发明领域 本发明涉及赋予百草枯抗性的百草枯抗性基因以及维管束和毛状体特 异性启动子。 背景技术 植物经常暴露于多种环境压力，包括高温和低温、干旱、强光、盐、 大气污染气体、致病性微生物等。因此，如果开发可在这些环境压力下充 分生长的有用植物如作物，在由于环境压力甚至在当前不能生长作物等的 地区进行粮食生产是可能的，并且未来预测的严重粮食危机的可能性将会 增加。因此，在全球范围，对这种环境压力具有提高抗性的植物的生产正 在进行中。例如，通过遗传重组技术，已产生了赋予寒冷抗性(Nature，356， 710-703，1992；Plant Physiol.，105，601-605，1994)、干旱抗性(Plant Physiol.， 107，125-130，1995；Nature，379，683-684，1996；Nature Biotech.，17， 287-291，1999)、盐抗性(Science，259，508-510，1993；Biotechnology，14， 177-180，1996；Plant J.，12，133-142，1997)、大气污染抗性(Plant Cell Physiol.，34，129-135，1993；Biotechnology，12，165-168，1994)、病害抗性(化 学和生物体(Chemistry and Organisms)，37，295-305，385-392，1999)等的 植物。此外，通过遗传重组技术赋予对农业化学品抗性的一些植物实际上 也在使用(Nature，317，741-744，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85， 391-395，1988；EMBO J.，6，2513-2518，1987；EMBO J.，7，1241-1248， 1988)。 这些环境压力与体内产生活性氧类(超氧化物自由基(O2 -)、过氧 化氢(H2O2)、羟基自由基(OH-)密切相关。活性氧类通过呼吸作用、 光合作用、环境压力等产生，并通过对蛋白质、核酸、膜结构等的过度氧 化而对细胞产生致命伤害。也报道，通过遗传重组技术产生的活性氧抗性 植物显示对上述环境压力的抗性增强(Plant Physiol.，111，1177-1181，1996； FEBS Letters，428，47-51，1998)。 为产生活性氧抗性植物，主要采用将清除活性氧类的酶(超氧化物歧 化酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶等)的基因导 入植物的方法。 百草枯是非选择性和强效的除草剂，通过在光系统中连续产生活性氧， 它可杀死所有植物。因此，百草枯抗性可用作对活性氧抗性的指标，并分 析植物中关于百草枯抗性的机制(Pestic.Biochem.Physiol.，26，22-28，1986； Theor.Appl.Genet.75，850-856，1988；以及Plant Physiol.，91，1174-1178， 1989)。 同时，已公开了细胞凋亡抑制基因(日本特开平10-309142、特开2000 -23583和特开2002-300822)、编码与醛糖还原酶同源的蛋白质的基因 (日本特表2001-523466)以及编码铁结合蛋白质(铁蛋白)的基因(日 本特表2001-519671)为赋予百草枯抗性的基因。此外，在日本特开2002 -281979和2001-95585中，公开了来源于百草枯抗性愈伤组织的过氧化 物酶为可赋予百草枯抗性的基因。 据认为，如果分离对百草枯赋予强大抗性的百草枯抗性基因，将有利 于开发对活性氧具有高抗性的植物，其中这些活性氧在多种环境压力条件 下(高温和低温、干旱、强光、盐、大气污染气体、致病性微生物等)产 生。然而，最近显示，活性氧作为植物调节生长和压力反应的分子，扮演 了重要的角色。因此，为避免影响重要特征如作物产量，增加植物对压力 如百草枯的抗性同时不影响植物依赖于活性氧的生长和生理防御机制是极 为重要的。 维管束是通过羊齿类和种子植物如茎、叶和根的每一器官分化成的束 中组织系统。木质部和韧皮部是维管束的组成部分，并且它们作为导管运 输水和内部物质至植物体。此外，在维管束中发现了包括维管束间形成层 和维管束内形成层的维管束形成层。维管束形成层是细胞增殖的位置，因 此是植物生长极为重要的位置。因此，维管束是植物有关运输水份和内部 物质以及细胞增殖的场所。因此，如果可将参与运输水份或内部物质或细 胞增殖的基因导入植物，并在维管束中特异性表达，这将使植物调节水份 或内部物质的运输或细胞增殖成为可能。 另外，从植物病害的观点看，维管束是感染茄科植物的枯萎病真菌增 殖和转移的位置。当植物病毒感染植物时，植物病毒迁移长距离，从一片 叶子移至其上面的叶子，因此，维管束也是导致植物全株感染的迁移位置。 因此，如果可将参与真菌或植物病毒增殖或迁移的基因导入植物，并在维 管束中特异性表达，植物可得到保护而免于真菌或植物病毒的感染。 毛状体是发现于植物体的叶、茎、萼片等表面存在的毛状突起物。毛 状体参与植物体表面的分泌和排泄。例如，据报道，当植物暴露于重金属 (镉)压力时，叶表面的毛状体数量增加，并且包含镉或钙的晶体粘附于 叶表面，换言之，通过毛状体排泄镉(Planta，213(1)，45-50，2001年5月)。 毛状体也是侵入植物的丝状真菌、细菌、昆虫等最初接触的位置。此外， 作为对病害和昆虫伤害的防御，例如具有抗微生物活性和阻碍摄入的液体 从蔷微科玫瑰的腺毛或腺状突起物中分泌。因此，如果将与重金属等排泄 有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入的液体有关的基因作 为外源基因导入植物并在毛状体中特导表达，则重金属可有效地从植物中 排泄，或植物可有效地得到保护而免于丝状真菌、细菌或昆虫侵入植物。 如上所述，希望特异性基因可在维管束或毛状体中进行表达。作为进 行特异性基因表达的方法，可考虑涉及到使用在维管束或毛状体中显示特 异启动子活性的启动子的方法。然而，目前尚未在维管束和毛状体中鉴定 出均特异性显示启动子活性的启动子。 发明概述 本发明的主题是，通过确认和分析鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的 基因，提供例如百草枯抗性基因以及提供维管束和毛状体特异性启动子。 本发明通过提供下述几点完成上述主题： (1)编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因： (a)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)与SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列相比，由具有替代、缺失或 添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且赋予百草枯抗性的蛋白质； (2)由上述(1)的基因编码的赋予百草枯抗性的蛋白质； (3)包含上述(1)的基因的重组载体； (4)根据(3)的重组载体，其中重组载体还包含外源基因或外源DNA 片段； (5)具有上述(3)或(4)的重组载体的转化体； (6)具有上述(3)或(4)的重组载体、并具有百草枯抗性的植物体； (7)筛选转基因植物的方法，包括将上述(4)的重组载体导入植物， 并以百草枯抗性指标为基础筛选转基因植物； (8)包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的维管束和毛状体特异 启动子： (a)由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA； (b)与SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列相比，由具有替代、缺失或 添加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成、并作为维管束和毛状体特异启 动子发挥功能的DNA；以及 (c)在严谨条件下，与由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的 DNA杂交、并作为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA； (9)包含上述(8)的维管束和毛状体特异启动子的重组载体； (10)根据(9)的重组载体，其中重组载体包含维管束和毛状体特异 启动子下游的外源基因或外源DNA片段； (11)根据(10)的重组载体，其中外源基因是上述(1)所述的基因； 以及 (12)具有上述(9)-(11)中任何一项所述的重组载体的转基因植 物。 附图简述 图1.是来源于AtMVR基因转化体的cDNA的电泳照片； 图2A.是显示AtMVR基因转化体和非转化体在图2B和2C中的位置 简图。图2B是显示AtMVR基因转化体和非转化体在无百草枯的1/2MS 培养基中生长的照片。图2C是显示AtMVR基因转化体和非转化体在含 有百草枯的1/2 MS培养基中生长的照片。 图3.是包含GUS基因和AtMVR启动子的完整转化体用GUS通过组 织化学染色的显微照片； 图4.是包含GUS基因和AtMVR启动子的转化体的叶用GUS通过组 织化学染色的显微照片； 图5.是包含GUS基因和AtMVR启动子的转化体的根用GUS通过组 织化学染色的显微照片； 优选实施方案的详述 下面详细描述本发明。 根据本发明的基因是编码下述(a)或(b)的蛋白质的基因： (a)由SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，以及 (b)相对于SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列，由具有替代、缺失或添 加一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成、且赋予百草枯抗性的蛋白质； 编码上述(a)所述的蛋白质的基因是编码由SEQ ID NO：2代表的氨基 酸序列组成的赋予百草枯抗性的蛋白质的基因(以后称其为AtMVR基 因)。 本发明人基于AtMVR基因的核苷酸序列，在包括鼠耳芥的全部核苷 酸序列的数据库(例如GenBank、EMBL、DDBJ、tair：Arabidopsis信息 源)中进行搜索，并在鼠耳芥基因组发现13个与AtMVR基因同源的基因 (AtMVR 3-1至AtMVR 3-13)。任何一个AtMVR同源基因的核苷酸序 列和通过相关AtMVR同源基因编码的预测氨基酸序列通过下面表1中所 列出的序列号表示。表1也列出AtMVR和每一AtMVR同源基因之间的 同源性分析结果。利用BLAST P，在氨基酸水平上实施同源性分析。氨基 酸的分类基于其侧链的化学特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩阵(Proc. Natl.Acad.Sci.，89，10915-10919，1992)中，氨基酸分为：带有巯基的氨基 酸(C)；低分子量的亲水氨基酸(S，T，P，A，G)；酸性氨基酸(N，D，E，Q)； 碱性氨基酸(H，R，K)；低分子量疏水氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F， Y，W)。在表1中，术语“同一性”在氨基酸方面指100％一致性，术语“阳 性率”指当在BLOSUM62氨基酸替代矩阵中具有阳性分值的氨基酸添加 至那些具有100％一致性的氨基酸时的数值(见Bioinfomatics(日本)， Okazaki Y. & Bono H.编辑(Medical Science International出版)。 [表1] AtMVR同源 基因的名称 核苷酸序列 氨基酸序列 同一性 (％) 阳性率 (％) AtMVR3-1 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5 57 70 AtMVR3-2 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7 55 69 AtMVR3-3 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9 39 56 AtMVR3-4 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：11 39 55 AtMVR3-5 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13 37 54 AtMVR3-6 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：15 36 52 AtMVR3-7 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：17 34 52 AtMVR3-8 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19 34 51 AtMVR3-9 SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 37 58 AtMVR3-10 SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 25 44 AtMVR3-11 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25 33* 51* AtMVR3-12 SEQ ID NO：26 SEQ ID NO：27 25 41 AtMVR3-13 SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：29 22 41 *与AtMVR3-11的比较显示的是与AtMVR3-11部分序列比较的同源 性结果。 如表1所示，AtMVR与13个AtMVR同源基因的同源性在同一性上 为22-57％，阳性率上为41-70％。这些AtMVR同源基因认为与AtMVR 基因一样，可赋予百草枯抗性。 此外，AtMVR基因与衰老相关蛋白质DSA5(GenBank登录号 AF082030)(Plant Molecular Biology 40，237-248，1999)具有同源性。利用 BLAST X的同源性分析结果显示，在氨基酸水平上，AtMVR基因编码的 蛋白质与DSA5编码的蛋白质具有89％的同一性。据报道，DSA5是百合 花花瓣衰老时表达的基因(萱草属(Hemerocallis)杂交品系)(Plant Molecular Biology 40，237-248，1999)。然而，由于DSA5编码的蛋白质与 任何公知的蛋白质无同源性，仍不清楚该蛋白质具有何种功能。因此， AtMVR基因是赋予百草枯抗性的新基因。 如此处所使用的，术语“百草枯抗性”指对百草枯具有抗性。更为特 别地，术语“百草枯抗性植物”指，为从百草枯获得给定的效果，比非抗 性植物需要更大量百草枯的植物。百草枯是非选择的和强效的除草剂，百 草枯是通过在光化学系统中连续产生活性氧而杀死所有植物。通过检查导 入该基因的转化体是否可在百草枯中生长，可确定AtMVR基因是否为可 赋予百草枯抗性的百草枯抗性基因。 编码上述(b)所述蛋白质的基因是编码这些蛋白质的基因，这些蛋白质 的序列与SEQ ID NO：2代表的氨基酸序列比较，由具有替代、缺失或添加 一个或多个氨基酸(例如1-10或1-5个)的氨基酸序列组成、并且赋予 百草枯抗性。 一旦确定本发明基因的核苷酸序列，然后通过化学合成、或使用已克 隆的克隆作为模板进行聚合酶链反应(此后指“PCR”)、或使用具有所 述核苷酸序列的DNA片段作为探针进行杂交，从而获得根据本发明的基 因是可能的。此外，可通过如定点诱变技术而合成与突变前具有相同功能 的本发明基因的突变体。 在根据本发明的基因中引入突变的方法的实例包括公知的方法，如 Kunkel法或缺口双链体法或与根据这些方法的方法。例如，引入突变可利 用通过定点诱变引入突变的试剂盒(例如Mutant-K(TAKARA，Inc.制造)、 或Mutant-G(TAKARA，Inc制造)、或利用TAKARA.Inc制造的LA PCR 体外诱变系列试剂盒进行。 根据本发明的赋予百草枯抗性的蛋白质是根据本发明的基因编码的蛋 白质。例如，将根据本发明的基因整合入来源于大肠杆菌等的载体，然后 用获得的重组载体转化大肠杆菌。此后，通过提取大肠杆菌中合成的蛋白 质可获得根据本发明的蛋白质。 此外，根据本发明的重组载体是包含根据本发明的基因的重组载体。 通过将根据本发明的基因插入合适的载体可获得根据本发明的重组载体。 用于插入根据本发明的基因的载体不受到特别限制，只要该载体可在宿主 中复制，并且其实例包括质粒、穿梭载体和辅助质粒。另外，当载体自身 不能复制时，可使用通过如插入宿主染色体而可复制的DNA片段。 质粒DNA的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(pBI221等，例如，pET 系统如pET30b、pBR系统如pBR322和pBR325、pUC系统如pUC118、 pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、来源于枯草芽胞杆 菌的质粒(例如pUB110和pTP5)、来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的二元质粒(例如来源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI 系统)、来源于酵母的质粒(例如YEp系统如YEp13、或YCp系统如 YCp50)等。噬菌体DNA的实例包括λ噬菌体(Charon 4A，Charon 21A， EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP等)。此外，也可使用动物病毒载体 如逆转录病毒或痘苗病毒载体、植物病毒载体如花椰菜花叶病毒、或昆虫 病毒载体如杆状病毒载体。 为将根据本发明的基因插入载体，使用这种方法，该方法首先将根据 本发明的基因的cDNA利用合适的限制性酶切割，然后插入合适载体DNA 的限制性酶位点或多克隆位点，并连入载体。此外，还可使用这种方法， 该方法中分别提供载体和根据本发明基因cDNA的一部分的同源区，并且 载体和cDNA通过利用PCR等体外方法或利用酵母等体内方法连接。 根据本发明的重组载体也可包括除了本发明基因外的外源基因或外源 DNA片段。将外源基因或外源DNA片段插入载体的方法与将根据本发明 的DNA片段插入载体一样。任何基因或DNA片段可作为外源基因或外源 DNA片段。因此，根据本发明的基因可作为选择性标志基因以显示百草枯 抗性，例如，如卡那霉素或潮霉素等抗生素抗性基因一样。 根据本发明的转化体是具有根据本发明的重组载体的转化体。通过将 根据本发明的重组载体导入宿主可获得根据本发明的转化体。宿主不特别 受到限制，只要它可表达根据本发明的基因，然而植物是优选的。当宿主 是植物时，按下述方法获得转基因植物是可能的。 在本发明中，欲转化的“植物”可以是任何一种完整的植物、植物器 官(例如叶、花瓣、茎、根或种子)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄 壁组织或木质部)或植物培养细胞。在转化中可使用的植物的实例包括但 不限制于属于禾本科(Poaceae)、芸苔科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae) 或豆科(Leguminosae)植物(见下面)。 禾本科：稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays) 芸苔科：鼠耳芥 茄科：烟草(Nicotiana tabacum) 豆科：大豆(Glycine max) 通过常规转化方法如，例如电穿孔法、农杆菌法、粒子枪法或PEG法， 可将根据本发明的重组载体导入植物。 例如，当使用电穿孔法时，通过利用装备有脉冲控制器的电穿孔仪器， 在电压500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的条件下，将根 据本发明的重组载体导入宿主。 当使用粒子枪方法时，可使用未经任何处理的完整植物、植物器官或 植物组织自身，可制备其切片并然后使用它，或制备原生质体并使用它。 然后利用基因转移设备(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)处理已 制备的样品。虽然处理条件随着使用的植物或样品而不同，但处理一般在 压力约450-2000psi和距离约3-12厘米的条件下实施。 使用农杆菌Ti质粒或Ri质粒的方法是利用了以下特征，当属于农杆 菌属的细菌感染植物时，细菌所拥有的质粒DNA的一部分转移至植物的 基因组。因此，这种方法可用于将根据本发明的基因导入植物宿主。在属 于农杆菌属的细菌中，当根癌农杆菌感染植物时，它可导致形成称为“冠 瘿”的肿瘤。此外，当发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物 时，它刺激产生毛细根。这些是通过将Ti质粒或Ri质粒中称为“T- DNA(转移DNA)区”的区域在感染时转移至植物，并整合进植物的基因组 而导致的。因此，首先将欲整合进植物基因组的DNA插入Ti质粒或Ri 质粒的T-DNA区，然后通过利用农杆菌属的细菌感染植物宿主，将DNA 整合进植物基因组。 将农杆菌属的细菌转化植物宿主的方法的实例包括上述的电穿孔法、 基因枪和PEG方法，以及植物原位(in planta)转化法。植株原位转化法 的实例包括直接农杆菌接种法和渗入法。 可使用转化时获得的肿瘤组织或芽、毛细根等，而不对细胞培养物、 组织培养物或器官培养物作任何处理。备选的是，利用常规植物组织培养 法，通过施用合适浓度的植物激素(生长素、促细胞分裂素、赤霉素、脱 落酸、乙烯、油菜素内酯等)，它可在植物体中再生。 通过使用植物病毒作为载体，也可将根据本发明的基因导入植物。可 使用的植物病毒的实例包括花椰菜花叶病毒。首先，将病毒基因组插入来 源于大肠杆菌等的载体，以产生重组体，然后将根据本发明的基因插入病 毒基因组。随后，利用限制性酶将按这种方法修饰的病毒基因组切下，然 后通过将病毒基因组接种植物宿主，而将根据本发明的基因导入植物宿主。 除了按上面所述导入植物宿主中外，也可将根据本发明的重组载体导 入细菌，这些细菌包括属于埃希氏菌属如大肠杆菌、芽胞杆菌属如枯草芽 胞杆菌或假单胞菌属如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、以及酵母 如酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、动物细胞如 COS细胞或CHO细胞、和昆虫细胞如Sf9。当使用细菌如大肠杆菌或酵 母等作为宿主时，优选的是根据本发明的重组载体可在细菌中自主复制， 并且该重组载体包含启动子、核糖体结合序列、转录终止序列和根据本发 明的基因。它也可包含调节启动子的基因。 将根据本发明的重组载体导入细菌的方法不受到特别限制，只要它是 可将DNA导入细菌的方法，例如可提到的是使用钙离子的方法或电穿孔 法。 将根据本发明的重组载体导入酵母的方法不受到特别限制，只要它是 可将DNA导入酵母的方法，例如可提到的是电穿孔法、原生质体法和醋 酸锂法。 当使用动物细胞作为宿主时，可使用猴细胞COS-7、Vero、中国仓 鼠卵巢细胞(CHO细胞)、小鼠L-细胞等。将根据本发明的重组载体导 入动物细胞的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入动物细胞的 方法，例如可提到的是电穿孔法、磷酸钙法和脂质体法。 当使用昆虫细胞作为宿主时，可使用Sf9细胞等。