的工艺物料流。 碾磨(Milling) 在本发明的优选实施方式中，为了打开其结构和便于进一步加工，在 (a)步骤前，即在初级液化前，优选通过碾磨减小含淀粉原料的大小。因此， 在具体的实施方案中，液化方法进一步在初级液化步骤前，包括如下步骤： i.减小含淀粉原料如整谷粒的大小，优选通过碾磨； ii.形成包含经过碾磨的含淀粉原料和水的浆液。 通常使用的碾磨的两个方法：干磨和湿磨。 术语“干磨”表示碾磨整谷粒。在干磨中，碾磨整谷粒(whole kernel)， 并将其用于该方法的后续工序。湿磨可以很好的分离胚芽(germ)和粗粉 (meal)(淀粉颗粒和蛋白质)，而且，除了少数例外，在并行生产糖浆的地 方基本上采用湿磨。 在以生产乙醇为目标的过程中，优选干磨。 术语“研磨”(grinding)也可以理解为碾磨(milling)。在本发明的优选 实施方案中，使用干磨。然而，可以理解，其它的减小含淀粉原料颗粒大 小的方法也可以达到预期目的，并包含在本发明的范围之内。例子包括如 乳化技术等技术，也可以使用回转脉动技术(rotary pulsation)。 发酵产物生产过程 本发明的发酵产物，优选乙醇的生产过程通常包括下列步骤：液化、糖 化、发酵、和任选地回收产物，优选通过蒸馏。 根据此方面，本发明涉及从含淀粉原料通过发酵生产发酵产物，优选 乙醇的方法，所述的方法包含以下步骤： (i)使用本发明的液化方法液化含淀粉原料。 (ii)糖化在步骤(i)中获得的醪液。 (iii)用发酵微生物发酵原料。 在实施方案中，糖化和发酵顺序地进行，优选同时进行(SSF方法)。 在本发明的优选的实施方案中，为了打开其结构和便于进一步加工，干磨 含淀粉原料，如整谷粒，优选玉米(corn)。 在优选的实施方案中，在步骤i前，包括如上所定义的蒸汽加压蒸煮步 骤。 在优选的实施方案中，可以使用在下文“α-淀粉酶”部分提及的任意细菌 α-淀粉酶。 糖化 糖化是这样的步骤，其中麦芽糊精(如液化产物)转变成可被发酵微 生物如酵母代谢的小分子的糖DP1-3(即糖源)。糖化步骤在本技术领域是 熟知的，且通常用至少一种或多种如下文进一步描述的产生糖源的酶 (Carbohydrate source generating enzyme)来酶促进行。包含于本发明生产 发酵产物优选乙醇的方法中的糖化步骤，可以是本技术领域中熟知的糖化 步骤。在一个实施方案中，使用葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和/或酸性α-淀 粉酶处理经过液化的原料。完整的糖化步骤可以持续20-100小时，优选 约24-约72小时，且经常在约30-65℃温度范围内，pH4-6通常pH4.5 -5.5左右进行。然而，有时更优选进行预糖化步骤，在30-65℃温度范围 内，典型的是约65℃下，持续约40-90分钟，然后在同时糖化和发酵法(SSF) 的发酵过程中进行完全的糖化。乙醇生产中最广泛应用的方法是同时糖化 和发酵法(SSF)。通常情况下，糖化没有特定的保持(holding)阶段，这 意味着发酵微生物如酵母和酶是同时添加的。在SSF方法中，经常在发酵 前，在40-60℃温度范围内，优选50℃左右，引入预糖化步骤。 发酵 根据本发明，术语“发酵微生物”指适合用于所期望的发酵过程的任意 微生物。适合的发酵微生物能够进行发酵，即直接或间接地把糖如葡萄糖 或麦芽糖转变为所述的发酵产物，优选乙醇。发酵微生物的例子包括真菌 类生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)。商业上可利用的酵母包括，如RED STAR/Lesaffre Ethanol Red(可以从美国的RED/Lesaffre获 得)，SUPERSTART(可以从Alltech获得)，FALI(可以从美国的Fleischmann’s Yeast，Burns Philp Food Inc的分公司获得)，GERT STRAND(可以从瑞典的 Gert Strand AB获得)，以及FERMIOL(可以从DSM Specialties获得)。在优 选的实施方案中，酵母施加于糖化的原料。发酵持续进行24-96小时，典 型的如35-65小时。在优选的实施方案中，温度一般是26-34℃之间， 特别是32℃左右，pH值通常是3-6，优选4-5左右。优选酵母细胞的用 量是105-1012，优选107-1010，特别是5×107活酵母数每毫升发酵液。在 乙醇生产阶段，酵母细胞的数量优选在107-1010之间，特别是2×108左右。 有关使用酵母发酵的进一步指导可见于如“The alcohol Textbook”(编者，K. Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall，Nottingham University Press，United Kingdow 1999)，其在此引入作为参考。 发酵产物回收 发酵产物，优选乙醇，在发酵以后可以任选地回收，优选通过包括以 下步骤： (iv)蒸馏以获得发酵产物，优选乙醇。 