技术领域 本发明涉及一种衰老抑制基因启动子激活剂的筛选方法，尤其是 Klotho基因启动子激活剂的筛选方法，属于分子药理学技术领域。 背景技术 1997年Makoto Kuro-o等在nature杂志公开了klotho基因 (Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing，NATURE VOL390，6NOV.1997，P45-51)，klotho是一种衰老抑制基因， 这个基因编码一个膜蛋白和一个分泌型蛋白，它在抑制衰老方面起着 重要的作用。小鼠的Klotho基因表达缺乏会导致类似于人类衰老的 综合症，即短寿、不育、动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松和肺气肿等。 杂合子Klotho突变小鼠和野生小鼠的联体共生能恢复杂合子的 内皮功能。腺病毒介导的外源的Klotho基因施于有限的器官中，使其 在脑和睾丸中表达，能改善Klotho突变小鼠的全身衰老表型，寿命延 长，体重增加，萎缩的肌肉得以恢复，恢复了性腺细胞、免疫细胞、 皮下脂肪的形成和分化等。通过腺病毒介导的Klotho基因导入到 Klotho突变小鼠和没有突变但Klotho基因表达水平显著降低的OLETF 大鼠都能增加一氧化氮的产生，恢复血管的内皮功能。这说明Klotho 蛋白能经体液通路，促进主动脉和小动脉中内皮的一氧化氮的产生， 保护心血管系统，防止内皮功能障碍。最近我们用基因芯片发现在老 年记忆减退的小鼠与记忆正常的小鼠相比，海马中klotho基因的表达 显著下降，说明记忆减退和klotho基因表达下降有关。 最近的研究表明，klotho基因可能与人类某些衰老相关的疾病 的病因有关。Klotho可能对某些衰老相关疾病，如：骨质疏松症、 脊椎关节强硬等和冠状动脉疾病起着遗传调节作用，衰老将引起 klotho基因表达下降，因此，调节klotho基因的表达对改善衰老相 关疾病是非常重要的。能调节klotho基因表达的药物对衰老机制的 研究、klotho基因的功能研究和衰老相关疾病的防治是非常重要的， 但是，目前尚没有真正能有效调节该基因表达的药物。而且，关于 klotho基因启动子激活剂的筛选方法尚没有文献报道。研究基因表 达水平的方法很多，如：从蛋白质水平的Westernblot、毛细管电 泳、从mRNA水平的southern blot、基因芯片、mRNA差异显示、定 量PCR等。这些经典的方法虽然直接，但是，除了毛细管电泳有望开 发成高通量药物筛选方法以外，其它都不行，都不适合高通量药物筛 选，而毛细管电泳用于高通量药物筛选还很不成熟。报告基因方法也 常用于研究基因表达和调控，可以从基因转录和翻译两个水平去研 究。在翻译水平上，不太容易设计成高通量药物筛选方法，而且，翻 译水平又受到转录水平的控制。因此，我们认为从转录水平来考虑是 比较理想的，通过提高转录水平，就可能达到提高基因表达的目的。 从转录水平研究基因表达的报告基因方法，方法灵敏，适合高通量药 物筛选，通过研究某启动子相连的报告基因的表达水平，间接的发映 出这个启动子对所控制基因的调控情况。 发明内容 本发明目的在于提供一种灵敏、能够适用于高通量Klotho基因 启动子激活剂的筛选方法。 具体来说本发明是通过以下技术方案来达到本发明目的，主要包 括以下几个步骤： 第一步：将Klotho基因启动子与报告基因连接； 第二步：将连接后的基因转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株； 第三步：向稳定细胞株中加入氧化剂，建立衰老细胞模型； 第四步：在衰老细胞模型中加入待筛选的中药提取物，测定报告 基因的表达水平，评估中药的生物活性； 第五步：将生物活性高的中药提取物分离成单个化合物，得到 Klotho基因启动子激活剂。 关于筛选过程中所用的报告基因：可以是氯霉素乙酰转移酶(CAT)、 荧火虫荧光素酶(Luci)、碱性磷酸化酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)和绿 色荧光蛋白(GFP)，β-内酰胺酶(β-Latamase)其中的任何一种。 关于筛选过程中所用的哺乳动物细胞为哺乳动物干细胞、哺乳动 物胚胎细胞或者哺乳动物肾细胞其中的任何一种。 关于筛选过程中涉及到的氧化剂为：过氧水或者百草枯(paraquate)。 