将根据本发明的重 组载体导入昆虫细胞的方法不受到特别限制，只要它是可将DNA导入昆 虫细胞的方法，例如可提到的是磷酸钙法、脂质体法和电穿孔法。 通过使用PCR法、Southern杂交方法、Northern杂交方法等，可确 定根据本发明的基因是否已整合进宿主。例如，从转化体制备DNA和设 计DNA特异引物后，可实施PCR。下一步，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等，然后将其产物用溴化乙锭、SYBR Green溶液等染色。此后，通过检测扩增产物为单一条带，确定转化是否 已发生。也可使用已预先标记荧光染料等的引物实施PCR后检测扩增产 物。另外，可应用将扩增产物结合至微孔板等的固相上以通过荧光或酶反 应等确认扩增产物的方法。 根据本发明的植物体是具有包含本发明基因的重组载体并具有百草枯 抗性的植物体。如此处所使用的，术语“植物体”指用包含根据本发明的 基因的重组载体转化的完整植物。通过将上述重组载体导入植物细胞等， 并从获得的转基因植物细胞中再生转基因植物体，可获得根据本发明的植 物体。作为再生方法，可应用这种方法，该方法将愈伤组织形成中的转化 细胞转移至培养基，并允许不定胚形成以获得完全植物体，其中该培养基 已改变了激素的类型和浓度，并允许培养。使用的培养基的实例包括LS 培养基和MS培养基。通过类似于上述方法的方法，可将重组载体导入植 物细胞等。 在根据本发明的植物体中，本发明基因编码的赋予百草枯抗性的蛋白 质在完整植物体中过量表达。因此，根据本发明的植物体具有对百草枯的 抗性。 筛选根据本发明的转基因植物的方法是将根据本发明的重组载体导入 植物，并以百草枯抗性作为指标来筛选转基因植物的方法。转化可通过应 用根据本发明的基因为选择性标记基因以显示百草枯抗性而得到证实。筛 选方法的实例包括将通过根据本发明的重组载体转化的植物在含百草枯的 培养基中生长，并且基于植物的生、死和生长变化而实施筛选的方法。用 于筛选的百草枯的浓度随植物的种类和大小等而不同，然而，例如当将鼠 耳芥作为宿主，百草枯在培养基中的浓度优选为0.1-3.0μM，更为优选的 为1.0-3.0μM，以及最为优选的为3.0μM。非转基因植物，即野生型植物， 发展为萎黄病并死于含百草枯的培养基中。相反，用根据本发明的重组载 体转化的植物甚至在含百草枯的培养基中保持绿色。因此，在非转基因植 物和用根据本发明的重组载体转化的植物之间，可证实它们在含百草枯培 养基中生长的明显差异。 当应用抗生素抗性或除草剂抗性作为指标时，因为在植物之间存在敏 感性差异，在筛选时可观察到假阳性。相反，百草枯是非选择性并为强效 的除草剂，百草枯可杀死所有植物。因此，在筛选根据本发明的转基因植 物的方法中，在筛选时不会观察到假阳性。此外，根据筛选本发明转植物 基因的方法，在生长的早期可有效确定抗性。 根据本发明的启动子是包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的维管束和毛状 体特异性启动子： (a)由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA； (b)相对于SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列，由具有替代、缺失或添 加一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并可作为维管束和毛状体特异启 动子发挥功能的DNA；以及 (c)在严谨条件下，与由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成并可作 为维管束和毛状体特异启动子发挥功能的DNA杂交。 上述(a)所述的维管束和毛状体特异启动子是发现于AtMVR基因5’上 游非翻译区的维管束和毛状体特异启动子，由SEQ ID NO：3代表的核苷酸 序列组成。(a)中所述的启动子可通过在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数据 库中，基于AtMVR基因5’上游的约3000个核苷酸进行搜索。 如此处所用，术语“维管束和毛状体特异性启动子”指显示特异于植 物维管束和毛状体活性的启动子。术语“维管束”指通过羊齿类和种子植 物的每一器官如茎、叶和根中分化成的束中组织系统。木质部和韧皮部是 维管束的组成部分，并且它们作为导管运输水和内部物质至植物体而发挥 功能。同时，术语“毛状体”指存在于植物体的叶、茎或萼片等表面的毛 状突起物。毛状体参与从植物体表面的分泌和排泄。 可根据常规方法确定维管束和毛状体特异启动子的活性。例如，构建 含有可操作地连接至启动子下游的报告基因的表达载体。下一步，用表达 载体转化合适的植物。然后，将获得的转化体在预定的条件下培养，并且 报告基因在维管束和毛状体中的表达量可在mRNA或蛋白质水平上测定， 以在相应条件下测量启动子活性。此外，当报告基因是β-葡糖醛酸酶(GUS) 时，可通过观察表达的GUS导致的组织化学染色而确定维管束和毛状体中 启动子活性的特异性。 例如，作为使用GUS进行组织化学染色的方法，提到将含5-溴-4-氯 -3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作为GUS底物的反应混合物加至已导入 GUS基因的转化体的组织。当GUS基因得到表达时，X-Gluc得到脱酯化 以产生3-吲哚氧基衍生物单体，并且该单体与空气氧化聚合形成蓝色靛蓝 颜料。在转化的细胞或组织中，该蓝色颜料聚集显示蓝色。 此外，AtMVR基因5’上游特异的非翻译区可易于通过实施PCR而 获得，其中该PCR以从鼠耳芥提取的基因组作为模板，使用与该区域两端 核苷酸序列互补的引物。 根据本发明的启动子可以是SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列，更为特 别的是，5’上游完整的非翻译区，或该启动子可以是由SEQ ID NO：3代表 的核苷酸序列组成的DNA的一部分，只要它显示维管束和毛状体特异启 动子的功能。 与SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列比较，上述(b)中所述的维管束和 毛状体特异启动子由具有替代、缺失或添加一个或多个核苷酸(例如1- 10或1-5个)、并发挥维管束和毛状体特异启动子功能的核苷酸序列组 成。 上述(c)中所述的维管束和毛状体特异启动子在严谨条件下与由SEQ ID NO：3代表的核苷酸序列组成的DNA杂交，并发挥维管束和毛状体特 异启动子特异供能。 如此处使用的一样，术语“严谨条件”指，例如，当使用标记P-32 的探针DNA时，在由5×SSC(0.75M NaCl，0.75M柠檬酸钠)、5×Denhardt 试剂(0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白)和0.1％十二 烷基硫酸钠(SDS)组成的杂交溶液中杂交，温度45-68℃，优选的为60- 68℃。此外，在洗涤步骤，在由2×SSC和0.1％SDS组成的洗涤溶液中进 行洗涤，温度为45-55℃，更为优选的是由0.1×SSC和0.1％SDS组成的 洗涤溶液，温度为45-55℃。当使用利用AlkPhos直接标记组件试剂盒 (Amersham Biotech)进行酶促标记的探针DNA时，可在含有试剂盒附带的 说明书中所述成分的杂交溶液(含有0.5M NaCl和4％封闭试剂)中实 施杂交，温度为55-75℃。此外，在洗涤步骤，根据试剂盒附带的说明书 中的指导，洗涤在初期洗涤溶液(含有2M尿素)中实施，温度为55-75℃， 并在二级洗涤溶液和室温中实施。也可使用其它检测技术，在这些情况下， 条件为相关检测技术的标准条件。 一旦确定根据本发明的启动子的核苷酸序列，接下来可通过化学合成、 或应用克隆探针作为模板的PCR、或应用具有核苷酸序列的DNA片段作 为探针进行杂交而获得本发明的启动子。此外，可通过如定点诱变技术而 合成与突变前具有相同功能的本发明启动子的突变体。 将突变引入根据本发明的启动子的方法的实例包括公知的方法，如 Kunkel法、或缺口双链体法、或根据这些方法的方法。例如，引入突变可 使用通过定点诱变引入突变的试剂盒(例如Mutant-K或Mutant-G(均由 TAKARA Inc制造))或可使用TAKARA Inc制造的LA PCR体外诱变 系列试剂盒进行。 通过将根据本发明的启动子插入合适的载体可获得包含本发明启动子 的本发明重组载体。用于插入本发明启动子的载体不受到特别限制，只要 它可在宿主内复制，并且其实例包括质粒、穿梭载体和辅助质粒。另外， 当载体自身不能复制时，可使用通过如插入宿主染色体而可复制的DNA 片段。 质粒DNA的实例包括来源于大肠杆菌的质粒(pBI221等，例如，pET系 统如pET30b、pBR系统如pBR322和pBR325、pUC系统如pUC118、 pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、来源于枯草芽孢杆 菌的质粒(例如pUB110和pTP5)、来源于根癌农杆菌的双元质粒(例如， 来源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI系统)、来源于酵母的质粒(例 如，YEp系统如YEp13、或YCp系统如YCp50)等。噬菌体DNA的实 例包括λ噬菌体(Charon 4A、Charon 21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、 λgt11、λZAP等)。此外，也可使用动物病毒载体如逆转录病毒或痘苗病 毒载体、或昆虫病毒载体如杆状病毒载体。 为将根据本发明的启动子插入载体，可使用这样的方法，该方法首先 用合适的限制性酶将纯化的DNA切下，然后插入合适载体DNA的限制性 酶位点或多克隆位点，并连接至载体。此外，也可使用这样的方法，该方 法中分别提供载体和本发明启动子的一部分的同源区，并通过使用PCR等 体外方法或使用酵母等体内方法将载体和启动子连接起来。 包含本发明启动子的本发明重组载体可进一步包括插入本发明启动子 下游的外源基因或外源DNA片段。插入外源基因或外源DNA片段的方法 与将根据本发明的启动子插入载体一样。 在包含本发明启动子的本发明重组载体中，欲插入本发明启动子下游 的外源基因的实例包括任何外源基因，具体的实例包括与运输水或内部物 质有关、或细胞增殖有关的基因、与细菌或植物病毒增殖或运输有关的基 因、与排泄重金属等有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入 的液体有关的基因。更为特别的是，该基因可以是用于运输或泵吸的基因、 编码PR-蛋白质的基因(发病相关的蛋白质)(几丁质酶、过氧化物酶等)、 防卫素家族基因、植物防御素合成基因或害虫等的驱除信息素合成基因。 作为外源基因进一步的实施例可提及上述根据本发明的基因，AtMVR基 因。 欲插入本发明启动子下游的外源DNA片段实例包括RNA自身发挥功 能的反义RNA或核酶。 根据本发明的转基因植物是具有根据本发明的重组载体的转基因植 物，其中本发明重组载体包含本发明的启动子。通过将根据本发明的重组 载体导入植物，可获得根据本发明的转基因植物，其中本发明重组载体包 含本发明的启动子。转基因植物可按下述方法获得。 在本发明中，欲转化的“植物”可以是任一完整的植物、具有维管束 和/或毛状体的植物器官(例如叶、花瓣、茎、根或种子)、植物组织(例 如表皮、韧皮部、薄壁组织或木质部)或植物培养细胞。在转化中可使用 的植物的实例包括但不限制于属于禾本科(Poaceae)、芸苔科 (Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)或豆科(Leguminosae)植物(见 下面)。 