在实施方案中，同时或单独/顺序地进行步骤(iii)的发酵和步骤(iv) 的蒸馏；任选地随后进行一或多个工序来进一步精制发酵产物，优选乙醇。 淀粉转化 本发明的液化方法也可以包含于传统的生产糖浆如葡萄糖、麦芽糖、 麦芽低聚糖(Malto-oligosaccharides)和异麦芽低聚糖 (isomalto-oligosaccharides)的淀粉转化过程中。 细菌α-淀粉酶 依据本发明，细菌α-淀粉酶优选来自芽孢杆菌属。 在优选实施方案中，芽孢杆菌α-淀粉酶来源于地衣形芽孢杆菌(B. licheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilu)菌株，但也可以从其它 的芽孢杆菌种类中获得。考虑到的α-淀粉酶的具体例子包括记载在WO 99/19467的SEQ ID NO：4所示的地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶，SEQ ID NO：5 所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及SEQ ID NO：3所示的嗜热脂肪芽孢 杆菌α-淀粉酶(所有序列在此引入作为参考)。在本发明的实施方案中，α- 淀粉酶可以是分别与WO 99/19467所记载的SEQ ID NO：1、2或3所示的 任意序列具有至少60％同一性，优选至少70％，较优选至少80％，更优选 至少90％，如至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的同 一性的酶。 芽孢杆菌α-淀粉酶也可以是变体和/或杂合体，尤其是在WO 96/23873、 WO 96/23874，、WO 97/41213、WO 99/19467、WO00/60059和WO 02/10355 (所有文献在此引入作为参考)的任一个中描述的。具体考虑到的α-淀粉 酶变体是公开在美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576 (在此引入作为参考)中的变体，此外还包括在R179至G182的位置上缺 失一个或两个氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体， 优选是公开于WO 1996/023873的双缺失变体(如参看第20页的1-1 0行， 在此引入作为参考)，优选和WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所示野生型 BSGα-淀粉酶相比对应于Δ(181-182)，或按WO 99/19467中SEQ ID NO：3 的编号缺失氨基酸R179和G180(其在此引入作为参考)。更优选芽孢杆菌 α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，与WO 99/19467公开的SEQ ID NO：3所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，其具有和Δ(181- 182)相对应的双缺失，且进一步包含N193F替代(也表示为I181*+G182* +N193F)。 具体考虑到的α-淀粉酶杂合体包含地衣形芽孢杆菌α-淀粉酶的445个 C-末端氨基酸残基(WO 99/19467的SEQ ID NO：4所示)和来自解淀粉芽 孢杆菌α-淀粉酶(显示于WO 99/19467的SEQ ID NO：5)的37个N-末端氨 基酸残基，及具有一个或多个特别是所有的如下替代： G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(按照WO 99/19467中SEQ ID NO：4所示地衣形芽孢杆菌编号)。也可以优选具有一个 或多个如下突变的变体(或是在其它芽孢杆菌α-淀粉酶主链上相应的突 变)：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在176和179位之间 缺失两个残基，优选缺失E178和G179(使用的是WO 99/19467中SEQ ID NO：5所示的编号)。 细菌α-淀粉酶可以本技术领域公知的量加入。当以KNU单位(在下文 “材料和方法”部分叙述)计量时，α-淀粉酶的活性优选以0.5-5,000NU/g DS 的量存在，以1-500NU/g DS的量存在，或更优选5-1,000NU/g，如10 -100NU/g DS的量。 产糖源的酶 术语“产糖源的酶”包括葡糖淀粉酶(是葡萄糖的生产者)、β-淀粉酶和 麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase，是麦芽糖的生产者)。产糖源的酶能为 在本发明的方法中使用的发酵微生物提供能量以生产乙醇和/或可直接或间 接转化为所期望的发酵产物尤其是乙醇。产糖源的酶可以是所限定的酶的 混合物。特别考虑的混合物是至少由葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，尤其是酸性α- 淀粉酶，更优选酸性真菌α-淀粉酶组成的混合物。