技术内容
发明领域
本发明涉及癌诊断用引物及含有该引物的癌诊断剂。特别地，本 发明涉及能够同时检出从MAGE 1到MAGE 6的6个MAGE亚型 (MAGE 1-6)或从GAGE 1到GAGE 8的8个GAGE亚型(GAGE 1-8) 的共同引物(common primer)，及含有该引物的癌诊断剂。
背景技术
癌的诊断是通过医学生理检查、X-射线和CT、组织学检查等进 行的。但是，这样的方法不适合难以鉴别初期癌症、微小癌和阳性肿 瘤的场合。
最近开发的分子生物学诊断方法具有高的癌症诊断特异性及高灵 敏度，其大大地促进了癌诊断领域的发展。
分子生物学诊断技术中最广泛使用的方法是聚合酶链反应 (PCR)或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。在这些各种方法中 扩增并检出试样的异常基因或癌抗原基因。
RT-PCR是检出以特定的基因表达的mRNA的方法，其可以用于 通过检查癌抗原基因的表达特性来诊断癌症。在RT-PCR法中诊断癌 症最重要的事项是选择待检出的癌症诊断用的目标基因(以下称“癌 诊断标记”)，一般是检出一种癌诊断标记。
对癌诊断标记的要求是其应在癌中被特异表达，在尽可能多的癌 症中大量表达。
MAGE(黑素瘤抗原基因)和GAGE是在多种癌组织中被表达的两 种癌关联睾丸抗原，但在除睾丸以外的其他正常组织中没有表达。
自从MAGE最初在黑素瘤中被发现以来，通过多种研究已明确 在胃癌(1、2)、食道癌(3)、大肠癌(4)、肺癌(5)、乳腺癌 (6、7)、肝癌(8)、白血病(9)、成神经细胞瘤(10)、卵巢癌 (11)等多种癌中被表达，有报告说GAGE在黑素瘤、肉瘤、小细胞 癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌等中被表达(11、12)。
因此，由于MAGE和GAGE不仅能够检出多种癌症而非单一种 类癌，而且与其他癌关联抗原如癌胚抗原等相比，其具有高的癌组织 表达特异性，所以可以广泛用作癌诊断标记。
另外，MAGE和GAGE在亚型间具有高的基因同质性，MAGE 的大约12种亚型具有约56％至99％的同质性(13)，GAGE的8种 亚型具有82％至99％的同质性(13)。因此使用这样的相同碱基序 列部位作为引物时由于MAGE或GAGE的许多亚型可以在RT-PCR 过程中同时检出，所以癌诊断率可更高。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供通过选择MAGE或 GAGE作为癌诊断标记，并能够通过RT-PCR同时检出这样的癌诊断 标记的多种亚型，从而具有高癌诊断率及高癌诊断特异性的共同引 物。
为实现上述目的，根据本发明的适当实施例，提供一种引物，其 特征在于，选自序列号3至序列号10。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种共同引物，其特征在于， 由选自序列号3至序列号10的两个序列组成。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种方法，其特征在于，使 用由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物诊断癌症。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种癌诊断用试剂盒，其特 征在于，含有选自序列号3至序列号10的引物及PCR试剂。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种癌诊断用试剂盒，其特 征在于，含有由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引 物及PCR试剂。
本发明提供引物和含有该引物的癌诊断剂，所述的引物通过在 RT-PCR中同时扩增MAGE或GAGE的多种亚型并检出这些基因，能 够诊断癌症。
为同时检出MAGE及GAGE的多种亚型，通过比较多种亚型的 基因序列，制作共同引物。引物的制作过程是：获得在GenBank登记 的12种MAGE基因和8种GAGE基因信息后，比较各基因的碱基序 列，分析DNA的同质性，并选择同质性高的部位。这样制作的共同 引物如下表1所示：
<表1> 引物 癌诊断引物 类型 序列 序列号1 MAGE1-6 S 5’-GGTCACAAAGGCAGAAATGCT-3’ 序列号2 MAGE1-6 AS 5’-GCCCTTGGACCCCACAGGAACTC-3’ 序列号3 MAGE1-6 S 5’-CTGAAGGAGAAGATCTGCC-3’ 序列号4 MAGE1-6 AS 5’-CTCCAGGTAGTTTTCCTGCAC-3’ 序列号5 MAGE1-6 S 5’-CTGAAGGAGAAGATCTGCCWGTG-3’ 序列号6 MAGE1-6 AS 5’-CCAGCATTTCTGCCTTrGTGA-3’ 序列号7 GAGE1-8 S 5’-AGTTGGCGAGGAAGATCGAC-3’ 序列号8 GAGE1-8 AS 5’-CTTCTTTTAACACTGTGATTGC-3’ 序列号9 GAGE1-8 S 5’-AGCCTCCTGAARTGATTGG-3’ 序列号10 GAGE1-8 AS 5’-GCGTTTTCACCTCCTCTGGAT-3’
表中，S是指有义引物；AS是指反义引物，W是指A或T，R 是指A或G。
序列号1/2是对于MAGE的引物，但在实施PCR时呈现假阳性 反应。据推测，呈现假阳性反应的原因是，由于这些引物的位置是在 一个外显子内，所以来自受污染的基因组DNA的基因被扩增的可能 性很高。