禾本科：稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays) 芸苔科：鼠耳芥 茄科：烟草(Nicotiana tabacum) 豆科：大豆(Glycine max) 通过常规转化方法如，例如电穿孔法、农杆菌法、粒子枪法或PEG法， 可将包含本发明启动子的本发明重组载体导入植物。 例如，当使用电穿孔法时，通过利用装备有脉冲控制器的电穿孔仪器， 在电压500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的条件下，将包 含本发明启动子的本发明重组载体导入宿主。 当使用粒子枪方法时，可使用未经任何处理的完整植物、植物器官或 植物组织自身，可制备其切片并然后使用它，或制备原生质体并使用它。 然后利用基因转移设备(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)处理已 制备的样品。虽然处理条件随着使用的植物或样品而不同，但处理一般在 压力约450-2000psi和距离约3-12厘米的条件下实施。 使用农杆菌Ti质粒或Ri质粒的方法是利用了以下特征，当属于农杆 菌属的细菌感染植物时，细菌所拥有的质粒DNA的一部分转移至植物的 基因组。因此，这种方法可用于将根据本发明的启动子和外源基因或外源 DNA片段导入植物宿主。在属于农杆菌属的细菌中，当根癌农杆菌感染植 物时，它可导致形成称为“冠瘿”的肿瘤。此外，当发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)感染植物时，它刺激产生毛细根。这些是通 过将Ti质粒或Ri质粒中称为“T-DNA(转移DNA)区”的区域在感染时 转移至植物，并整合进植物的基因组而导致的。因此，首先将欲整合进植 物基因组的DNA插入Ti质粒或Ri质粒的T-DNA区，然后通过利用农 杆菌属的细菌感染植物宿主，将DNA整合进植物基因组。 将农杆菌属的细菌转化植物宿主的方法的实例包括上述的电穿孔法、 基因枪和PEG方法，以及植物原位(in planta)转化法。植株原位转化法 的实例包括直接农杆菌接种法和渗入法。 可使用转化时获得的肿瘤组织或芽、毛细根等，而不对细胞培养物、 组织培养物或器官培养物作任何处理。备选的是，利用常规植物组织培养 法，通过施用合适浓度的植物激素(生长素、促细胞分裂素、赤霉素、脱 落酸、乙烯、油菜素内酯等)，它可在植物体中再生。 此外，通过使用植物病毒作为载体，可将根据本发明的启动子和外源 基因或外源DNA片段导入植物。此处所使用的植物病毒的实例包括花椰 菜花叶病毒。首先，将病毒基因组插入来源于大肠杆菌等的载体，以产生 重组体，然后将根据本发明的启动子和外源基因或外源DNA片段插入病 毒基因组。随后，使用限制性酶将用这种方法修饰的病毒基因组从重组体 上切下，通过将病毒基因组接种植物宿主，将根据本发明的启动子和外源 基因或外源DNA片段导入植物宿主。 上述方法产生的本发明转基因植物可在使用本发明启动子的维管束和 毛状体中特异表达外源基因或外源DNA片段。 维管束是与植物中运输水和内部物质以及细胞增殖有关的位置。因此， 当将与运输水或内部物质或细胞增殖有关的基因作为外源基因导入根据本 发明的转基因植物时，可调节植物中水和内部物质的运输或细胞增殖。维 管束也是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和转移的位置。当植物病毒感染 植物时，植物病毒迁移很长距离，从一片叶子移至其上面的叶子，因此， 维管束也是导致植物全株感染的迁移位置。因此，当将与真菌或植物病毒 增殖或迁移有关的基因作为外源基因导入根据本发明的转基因植物时，植 物可得到保护而免受真菌或植物病毒的感染。 同时，毛状体与植物体表面的分泌和排泄有关。例如，据报道，当植 物暴露于重金属(镉)压力时，叶表面上的毛状体数量增加，并且含有镉 或钙的晶体粘附于叶表面，换言之，通过毛状体排泄镉(Planta，213(1)， 45-50，2001年5月)。毛状体也是侵入植物的丝状真菌、细菌、昆虫等最初 接触的位置。此外，作为对病害和昆虫伤害的防御，例如具有抗微生物活 性和阻碍摄入的液体从蔷微科玫瑰的腺毛或腺状突起物中分泌。因此，如 果将与重金属等排泄有关的基因、或与分泌具有抗微生物活性或阻碍摄入 的液体有关的基因作为外源基因导入本发明的转基因植物，重金属可有效 地从植物中排泄，或植物可有效地得到保护而免于丝状真菌、细菌或昆虫 侵入植物。 此外，当将根据本发明的基因作为外源基因导入根据本发明的转基因 植物时，通过促进植物体内百草枯的运输和排泄等，可赋予对百草枯的抗 性。 [实施例] 本发明将参照下述实施例进行详细阐述。然而，这些实施例不用于限 制本发明的技术范围。 [实施例1]分离百草枯抗性基因 在该实施例中，将从Nottingham Arabidopsis Stock Center(http：//nasc.nott.ac.uk/)获得的Weigel T-DNA品系作为鼠耳芥的 活化标记品系。 (1)使用鼠耳芥的活化标记品系(Weigel T-DNA品系)筛选可在 含有百草枯的培养基中生长的克隆 将Weigel T-DNA品系的种子无菌接种至含有3μM百草枯(甲基 紫精，Sigma Chemicai Co制造)的1/2MS琼脂(1％)培养基(2.3g/l Murashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l盐酸吡哆醇、 1.5％蔗糖、1％琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s(每个循环为16 小时光期间/8小时暗期间)下培养。培养后约10天，对在含有百草枯的 培养基中生长的个体进行筛选。 (2)通过TAIL-PCR方法，从筛选的活化标记品系中评估T-DNA 的插入位点 将由经筛选个体获得的Weigel T-DNA品系的种子种于含有蛭石 (Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.制造)的罐中，并于23℃、在光强度为 100μE/m2/s、16小时光周期/8小时暗周期的光周期条件下生长约1月。 使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN制造)，从培养个体的叶制备基 因组DNA，并且在用于Weigel T-DNA品系的活化标记载体(pSKI015： GenBank登录号AF187951)的T-DNA左侧序列(T-DNA左边界：SEQ ID NO：30)的邻近区设计3种特异引物(TL1：SEQ ID NO：31；TL2：SEQ ID NO：32；TL3：SEQ ID NO：33)。然后，使用特异引物和随机引物1(SEQ ID NO：34)实施TAIL-PCR(用于植物的PCR实验方法(Protocols of PCR Experiments for Plants)，(Shimamoto K. & Sasaki T.编辑)，新版， 2000，pp 83-89，Shujunsha Co.，Ltd.，Tokyo；Genomics，25，674-681，1995； Plant J.，8，457-463，1995)，并且按下述的PCR反应混合物和反应条件扩增 T-DNA邻近的基因组DNA。在SEQ ID NO：34中，n代表a、g、c或t (位置：1和11)、s代表g或c(位置：7)和w代表a或t(位置：8和 13)。 第一轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表2和3。 [表2] 模板(基因组DNA)： 10ng 10xPCR缓冲液(TAKARA BIO Inc制造.)： 2μl 2.5mM dNTPs(TAKARA BIO Inc.制造)： 1.6μl 第一特异引物(TL1：SEQ ID NO：31)： 3pmol 随机引物1(SEQ ID NO：34)： 80pmol AmpliTaq(Applied Biosystems制造)： 0.8单位 总体积 20μl [表3] #1：94℃(1分钟)/95℃(1分钟) #2：94℃(1分钟)/65℃(1分钟)/72℃(3分钟)×5个循环 #3：94℃(1分钟)/25℃(3分钟)→72℃3分钟/72℃(3分钟)×1个 循环 #4：94℃(30秒)/68℃(1分钟)/72℃(3分钟) 94℃(30秒)/68℃(1分钟)/72℃(3分钟) 94℃(30秒)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×14个循环 #5 72℃(5分钟) 第二轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表4和5。 [表4] 模板(第一轮PCR产物50倍稀释)： 1μl 10xPCR缓冲液： 2μl 250μM dNTPs： 2μl 第二特异引物(TL2：SEQ ID NO：32)： 4pmol 随机引物1(SEQ ID NO：34)： 60pmol AmpliTaq： 0.6单位 总体积 20μl [表5] #6：94℃(30秒)/64℃(1分钟)/72℃(3分钟) 94℃(30秒)/64℃(1分钟)/72℃(3分钟) 94℃(30秒)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×10个循环 #5 72℃(5分钟) 第三轮PCR反应混合物的组分和PCR条件列于表6和7。 [表6] 模板(第二轮PCR产物50倍稀释)： 1μl 10xPCR缓冲液： 10μl 2.5mM dNTPs： 1μl 第三特异引物(TL3：SEQ ID NO：33)： 30pmol 随机引物1(SEQ ID NO：34)： 300pmol AmpliTaq： 3单位 总体积 100μl [表7] #7：94℃(1分钟)/44℃(1分钟)/72℃(3分钟)×20个循环 #5 72℃(5分钟) 下一步，第二轮和第三轮PCR的反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，证 明扩增的存在与否和反应产物的特异性。 此外，使用特异引物TL3(SEQ ID NO：33)，利用ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，对第三轮PCR的 扩增产物直接测序，然后，利用ABI PRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems)确定核苷酸序列。结果获得278bp序列信息(SEQ ID NO：35)。 在SEQ ID NO：35中，n代表a、g、c或t(位置：13、35、73、108、156、 190、198和201)。在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数据库中，对获得的 序列进行搜索，发现插入位点位于BAC克隆F17I23的77240bp处。 (3)分离百草枯抗性基因的cDNA 将鼠耳芥(鼠耳芥生态型Columbia(Col-0))的种子种于含有蛭石 (Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允许于23℃、光强度为100 μE/m2/s、16小时光周期/8小时暗周期的光周期下生长约1个月。 生长后，使用液氮对个体的叶进行冷冻。随后，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN制造)提取总RNA。此后，使用ProSTAR First Strand RT-PCR Kit(STRATAGEN制造)，从提取的总RNA中合成cDNA。 基于从具有上述(2)中获得的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)的结构基 因的邻近10kb内推测的开发读码框(ORF)的序列，设计用于推测的结 构基因的引物141dF(SEQ ID NO：36)和引物141dR(SEQ ID NO：37)，然 后，应用上述合成的cDNA作为模板，使用这些引物和下述含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO Inc.