在本发明的实施方案中， 每葡糖淀粉酶活性(AGU)的酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)(AFAU/AGU) 至少是0.1，特别至少是0.16，例如在0.12-0.50范围内。 适合的葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶的实例在下文部分阐述。 葡糖淀粉酶 依据本发明，所使用的葡糖淀粉酶是任意合适来源的，如来源于微生 物或植物。优选的葡糖淀粉酶源自真菌或细菌，选自：曲霉属(Aspergillus)葡 糖淀粉酶，特别是黑曲霉(A.niger)G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)， EMBO J.3(5)，1097-1102页)，或者其变体，如在WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中所公开的(来自丹麦的Novozymes)；泡盛曲霉 (A.awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)， 55(4)，941-949页)，或其变体或片断。 其它的曲霉葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和 G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等. (1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301， 275-281)；二硫键，A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)； 和在A435及S436位引入脯氨酸残基(Li等(1997)，Protein Engng.10， 1199-1204)。其它的葡糖淀粉酶包括Atheliarolfsii(以前表示为罗尔伏革菌 (Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参阅美国专利号No.4,727,026和Nagasaka， Y.等(1998)的Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii，Appl Microbiol Biotechnol 50：323-330)， 踝节菌(Talaromyces)葡糖淀粉酶，尤其是来源于Talaromyces emersonii(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(参见美国专利号32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus，(美国专利号4,587,215)。适合的细菌葡 糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是C. thermoamylolyticum(EP135,138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)。 商业上可利用的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L； SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETM FUEL、SPIRIZYMETMB4U和AMGTME(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)； G-ZYMETMG900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。 在实施方案中，葡糖淀粉酶可以0.02-20AGU/g DS的量加入，优选 0.1-10AGU/g DS的量，特别是在1-5AGU/g DS之间，如0.5AGU/g DS。 β-淀粉酶 至少依据本发明，β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)传统上是对体外起作用的 麦芽淀粉酶的称谓，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡糖聚合物中1，4-α 糖苷键的水解。麦芽糖被以逐步连续地从非还原性链末端去除，直到分子 降解，或在是支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β 差向异构体构型(anomeric configuration)，因而以β-淀粉酶命名。 