本发明所述的Klotho基因启动子激活剂的筛选方法是基于细胞 的，需要一个细胞系用于klotho启动子控制之下的报告基因的表达。 启动子的活性是有组织特异性的，在某些细胞中，该启动子的活性可 能低，不适合它所控制的基因的表达，用此细胞筛选得到的药物，其 调控作用可能不能反映该基因在体内的情况。而适合某个启动子所控 制的基因表达的细胞，例如，在体内有高表达的细胞，由于与体内的 情况相当，筛选得到的药物能充分反映体内的调控作用，但是，因启 动子活性已达了足够的程度，可能无法再继续上调，从而为实施启动 子激活剂的筛选增加困难。本发明Klotho基因启动子激活剂的筛选 方法关键技术主要有两个方面：一是将klotho基因启动子与报告基 因相连接，通过检测报告基因的表达水平来评测中药的生物活性。另 一个方面是建立一个衰老的细胞模型，由于氧化应激是衰老的重要原 因，Klotho基因启动子活性已经较高，无法再继续上调，为实施启 动子激活剂的筛选增加困难。只有建立衰老细胞模型才能更好地提取 报告基因的表达信号，检测中药的生物活性。用氧化剂处理细胞，建 立一个氧化应激下的衰老细胞模型，然后加入药物刺激，检测药物对 报告基因的表达水平的影响，从而评估该药物生物活性。 本发明应用现代生物技术，建立以基因工程为基础的药物筛选细 胞模型。这种筛选模型适合高通量筛选，本发明所建立的细胞筛选模 型操作简单易行，具有很好的特异性和敏感性，能够高效、快速、准 确地发现人类klotho启动子的激活剂。由于是建立在衰老的理论基 础上，以衰老抑制基因klotho为药靶，筛中的药物对研究klotho基 因的功能、衰老机制的研究、特别是对衰老及相关疾病的防治是非常 重要的。 具体实施方式 第一步：将Klotho基因启动子与报告基因连接； 根据Klotho启动子的序列设计两段引物：其一为5’-GGG AAG CTT GCT GCG CGG GAG CCA GGC TCC GGG GC-3’；其二为5’-GGC CTC GAG TGC TAA TAT ATG CTG GCT GGA GTT GG-3’，将其稀释到 20μM。以浓度为1ng/ul的人类基因组DNA为模板进行扩增，扩增酶 购自TaKaRa公司，将PCR产物连接到载体pMD18-T(购自TaKaRa公 司)，形成质粒tKL。通过HindIII和XhoI酶(购自TaKaRa公司)切 tKL质粒得到的Klotho启动子片段，再亚克隆到用HindIII和XhoI 核酸内切酶消化过的萤火虫荧光素酶的载体pGL3(购自Prome ga)上， 最终形成质粒pGKL。 本步骤中的关键点在于将Klotho基因启动子与报告基因连接， 这里将Klotho基因启动子与报告基因连接主要目的在于可以通过报 告基因的表达水平反映中药的生物活性，因此凡是能较好地反映中药 生物活性的报告基因都可以使用，我们尝试了荧火虫荧光素酶(Luci)、 氯霉素乙酰转移酶(CAT)、、碱性磷酸化酶(SEAP)、β-半乳糖苷酶(β-gal)和 绿色荧光蛋白(GFP)，β-内酰胺酶(β-Latamase)等。 本步骤的其他方面对本领域人员而言为常规方法。其中Klotho 基因的序列已经公开，设计引物的方法、“启动子连接到载体”、“亚 克隆”等均为常规方法，而且，用于扩增的PCR酶购自于TaKaRa公 司，扩增方法只需参照有关产品说明书，具体说来就是按总体积50μl 体系进行PCR，94℃变性，退火温度为50-60℃每1℃两个循环渐渐 上升，其后60℃增加5个循环，每个循环72℃延伸30分钟，最后 72℃再延伸30分钟。内切酶的使用方法也可参照有关说明书进行。 第二步：将连接后的基因转染哺乳动物细胞形成稳定细胞株； HEK293细胞用含有10％胎牛血清(购自Gibco公司)、1％双抗和 1％非必需氨基酸(购自Gibco公司)的细胞培养液，37℃、5％CO2条 件下培养。用2μl将2×106个HEK293细胞接种到直径为35毫米的培 养孔中，待细胞融合度达到50-70％，用22μl lipofectin(购自 Invitrogen公司)与2μgDNA混合物〔pGKL和pcDNA3.1按5∶1混合〕 转染细胞，方法参照试剂说明书，24小时后，用含有G418的、浓度 为800μg/ml在筛选的条件下培养2个星期，四到五天换一次细胞培 养液，然后加入荧光素酶底物Bright GloTM(Promega)，用Analysit HT(Molecular Device)检测荧光素酶活性，进行功能筛选，最终形成 稳定的HEK293/KL细胞株。 