制造)的反应混合物(表8)实施PCR。 [表8] 模板(cDNA)： 50ng 10×Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)： 2μl dNTPs： 200μM 每一引物： 0.2μM Takara EX-Taq： 1单位 总体积 20μl 应用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个循环作 为反应条件。 将扩增产物克隆进pGEM-T Easy载体(Promega制造)，然后使用 ABI PRISM 310基因分析仪(Applied Biosystems)，确定其核苷酸序列。 结果获得857bp的cDNA片段(SEQ ID NO：1)。将该cDNA片段称为 AtMVR基因，并且含有AtMVR基因的pGEM-T Easy载体称为pAtMVR。 AtMVR基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 [实施例2]搜索相对于AtMVR基因的AtMVR同源基因 基于AtMVR基因的核苷酸序列，在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的数 据库中进行搜索，发现在鼠耳芥基因组上除了AtMVR基因的核苷酸序列 还存在13个AtMVR同源基因。 将每一AtMVR同源基因称为AtMVR3-1-AtMVR3-13。每一 AtMVR同源基因的核苷酸序列和对应的AtMVR同源基因编码的推测氨 基酸序列如下面表9中所列出的序列号所示。表9也列出AtMVR基因和 每一AtMVR同源基因之间的同源性分析结果。使用BLAST P在氨基酸水 平上实施同源性分析。术语“同一性”指根据氨基酸的100％一致性。氨 基酸的分类基于它们侧链的化学特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩阵中， 氨基酸分为带有巯基的氨基酸(C)、具有低分子量的亲水氨基酸(S，T，P，A， G)、酸性氨基酸(N，D，E，Q)、碱性氨基酸(H，R，K)、具有低分子量的疏水 氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F，Y，W)。在表9中，术语“同一性” 在氨基酸方面指100％一致性，术语“阳性率”指当在BLOSUM62氨基酸 替代矩阵中具有阳性分值的氨基酸添加至那些具有100％一致性的氨基酸 时的数值 [表9] AtMVR同源 基因的名称 核苷酸序列 氨基酸序列 同一性 (％) 阳性率 (％) AtMVR3-1 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5 57 70 AtMVR3-2 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7 55 69 AtMVR3-3 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9 39 56 AtMVR3-4 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：11 39 55 AtMVR3-5 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13 37 54 AtMVR3-6 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：15 36 52 AtMVR3-7 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：17 34 52 AtMVR3-8 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：19 34 51 AtMVR3-9 SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：21 37 58 AtMVR3-10 SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 25 44 AtMVR3-11 SEQ ID NO：24 SEQ ID NO：25 33* 51* AtMVR3-12 SEQ ID NO：26 SEQ ID NO：27 25 41 AtMVR3-13 SEQ ID NO：28 SEQ ID NO：29 22 41 *与AtMVR3-11的比较显示的是与AtMVR3-11部分序列同源性比较 的结果。 如表9所示，AtMVR和13个AtMVR同源基因的同源性在同一性上 为22-57％、在阳性率上为41-70％。 [实施例3]构建用于植物的AtMVR表达载体并产生AtMVR转基 因植物 此处应用的转化技术为在Hinchee等(Plant Cell and Tissue Culture， 231-270页，I.K.Vasil，T.A Thorpe编辑，Kluwer Academic Publisher， 1994)概述的农杆菌基因载体系统的基础上，由Pellegrineschi等 (Biochemical Society Transitions 23，247-250，1995)所述的载体系统。 (1)构建用于植物的AtMVR表达载体 使用SacI/SacII将AtMVR基因序列从pAtMVR上切下，并克隆进 pBlueScript(STRATAGENE)。随后，用XbaI/SacI切割含有AtMVR基 因序列的片段，并导入出现于pBI121(Clontech制造)的CaMV 35S启 动子下游的XbaI/SacI位点。由此得到的载体以下作为植物的AtMVR表 达载体。 (2)产生AtMVR转基因植物 通过电穿孔法(Plant Molecular Biology Manual，第二版，B.G. Stanton，A.S.Robbert，Kluwer Academic Publishers，1994)，将上述(1) 中产生的、用于植物的AtMVR表达载体导入根癌农杆菌LBA4404株。随 后，通过Clough等(The Plant Journal 16：735-743，1998)所述的渗入法， 将具有导入的用于植物AtMVR表达载体的根癌农杆菌导入野生型鼠耳芥 生态型Col-0。 在含有卡那霉素的培养基中筛选转化体，并通过自花受粉产生T3代 植物(具有导入的AtMVR基因的纯合子品系)。 下一步，检测导入的AtMVR基因的表达量。将上述产生的转化体和 非转化体的种子分别种于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐 中，并允许在光强度为100μE/m2/s、23℃、16小时光周期/8小时暗周期 的光周期条件下，生长约1个月。 生长后，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，从转化体和野生型 鼠耳芥生态型Col-0非转化体中提取总RNA。此后，使用ProSTAR First Strand RT-PCR Kit(STRATAGEN)，将1μg RNA进行逆转录。然后，应 用1/50体积的所合成cDNA为模板，使用AtMVR基因的引物(引物141d1 (SEQ ID NO：38)和引物141d2(SEQ ID NO：39))，用含有Takara EX-Taq (TAKARA BIO)的下述反应混合物(表10)实施PCR。 [表10] PCR反应混合物： 模板(cDNA)： 50ng 10x Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)： 2μl dNTPs： 200μM 每一引物： 0.2μM Takara EX-Taq： 1单位 总体积 20μl 应用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个循环作 为反应条件。 将扩增产物在琼脂糖凝胶上经过电泳。图1显示电泳结果。从图1可 看出，与非转化体比较，产生的转化体过量表达AtMVR基因。 [实施例4]评估AtMVR基因转化体的百草枯抗性 将来源于所产生的AtMVR基因转化体和非转化体(野生型鼠耳芥生 态型Col-0)的种子无菌接种至含有3μM百草枯(甲基紫精，Sigma Chemical Co制造)的1/2MS琼脂(1％)培养基(2.3g/l Murashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)、1.5 mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l盐酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％ 琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s(每个循环为16小时光期间/8 小时暗期间)下培养8天。培养后，评估发芽个体的生长。结果如图2所 示，其中图2B是显示AtMVR基因转化体和非转化体在不含百草枯的1 /2 MS培养基中生长的图片，图2C是显示AtMVR基因转化体和非转化 体在含有百草枯的1/2 MS培养基中生长的图片。图2A是显示图2B和 2C中AtMVR基因转化体和非转化体位置的简图。 从图2B可看出，结果显示在不含百草枯的培养基中，AtMVR基因转 化体表现出与非转化体同样的生长。同时，从图2C可看出，在含有百草 枯的培养基中，非转化体发展为黄萎病，并死亡，即生长受到显著抑制， 而相反，AtMVR基因转化体的幼苗可以生长。因此，可确定在不含百草 枯的培养基中，不管AtMVR基因表达与否，AtMVR基因转化体与非转 化体表现出同样的生长，也可确定在含有百草枯的培养基中，AtMVR基 因转化体无疑比非转化体具有更高的百草枯抗性。 [实施例5]分离维管束/毛状体特异启动子 将鼠耳芥(鼠耳芥生态型Columbia(Col-0)的种子种于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允许在光强度为100μE/m2/s、23℃、 在16小时光周期/8小时暗周期的光周期条件下，生长约1个月。 生长后，使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，从个体的叶子中制 备基因组DNA。下一步，在下述的反应条件下，应用获得的基因组DNA 为模板，使用基于上述实施例1的AtMVR基因片段(SEQ ID NO：35)设 计的引物141dpF(SEQ ID NO：40)和引物141dpR(SEQ ID NO：41)，使 用下述含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO Inc.)的反应混合物(表11)实 施PCR。 [表11] 模板基因组DNA： 50ng 10x Ex Taq缓冲液(TAKARA BIO Inc.)： 2μl dNTPs： 200μM 每一引物： 0.2μM Takara EX-Taq： 1单位 总体积 20μl 反应条件是94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)进行30个 循环。 将扩增产物克隆进pGEM-T Easy载体(Promega Corp.)，然后使用 ABI PRISM 310基因分析仪，确定其核苷酸序列。结果获得1722bp(SEQ ID NO：3)的AtMVR启动子。 [实施例6]分析维管束/毛状体特异启动子的组织特异性 (1)构建具有AtMVR启动子的表达载体 使用HindIII/PstI，将AtMVR启动子从实施例5中产生的具有AtMVR 启动子(SEQ ID NO：3)的pGEM-T Easy载体上切下，然后亚克隆进 pBI221(Clontech)的CaMV 35S启动子上游区。