β-淀粉酶已从多种植物和微生物中分离(W.M.Fogarty和C.T.Kelly， Progress in Industrial Microbiology，Vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶 的特征是最适温度为40℃-65℃，最适pH为4.5-7。商业上可利用的大 麦β-淀粉酶是来自丹麦Novozymes A/S的NOVOZYMTM WBA及来自美国 Genencor Int.的SPEZYMETM BBA1500。 麦芽糖淀粉酶 淀粉酶也可以是麦芽糖α-淀粉酶。“麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1，4-α- 麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能将直链和支链淀粉水解为α构型的麦芽糖。 商业上，来自嗜热脂肪芽胞杆菌NCIB 11837菌株的麦芽糖α-淀粉酶可以从 Novozymes A/S获得，其商品名为MALTOGENASETM。麦芽糖α-淀粉酶描 述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628，其在此引入作为参考。 在优选的实施方案中，麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或 0.05-5MANU/g DS的量加入。 酶的生产 在此涉及的酶可以来源于或获自任意合适的来源，包括细菌、真菌、 酵母或哺乳动物来源。在本发明中术语“来源于”(derived)意思是该酶可能 是从天然存在该酶的生物体中分离的，即酶的氨基酸序列本身与天然的酶 相同。术语“来源于”也表示该酶可能是在宿主生物体中重组产生的，重组严 生的酶其氨基酸序列或者与天然酶相同，或者具有修饰，如具有一个或多 个氨基酸的缺失、插入和/或替代，也就是说，重组产生的酶是一种突变体， 和/或是天然氨基酸序列的片段，或者是通过本技术领域已知的核酸改组方 法生产的酶。天然的变体包含在天然酶的意思范围内。此外，术语“来源于” 包括通过合成生产的酶，如通过肽合成。术语“来源于”也包括无论是体内还 是体外通过例如糖基化、磷酸化或者其它的化学修饰所修饰的酶。在本发 明中，术语“获自”意思是酶具有与天然酶相同的氨基酸序列。该术语包含从 天然存在该酶的生物中分离出的酶，或者在相同类型的或其它类型的生物 中重组表达的酶，或者合成生产的，如通过肽合成生产的酶。对于重组生 产的酶，术语“来源于”和“获自”是指酶本身(或酶的同一性)(identity)，而非 指重组生产该酶的宿主生物本身(或其同一性)。 酶也可以是纯化的。在此使用的术语“纯化的”涵盖来源于生物而不含有 该生物的其它组分的酶。术语“纯化”还涵盖从天然生物获得但不含该生物的 其它组分的酶。纯化的酶可以含有少量的其它蛋白质。措辞“其它的蛋白质” 特别指其它的酶。在此所用的术语“纯化”也涉及去除其它的组分，具体是去 除其它的蛋白质，最具体是去除存在于本发明中的酶所来源的细胞中的酶。 酶可以是“基本上纯的”(substantially pure)，也就是说，不含产生该酶的生 物体的其它组分，即，例如重组生产酶的宿主生物体。在优选的实施方案 中，酶至少是75％(w/w)纯，较优选至少80％，至少85％，至少90％， 至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％纯。在另一个 优选的实施方案中，酶是100％纯的。 依据本发明，所用的酶可以是适于在此描述的方法中使用的任意形式， 如，干粉或颗粒，非粉化(non-dusting)颗粒，液体，稳定化的液体，或者 被保护的酶。颗粒可以按美国专利号4,106,991和美国专利号4,661,452公 开的方法生产，可以任选地通过本技术领域已知的方法包被。根据已建立 的方法，液体酶的制备物可以通过加入稳定剂如糖、糖醇(sugar alcohol) 或其他多元醇、乳酸或其它有机酸使之稳定化。受保护的酶可以根据 EP238,216中公开的方法制备。 即使在本发明的方法或过程的上下文中没有特别提及，可以理解，酶 或试剂是以“有效量”使用的。 材料和方法 酶 细菌α-淀粉酶A：具有I181*+G182*+N193F*突变的嗜热脂肪芽孢杆 菌α-淀粉酶，公开于美国专利号6,187,576，可获自丹麦的Novozymes A/S。 葡糖淀粉酶TN：具有黑曲霉葡糖淀粉酶和黑曲霉酸性α-淀粉酶副活性 (side activity)、来源于Talaromyces emersonii的葡糖淀粉酶，公开于WO 99,28448，如SEQ ID NO：7所示。 酵母 RedStarTM，可从美国Red Star/Lesaffre获得。 方法 α-淀粉酶活性(KNU) 可以用马铃薯淀粉作为底物来测定淀粉水解活性。该方法基于酶能分 解改性的马铃薯淀粉，该方法是将碘溶液与淀粉/酶溶液样品混合。最初， 形成黑蓝色，但随着淀粉的分解，蓝色逐渐变弱，变为红褐色(以有色玻 璃为参照)。 1千Novoα-淀粉酶单位(Kilo Novoα-amylase Unit，KNU)定义为在标 准条件下(即37+/-0.05℃；0.0003M Ca2+；和pH5.6)糊精化5260mg淀粉 干物质Merck Amylum solubile的酶量。 