本步骤中的培养方法为常规方法，荧光素酶的活性的检测等对本 领域科技人员而言都是常规方法。所用的哺乳动物细胞我们在实验中 用了哺乳动物干细胞、哺乳动物胚胎细胞和哺乳动物肾细胞。 第三步：向稳定细胞株中加入氧化剂，建立衰老细胞模型； 用96孔板对HEK293/KL细胞进行铺板，加入10μl，浓度为0.06％ 的H2O2，37℃、5％CO2条件下温育4小时，建立衰老细胞模型。 我们在该步骤中所用的氧化剂，选用的是H2O2，因为氧化应激是 衰老的重要原因，所以其他氧化剂也可以代替H2O2的功能，如我们在 实验中还用了百草枯(paraquate)代替H2O2。而且所加氧化剂的具体参数应 根据氧化剂的不同而不同。 第四步：在衰老细胞模型中加入待筛选的中药提取物，测定报告 基因的表达水平，评估中药的生物活性； 将中药提取物加入到衰老的细胞模型当中，处理HEK293/KL细胞 6小时，测量萤火虫荧光素酶的活性，发现该中药提取物在筛选过程 中表现出活性。 第五步：将生物活性高的中药提取物分离成单个化合物，得到 Klotho基因启动子激活剂。 结果表明，本发明所用的中药提取物对klotho启动子的激活作 用是浓度依赖性的，EC50约为50ng/l。在H2O2存在下，本发明所用 的中药提取物对含有血清响应元件(SRE)、cAMP响应元件(CRE)、 多功能响应元件(MRE)和VIP启动子的报告基因系统无调节作用， 进一步证明了本发明所用的中药提取物对klotho基因启动子的激活 作用。 分析验证筛选方法及筛选得到的化合物的可靠性 我们把10μl浓度为0.06％的H2O2和Bright GloTM同时加入 HEK293/KL细胞，检测荧光素酶活性，结果表明H2O2并不影响底物。 我们在含有100μl(2×105cells/ml)HEK293/KL细胞的96孔板中， 每孔加入100μlPBS洗涤，去掉PBS，再加入25μl阳性裂解缓冲液 (Promega)，37℃下温育5分钟裂解细胞，然后每孔加入100μlPBS和 10μl浓度为0.06％的H2O2，37℃下温育1小时，检测荧光素酶活性。 结果显示H2O也不影响荧光素酶。 因为中药原始提取物成分复杂，一些提取物在高浓度即原始浓度 下并不显示活性，但稀释后却能显示活性，而另有一些提取物在高浓 度下显示活性，在低浓度下活性降低。在试验中我们用了两种浓度， 原浓度和稀释5倍浓度，10μl浓度为0.06％的H2O2和10μl中药提取 物同时加入细胞，37℃，5％CO2条件下孵育6小时。每两个孔作为平 行孔检测同一样品的同一浓度。如果加了中药后的检测值大于加了 H2O2而未加中药检测值的加3倍的标准差，则这些样品就是具有潜在 活性的中药。 部分中药可能直接与H2O2作用，减弱了H2O2的氧化功能，并不是 真正地刺激提高荧光素酶的表达。为了排除这种假阳性，在第一步筛 选中确定了有潜在活性的中药样品之后，我们进行其他的试验以确定 具有真正活性的中药。先用10μl浓度为0.06％的H2O2处理细胞3小 时，然后移去含有H2O2的培养液，另加100μl新鲜培养液并加入10μl 中药提取物，温育5小时，检测荧光素酶活性。 我们在细胞中加入H2O2和本发明所用的中药提取物样品或只加入 H2O2，以确定孔-孔、板-板间的相对差异，用来评估报告基因试验 是否适用于高通量筛选。每个样品在一个标准的96孔板里的变化系 数可以通过计算得出。用H2O2处理的阴性结果的变化系数是7.8％， 用H2O2和本发明所用的中药提取物样品处理的阳性结果的变化系数 是7.2％，标准差很小，所以可以通过可靠的数据分析相对简便地确 定有活性的化合物样品。无论试验是否在同一天进行，板与板间的变 化系数差异不大，为了评估这种方法是否适合于高通量筛选，我们用 Z’因子方法，通过计算得出Z’因子为0.58，说明这种方法适合于 高通量筛选。 原料和试剂的来源： 中药购自重庆著名药店桐君阁，pMD18-T载体、各种内切酶、PCR 酶及相关试剂购自TaKaRa，lipofectin购自Invitrogen，细胞培养 用试剂(DMEM、胎牛血清、双抗、非必需氮基酸、G418等)购自Gibco， 荧光素酶底物Bright GloTM购自Promega。