将得到的载体用PstI/SmaI 处理，以除去CaMV 35S启动子，末端用DNA T4聚合酶(TAKARA BIO Inc.)补平，并允许自连接。结果，AtMVR启动子连接入载体的β-葡糖醛酸 酶(GUS)基因上游。随后，使用HindIII/EcoRI，将含有AtMVR启动子和 GUS基因的片段从上述载体中切下，然后替换为pBI121(Clontech)的 CaMV 35S启动子-β-GUS基因。这样获得的载体用作下面使用的、具有 AtMVR启动子的表达载体。 (2)产生转基因植物 以实施例3(2)中的类似方法，将上述具有AtMVR启动子的表达载 体导入根癌农杆菌LBA4404株，然后通过渗入法，将所述农杆菌菌株导入 野生型鼠耳芥生态型Col-0。此后，在含有卡那霉素的培养基中筛选转化体， 并通过自花受粉产生T3代植物。 (3)分析AtMVR启动子的组织特异性 将来源于上述(2)产生的转化体的种子无菌接种于1/2MS琼脂(1％) 培养基(2.3g/l Murashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l盐酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25 mg/i盐酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％琼脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s (每个循环为16小时光期间/8小时暗期间)下培养约7天。 培养后，将长出的转化体用丙酮固定。将含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D- 葡糖苷酸(X-Gluc)的反应混合物加至固定的组织以浸没全部组织。反应混 合物的组成是：1.9mM X-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6和 0.3％Triton X-100。 然后将容器密封，并在37℃保温箱中过夜孵育。此后，将70％乙醇 加至混合物以终止反应，并观察染色(用于观察植物细胞的实验方法 (Protocols of Experiments for Observing Cells of Plants)，Fukuda H.， Nishimura M.，& Nakamura K.编辑，(1997)，71-79页，Shujunsha Co.，Ltd.， Tokyo)。结果如图3-5所示，其中图3-5分别是完整转化体、转化体的 叶子和转化体的根的显微照片。 从图3-5可看出，在维管束和毛状体中可观察到特异染色。因此，可 确定获得的AtMVR启动子(SEQ ID NO：3)是在维管束和毛状体中具有 组织特异转录活性的转录启动子。 序列表自由文本 SEQ ID NO：31-41是引物。 在SEQ ID NO：34中，n代表a、g、c或t(位置：1和11)，s代表g 或c(位置：7)，以及w代表a或t(位置：8和13)。 在SEQ ID NO：35中，n代表a、g、c或t(位置：13、35、73、108、 156、190、198和201)。 工业适用性 根据本发明，提供了百草枯抗性基因以及维管束和毛状体特异启动子。 根据本发明的百草枯抗性基因可赋予百草枯抗性同时不影响在不同环境下 植物通过产生活性氧而对生长的调节。 此外，根据本发明的维管束和毛状体特异启动子可调节植物的维管束 和毛状体中的基因表达。 发明背景 序列表 <110>丰田自动车株式会社 冈山县 <120>百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子 <130>PH-2160 <140> <141> <150>JP 2003-322051 <151>2003-09-12 <160>41 <170>PatentIn版本2.1 <210>1 <211>855 <212>DNA <213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana) <400>1 cttcttcaat catcaccatg gtacgtttta gtaacagtct tgtaggaata ctcaacttct 60 tcgtcttcct tctctcggtt cccatactct caaccggaat ctggctcagc cttaaagcca 120 cgacgcaatg cgagagattc ctcgacaaac ccatgatcgc tctcggtgtt ttcctcatga 180 taatcgcaat cgctggagtc gttggatctt gttgcagagt gacgtggctt ctctggtcct 240 atctctttgt gatgttcttc ttaatcctca tcgtcctctg tttcaccatc tttgccttcg 300 ttgtcactag taaaggctcc ggcgaaacta tccaaggaaa agcttataag gagtataggc 360 tcgaggctta ctctgattgg ttgcagaggc gtgtgaacaa cgctaagcat tggaacagca 420 ttagaagctg tctttatgag agcaagttct gttataactt ggagttagtc actgctaatc 480 acactgtttc tgatttctac aaagaagatc tcactgcttt tgagtctggt tgctgcaagc 540 cctctaatga ctgtgacttc acctacataa cttcaacaac ttggaataaa acatcaggaa 600 cacataaaaa ctcagattgc caactttggg acaacgaaaa gcataagctt tgctacaatt 660 gcaaagcctg caaggccggt tttctcgaca acctcaaggc cgcatggaaa agagttgcta 720 ttgtcaacat cattttcctt gtactcctcg ttgtcgtcta cgctatggga tgttgcgctt 780 tccgaaacaa caaagaagat agatatggcc gttccaatgg tttcaacaat tcttgatttg 840 cgccggttca agcta 855 <210>2 <211>272 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>2 Met Val Arg Phe Ser Asn Ser Leu Val Gly Ile Leu Asn Phe Phe Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ser Val Pro Ile Leu Ser Thr Gly Ile Trp Leu Ser Leu 20 25 30 Lys Ala Thr Thr Gln Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Met Ile Ala 35 40 45 Leu Gly Val Phe Leu Met Ile Ile Ala Ile Ala Gly Val Val Gly Ser 50 55 60 Cys Cys Arg Val Thr Trp Leu Leu Trp Ser Tyr Leu Phe Val Met Phe 65 70 75 80 Phe Leu Ile Leu Ile Val Leu Cys Phe Thr Ile Phe Ala Phe Val Val 85 90 95 Thr Ser Lys Gly Ser Gly Glu Thr Ile Gln Gly Lys Ala Tyr Lys Glu 100 105 110 Tyr Arg Leu Glu Ala Tyr Ser Asp Trp Leu Gln Arg Arg Val Asn Asn 115 120 125 Ala Lys His Trp Asn Ser Ile Arg Ser Cys Leu Tyr Glu Ser Lys Phe 130 135 140 Cys Tyr Asn Leu Glu Leu Val Thr Ala Asn His Thr Val Ser Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Lys Glu Asp Leu Thr Ala Phe Glu Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser 165 170 175 Asn Asp Cys Asp Phe Thr Tyr Ile Thr Ser Thr Thr Trp Asn Lys Thr 180 185 190 Ser Gly Thr His Lys Asn Ser Asp Cys Gln Leu Trp Asp Asn Glu Lys 195 200 205 His Lys Leu Cys Tyr Asn Cys Lys Ala Cys Lys Ala Gly Phe Leu Asp 210 215 220 Asn Leu Lys Ala Ala Trp Lys Arg Val Ala Ile Val Asn Ile Ile Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Leu Val Val Val Tyr Ala Met Gly Cys Cys Ala Phe Arg 245 250 255 Asn Asn Lys Glu Asp Arg Tyr Gly Arg Ser Asn Gly Phe Asn Asn Ser 260 265 270 <210>3 <211>1722 <212>DNA <213>鼠耳芥 <400>3 agccaagctt gtacattaac cgtgactatt attattattt ttaatgaaat tatttttttc 60 tttctcccat acattttata tgattcgttt cttttaggat tattataaaa tctaaatgat 120 tcgtttctct taagacaagc aaaaaccgaa aaaaggacag cctattatac cgcgttaatt 180 taaagttaat cgtgattgtg ttaatcttga aatgtatttg aacatttttg ttttcttaat 240 acagaattga ttgatgtaag gcagcaaata ttttcctacc aaaataattt gttagggatc 300 ttttagaaaa agaaataaaa taaaaaaaag ggaataagga cagctgggaa gagtgggaca 360 gcagagaaag tggtggtgta cggtaaccgt tggatccgat gaggaattta ataaaggtag 420 tcgtaatctt acggtccagc tgtgaagtac tcatgccacg ttatcttctc caccgacagt 480 acattgttac tatagcagct atagtatagc ctattcaatc atttgtattt taatggtaag 540 caaagaggaa actatgtaga agtttcttat cttatagttt ctcaagtctt ttagttttgg 600 ttccataatc ctttttttag tatgtgaagg tgaaggtgag tttagtatgt gatttttagt 660 atgatttggt tgataacgtt ttcactcgac taattatata cttcagaagg