较详细描述该分析方法的小册子EB-SM-0009.02/01可向丹麦的 Novozymes A/S索取，其在此引入作为参考。 葡糖淀粉酶活性(AGU) Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下：37℃，pH4.3， 底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟，每分钟 水解1微摩尔麦芽糖的酶量。 可以使用自动分析仪系统。向葡萄糖脱氢酶试剂中加入变旋酶，以便 使存在的任何α-D-葡萄糖转变为β-D-葡萄糖。在上述反应中，葡萄糖脱氢 酶特异地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，其可用光度计在340nm测量， 并以此量度初始葡萄糖的浓度。 AMG温育 底物： 麦芽糖23.2mM 缓冲液： 醋酸盐0.1M pH： 4.30±0.05 温育温度： 37℃±1 反应时间： 5分钟 酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL 颜色反应： GlucDH： 430U/L 变旋酶： 9U/L NAD： 0.21mM 缓冲液： 磷酸盐0.12M；NaCl0.15M pH： 7.60±0.05 温育温度： 37℃±1 反应时间： 5分钟 波长 340nm 较详细描述该分析方法的小册子(EB-SM-0131.02/01)可向丹麦的 Novozymes A/S索取，其在此引入作为参考。 同一性确定 为了实现本发明的目的，可以通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)确定两个氨基酸序列间的同一性程度，其中上述方法使用的是 LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，该软件 带有同一性列表以及以下多个比对参数：空位罚分(gap penalty)10，空位 长度罚分(gap length penalty)10。配对比对参数如下：Ktuple＝1，空位罚分 ＝3，windows＝5，diagonals＝5。 实施例 实施例1 细菌α-淀粉酶A在不同温度下进行液化，其最终的乙醇产量 为了考查细菌液化酶对SSF的作用，试验了三种不同的液化条件。首 先，用研磨的玉米(ground corn)和自来水制成30％的浆液。在所有的液化 中，用稀H2SO4将pH调整为5.4。表1显示了当使用浓度为50NU/g DS的 细菌α-淀粉酶A时液化条件的温度和时间，一旦液化完成，加入2滴HCl (4N)终止反应。回收样品以分析糖特征谱。 表1细菌α-淀粉酶A(BAAA)温度研究的液化条件 液化 细菌α-淀粉酶A(NU/g) 1.5小时 温度(℃) 1 2 3 50 50 50 85 70 50 通过微型发酵评估液化处理对SSF的影响。在液化后，用稀的NaOH 将pH调整为5.0。将约4g醪液加入到16ml的聚苯乙烯试管(Falcon 352025) 中。接着向试管中定量加入0.5AGU/g DS的葡糖淀粉酶TN。向试管中定 量加入酶以后，与0.04ml/g醪液的繁殖酵母(RED STARTM)一起在试管中 温育，所述繁殖酵母已在玉米醪液中培养了21个小时。将试管用旋盖盖住， 该盖子用极小的针刺有孔以允许气体释放，短暂涡旋混合，然后称重并在 32℃温育。随时间称量试管的重量以追踪发酵进程。在每一次称重前将试 管短暂地涡旋混合。用以下公式将重量减轻值换算为乙醇产量(g乙醇/g DS)： 发酵后，将一个重复样用于HPLC分析(sacrificed)残余糖量和乙醇产量。 将大约1ml的澄清上清液通过0.45μm的滤器以去除固体物质。将样品稀释 10倍，然后通过HPLC分析葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、较大的可溶糖(DP4+) 及乙醇。 结果表明，在70℃液化原料比在标准的85℃液化产生乙醇的速度更快。 利用在70℃液化的玉米醪液，42小时时，乙醇水平增加了20％。发酵后， HPLC分析表明(表2)，在70℃液化时，葡萄糖几乎完全被利用，而在其 它的液化中，则有约40-60g/l的葡萄糖剩余。 表2在不同温度进行液化处理，发酵后HPLC数据 液化处理 糊精 (DP4)+ 麦芽三糖 (DP3) 麦芽糖 (DP2) 葡萄糖 BAAA-85℃ 18.93 1.04 2.84 58.04 BAAA-70℃ 17.21 3.49 5.37 0.79 BAAA-50℃ 13.30 0.81 1.82 41.12 利用由于CO2释放而导致的重量减轻分析发酵的乙醇产量(参见图1)。 发现在温度为50℃、72℃和85℃进行液化处理时，约50个小时时的终产 量依次是0.143g、0.239g和0.206g乙醇/g醪液，表明在70℃液化比在标 准方法(85℃)下液化能够提高大约16％的乙醇产量。