atagtaatag 720 aataccaaaa taattaaatg attggttagt gccttagtgg agacttttta accgattcta 780 atagactaat gatgtagcta agcatttatt tgggatcatc actgtttgaa aacgtgaaat 840 gtgataaaag ttatgaaacg attaaaatat aaaataaccg tacaaaacat tatgtaccgt 900 ttttttctct gttcttttgg cgatttggtt tagttcgtta cactctaaat gttattgcag 960 atatatatat aatgatgcat ttgcatctga ggaacatata attccggtta acacttccaa 1020 atcttatatc cgtctaggta gggattttat aaatcatttg tgtcatcatg cgttatgctt 1080 gtcggctttg accataacgc agagatatag aactagcttt tacttaactt ttagatttat 1140 tatttgatct agagttaagt ggagatatat agtgtttttg ttagattatt ggtggatgtg 1200 agagtttgtc tttagtttca agttgagaat ataaggcaag aggagactct gaggcaatca 1260 gaggttttga ttggcaaaat atccaaaagg cccaaaccaa gtcgaagccc atctcgtaca 1320 aaaaaagaaa gagatctgta agaaaaaata ttctttgata ttcttacaaa aataagtgta 1380 aaacttttat tagtcaaaat cttcaatctt taaaaactct catcactcct acgaaagcgc 1440 gtgagagtta tgagacattc cttaatagca ttactcacaa gtcacaagtt caaaacgtct 1500 gactgaaaca gaaacaagcc tttgttgaag tcttgaagaa gagacattag tactcgtcgt 1560 atagccataa aaggtaatat acgaaatttc ttcgctaatc tcttcacctt cctctacgcg 1620 tttcactttc actttataaa tccaaatctc ccttcgaaaa cataatcaca caaatccctt 1680 ttttggtttc tccaaatctt caaatcttct tcaatcatca cc 1722 <210>4 <211>822 <212>DNA <213>鼠耳芥 <400>4 atggctcgtt gtagcaacaa tctcgtaggg atactcaatt tcctagtatt tcttctctcg 60 atcccaatct tagctggtgg aatctggcta agccaaaaag ggtcaacaga gtgtgaaaga 120 ttcctagaca aaccagtgat tgctcttggt gttttcctta tggttgtagc aatagctggt 180 ctaataggtt catgttgtag agtcacatgg cttctttggg tttatctctt tgtcatgttc 240 cttttgattc tccttgtgtt ctgtataaca gtttttgcct ttgttgttac taacaaagga 300 gctggtgaag ctattgaagg aaaaggttat aaagagtata aacttggtga ttactctact 360 tggttacaga aacgtgttga gaatggtaaa aattggaata agattaggag ttgtcttgtg 420 gagagcaaag tttgttctaa gcttgaagcc aagtttgtta atgttcctgt caatagtttc 480 tacaaggaac atcttactgc tcttcagtct ggttgctgca aaccttcaga tgaatgtggt 540 ttcgagtacg taaacccaac aacctggacc aagaacacaa cgggaacaca cactaatcca 600 gactgccaaa cctgggacaa cgcaaaagaa aagctctgct tcgattgtca atcttgtaaa 660 gcgggtctac tcgacaacgt caaaagcgct tggaagaaag ttgcaatcgt taacatcgtc 720 ttccttgtct tcctcatcat tgtctactct gttggttgct gtgctttcag gaacaacaag 780 agggatgaca gttattcccg tacctacgga tataagcctt ga 822 <210>5 <211>272 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>5 Met Ala Arg Cys Ser Asn Asn Leu Val Gly Ile Leu Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ala Gly Gly Ile Trp Leu Ser Gln 20 25 30 Iys Gly Ser Thr Glu Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Val Ile Ala 35 40 45 Leu Gly Val Phe Leu Met Val Val Ala Ile Ala Gly Leu Ile Gly Ser 50 55 60 Cys Cys Arg Val Thr Trp Leu Leu Trp Val Tyr Leu Phe Val Met Phe 65 70 75 80 Leu Leu Ile Leu Leu Val Phe Cys Ile Thr Val Phe Ala Phe Val Val 85 90 95 Thr Asn Lys Gly Ala Gly Glu Ala Ile Glu Gly Lys Gly Tyr Lys Glu 100 105 110 Tyr Lys Leu Gly Asp Tyr Ser Thr Leu Gln Lys Arg Val Glu Asn Gly 115 120 125 Lys Asn Trp Asn Lys Ile Arg Ser Cys Leu Val Glu Ser Lys Val Cys 130 135 140 Ser Lys Leu Glu Ala Lys Phe Val Asn Val Pro Val Asn Ser Phe Tyr 145 150 155 160 Lys Glu His Leu Thr Ala Leu Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser Asp 165 170 175 Glu Cys Gly Phe Glu Tyr Val Asn Pro Thr Thr Trp Thr Lys Asn Thr 180 185 190 Thr Gly Thr His Thr Asn Pro Asp Cys Gln Thr Trp Asp Asn Ala Lys 195 200 205 Glu Lys Leu Cys Phe Asp Cys Gln Ser Cys Lys Ala Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Asn Val Lys Ser Ala Trp Lys Lys Val Ala Ile Val Asn Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Val Phe Leu Ile Ile Val Tyr Ser Val Gly Cys Cys Ala Phe Arg 245 250 255 Asn Asn Lys Arg Asp Asp Ser Tyr Ser Arg Thr Tyr Gly Tyr Lys Pro 260 265 270 <210>6 <211>792 <212>DNA <213>鼠耳芥 <400>6 atggttcagt gtagcaacaa tctcctcgga atcctcaatt tcttcacatt cctcctctca 60 atcccaattc tctccgccgg gatctggctc ggcaaaaatg cagcaaccga atgcgaacgt 120 ttcctcgaca aaccaatggt cgtactcgga atcttcctca tgttcgtctc aatcgccgga 180 ctcgtcggtg cttgttgccg tgtctcttgc ctcctctggc tttacctctt cgctatgttc 240 ctcctcattc tcctcggctt ctgtttcaca atcttcgctt tcgcagtcac aaaccgcggc 300 gccggtgagg ttatatcgga tcgagggtat aaagagtatc atgtcgccga ttactctaat 360 tggttgcaga aacgtgtcaa caatgctaag aattgggaac ggatcaggag ttgtttgatg 420 tactctgacg tttgctccac ttatcgtact cgttatgcca gcattaacgt tgaagatttc 480 tacaaatcta atcttaatgc tcttcagtct ggttgttgta agccgtccaa tgactgtaac 540 ttcacctatg tgaacccgac tacttggaca aagactcctg gtccatacaa aaacgaggac 600 tgtaatgtgt gggacaacaa accaggaact ctctgctacg actgtgaagc ctgcaaggct 660 ggtctgcttg acaacatcaa gaactcatgg aaaaaggtgg ctaaggtcaa cattgtcttc 720 ctcatattcc tcattatcgt ctactctgtt ggttgttgtg cgttcaggaa caacaggaaa 780 cgcagttggt aa 792 <210>7 <211>263 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>7 Met Val Gln Cys Ser Asn Asn Leu Leu Gly Ile Leu Asn Phe Phe Thr 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ser Ala Gly Ile Trp Leu Gly Lys 20 25 30 Asn Ala Ala Thr Glu Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Met Val Val 35 40 45 Leu Gly Ile Phe Leu Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Leu Val Gly Ala 50 55 60 Cys Cys Arg Val Ser Cys Leu Leu Trp Leu Tyr Leu Phe Ala Met Phe 65 70 75 80 Leu Leu Ile Leu Leu Gly Phe Cys Phe Thr Ile Phe Ala Phe Ala Val 85 90 95 Thr Asn Arg Gly Ala Gly Glu Val Ile Ser Asp Arg Gly Tyr Lys Glu 100 105 110 Tyr His Val Ala Asp Tyr Ser Asn Trp Leu Gln Lys Arg Val Asn Asn 115 120 125 Ala Lys Asn Trp Glu Arg Ile Arg Ser Cys Leu Met Tyr Ser Asp Val 130 135 140 Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Arg Tyr Ala Ser Ile Asn Val Glu Asp Phe 145 150 155 160 Tyr Lys Ser Asn Leu Asn Ala Leu Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser 165 170 175 Asn Asp Cys Asn Phe Thr Tyr Val Asn Pro Thr Thr Trp Thr Lys Thr 180 185 190 Pro Gly Pro Tyr Lys Asn Glu Asp Cys Asn Val Trp Asp Asn Lys Pro 195 200 205 Gly Thr Leu Cys Tyr Asp Cys Glu Ala Cys Lys Ala Gly Leu Leu Asp 2l0 215 220 Asn Ile Lys Asn Ser Trp Lys Lys Val Ala Lys Val Asn Ile Val Phe 225 230 235 240 Leu Ile Phe Leu Ile Ile Val Tyr Ser Val Gly Cys Cys Ala Phe Arg 245 250 255 Asn Asn Arg Lys Arg Ser Trp 260 <210>8 <211>984 <212>DNA <213>鼠耳芥 <400>8 atgagatcga gaagtaacct tataggtctc ataaacttct tcactttcct cctgtcgatt 60 cctatcctcg gcggtggaat atggcttagc agccgagcta actcaaccga ttgcctcaga 120 ttcctccagt ggccactcat tatcatcgga atatcaatca tggtcatatc tttagccgga 180 atcgccggag cttgttacca aaacaagttc ctcatgtggc tttacctttt caccatgttc 240 tttgtaatcg ctgctcttat aggattcaca atcttcgctt acgtagttac tgataaaggc 300 tcaggccggt ttgtgatgaa ccgtcggtat cttgattatt atctcaatga ttattccggt 360 tggttaaagg accgtgtcac agataatgga tattggagag atatcggatc gtgtgttaga 420 gattctggag tttgtaagaa gattggaaga gatttaaatg gtgttccaga aactgctcat 480 atgttttact tcagaaatct ttctcctgtt gagtccggat gttgcaagcc gccaacagat 540 tgtggctata cgtacgtgaa cgagacagtg tggattccgg gaggagaaat ggtgggaccg 600 aacccggact gtatgttgtg gaacaatgac cagagactac tctgttacca atgcagctct 660 tgtaaagccg gtgttcttgg tagcttgaaa aagagttgga gaaaagtctc ggtgatcaac 720 atcgtggttg tgatcatact tgttatcttc tatgtcatcg cgtgtgcggc ttaccagaat 780 gttaagagga tgtataatga cgaaccggtc ggtgaggcta ggatgaccaa tctcatccta 840 gtcattttca aatttaagga gattttggta cagtttttct tcggaattgt gtttttatta 900 ctctttaatg gtttaatggt ctgttgttgt aatgataaat ttgcttttag tgttttcttc 960 tttggatatg ttacatatgc atga 984 <210>9 <211>327 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>9 Met Arg Ser Arg Ser Asn Leu Ile Gly Leu Ile Asn Phe Phe Thr Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Gly Gly Gly Ile Trp Leu Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Asn Ser Thr Asp Cys Leu Arg Phe Leu Gln Trp Pro Leu Ile Ile 35 40 45 Ile Gly Ile Ser Ile Met Val Ile Ser Leu Ala Gly Ile Ala Gly Ala 50 55 60 Cys Tyr Gln Asn Lys Phe Leu Met Trp Leu Tyr Leu Phe Thr Met Phe 65 70 75 80 Phe Val Ile Ala Ala Leu Ile Gly Phe Thr Ile Phe Ala Tyr Val Val 85 90 95 Thr Asp Lys Gly Ser Gly Arg Phe Val Met Asn Arg Arg Tyr Leu Asp 100 105 110 Tyr Tyr Leu Asn Asp Tyr Ser Gly Trp Leu Lys Asp Arg Val Thr Asp 115 120 125 Asn Gly Tyr Trp Arg Asp Ile Gly Ser Cys Val Arg Asp Ser Gly Val 130 135 140 Cys Lys Lys Ile Gly Arg Asp Leu Asn Gly Val Pro Glu Thr Ala His 145 150 155 160 Met Phe Tyr Phe Arg Asn Leu Ser Pro Val Glu Ser Gly Cys Cys Lys 165 170 175 Pro 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taacaagttc cttatgtggc tatacctagt agtcatgctt 240 ctcatcatcg ctgctcttat cggtttcatc atcttcgctt acgcggttac agataaagga 300 tccggtcgaa ccgtacttaa ccggggttat cttgactatt atcttgaaga ttactctggt 360 tggttgaaag atcgagtttc tgatgatagc tattggggta aaattagttc ttgtcttaga 420 gattctggtg cttgtagaaa gattggaaga aattttaatg gtgtacctga aactgctgat 480 atgttcttcc ttagaagact tagccctgtt gagtccggtt gttgcaagcc accaacagat 540 tgcggttttt catatgtgaa tgagaccgga tgggacacga gaggagggat gataggaccg 600 aaccaggact gtatggtgtg gagcaacgac cagagcatgc tctgttatca gtgtagttct 660 tgtaaagctg gtgttcttgg gagtttgaag aagagttgga gaaaagtatc ggtgatcaac 720 attgtggtac ttatcattct agttatcttt tacgttatcg cttatgcagc ttataggaat 780 gtcaagagga tcgataacga tgaaccggct ggtgaagcta ggatgacaaa atcacatcct 840 agtcatttcc atctttga 858 <210>11 <211>285 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>11 Met Arg Thr Ser Asn His Leu Ile Gly Leu Val Asn Phe Leu Thr Phe 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Gly Gly Gly Ile Trp Leu Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Asn Ser Thr Asp Cys Leu Arg Phe 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taaccctggt 120 ttaaggtaca aggagtataa gctgaatgat tacagctcat ggtttctaaa acagcttaac 180 aacaccagta actggataag actaaagagt tgtcttgtta aatccgagca atgtcggaag 240 ctttccaaga aatacaagac catcaaacag ttgaaatccg cagaattaac cccgatagaa 300 gctggatgtt gtcgaccacc atctgagtgt ggttatcctg cggtgaatgc ttcttactat 360 gacttgagct ttcattcgat aagttctaac aaagattgta agctttacaa gaatttgagg 420 actatcaagt gctacaactg tgattcttgc aaagctggag ttgctcagta catgaaaacc 480 gagtggcgac ttgttgcgat cttcaatgtg gtcctgtttg ttgtcttgat aagctctctt 540 cttagcacga gatttgactc tgaacaaagt tttggccttt taaacggttt agtgcaaatt 600 tccaacataa cctttaaaga ttgccaaacc acaacagtac caaaacagtt ttaa 654 <210>25 <211>217 <212>PRT <213>鼠耳芥 <400>25 Met Ile Asp Phe Pro Leu Lys Tyr Leu Ala Val Leu Leu Ile Val Leu 1 5 10 15 Ile Ala Ile Leu Val Phe Thr Val Leu Ala Phe Ile Val Thr Asn Asn 20 25 30 Gly Ser Gly His Thr Asn Pro Gly Leu Arg Tyr Lys Glu Tyr Lys Leu 35 40 45 Asn Asp Tyr Ser Ser Trp Phe Leu Lys Gln Leu Asn Asn Thr Ser Asn 50 55 60 Trp Ile Arg Leu Lys Ser 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