序列号3/4和序列号5/6是对于MAGE的引物。序列号3和序列 号5是位于两个外显子边界的引物，使用序列号3/4和序列号5/6的PCR 和嵌套式PCR上不呈现假阳性反应，这是因为序列号3和序列号5 没有结合到基因组DNA上。
序列号7/8和序列号9/10是对于GAGE的引物。序列号7和序 列号8或序列号9和序列号10各自位于不同的外显子上，在使用序 列号7/8及序列号9/10的实验中没有假阳性反应，这是因为在这些外 显子之间被插入了一个长的内含子。
用于诊断癌症的细胞系包括人的胃癌细胞系(SNU484、SNU638、 SNU668)、头颈癌细胞系(AMC-HN-3、AMC-HN-4、AMC-HN-7)、 子宫颈癌细胞系(HeLa、Caski)、肺癌细胞系(NCI H1703、NCI H522)、 大肠癌细胞系(HT29)、转移性前列腺癌细胞系(LN.CAP)、早幼 粒细胞性白血病(HL60)及骨肉瘤细胞系(SaOS2)。人体的癌组织 和细胞使用了乳腺癌12例、头颈部上皮细胞癌27例、胃癌5例、甲 状腺癌3例、淋巴瘤3例、囊腺瘤1例、肉瘤1例、皮肤纤维肉瘤1 例、恶性混合肿瘤1例、膀胱癌患者的尿细胞9例、胃癌患者的腹腔 细胞15例。作为对照用的阳性癌组织和细胞使用了头颈部阳性癌18 例、正常血液的白细胞10例、正常及泌尿器炎症患者的尿细胞10例。
各种癌组织在使用前一直保存在-70℃下，然后向组织中加入 RNAzol B(Tel-Test Inc.，U.S.A.)后，用组织粉碎机粉碎组织。
通过在完全除去培养基并用生理盐水清洗后加入RNAzol B，将 培养的细胞系溶解。打开腹腔后收集胃癌的腹腔细胞，然后将其与 RNAzol B混合。从血液中仅收集有核细胞后，通过加入RNAzol B将 正常白血细胞完全溶解。从尿中收集细胞后，加入RNAzol B与尿细 胞混合。
从溶解有各种组织及细胞的RNAzol B溶液中分离RNA是按照 イムハク等的方法(14)。
通过添加等量的稳定剂(Roche Diagnostics，Mahnheim， Germany)、振摇混合使痰完全液化，并使用mRNA分离试剂(Roche Diagnostics，Mahnheim，Germany)分离mRNA后，将痰用于RT-PCR。
通过使用本发明的共同引物，可以利用PCR诊断癌症。从患者 的各种癌组织、痰、血液、尿、腹腔细胞等提取总RNA或mRNA后， 实施逆转录反应，生产cDNA。通过对cDNA实施使用本发明的共同 引物(序列号1、2或序列号3、4或序列号7、8)的PCR，扩增MAGE 1-6或GAGE 1-8，通过对初次PCR产物实施使用本发明共同引物(序 列号5、6或序列号9、10)的二次PCR(嵌套式PCR)后，对PCR 产物进行电泳，通过检出MAGE 1-6或GAGE 1-8 DNA条带，可以同 时诊断多种癌症。
在本发明中，作为扩增或表达MAGE 1-6或GAGE 1-8的方法使 用PCR，但是，并不限于本发明书记载的应用，因为实验者通过改变 试剂或周期，PCR可能有多种应用，包括使用本发明的共同引物扩增 或表达MAGE 1-6或GAGE 1-8的多种方法。
如上所述，在本发明中提供同时含有本发明的共同引物和PCR 试剂的癌诊断用试剂盒。
附图说明
图1显示了MAGE引物及DNase处理对使用PCR或RT-PCR检 出MAGE的影响；
图2显示了使用序列号3/4和序列号5/6引物的RT-PCR法的 MAGE检出的特异性结果；
图3显示了通过在癌细胞系中使用序列号3/4和序列号5/6引物， 测定MAGE的各亚型和MAGE 1-6的结果；
图4显示了通过在乳腺癌患者的癌组织中使用序列号3/4和序列 号5/6引物，测定MAGE的各亚型和MAGE 1-6的结果；
图5显示了通过在头颈癌和头颈阳性肿瘤中使用序列号3/4和序 列号5/6引物，测定MAGE 1-6的结果；
图6显示了通过在头颈癌患者的癌组织中使用序列号3/4和序列 号5/6引物，测定MAGE的各亚型和MAGE 1-6的结果；
图7显示了通过在其他癌组织和尿细胞中使用序列号3/4和序列 号5/6引物，测定MAGE 1-6的结果；
图8显示了通过在癌细胞系中使用序列号7/8和序列号9/10引 物，测定GAGE 1-8的结果；
图9显示了通过在癌组织及尿细胞中使用序列号7/8和序列号9/10 引物，测定GAGE 1-8的结果；
图10显示了通过在肺癌组织及痰中使用序列号3/4和序列号5/6 引物，测定MAGE 1-6的结果；
图11显示了通过在血液中使用序列号3/4和序列号5/6引物，测 定MAGE 1-6的结果。
符号说明：C1：序列号1；C2：序列号2；C3：序列号3；C4： 序列号4；C5：序列号5；C6：序列号6；C7：序列号7；C8：序列 号8；C9：序列号9；C10：序列号10
具体实施方式
以下通过实施例更进一步地详细说明本发明，但本发明的内容并 不限于这些实施例。
实施例1
获得了在GenBank登记的12种MAGE基因和6种GAGE基因 信息后，首先利用DNAsis程序对基因的碱基序列进行比较分析。结 果显示，MAGE型的基因(cDNA)的同质性为56-99％，GAGE型的 基因(cDNA)的同质性为82％-99％。各亚型的碱基序列相同的部位 被指定为引物。
在自动DNA合成器(PerSeptive Biosystem社制造的Expedidite TM Nucleic Acid Synthesis System)中装入作为引物合成材料的dATP、 dTTP、dCTP、dGTP和合成用柱并输入待合成的序列后，合成结束。 经过氨处理过程和精制过程后，通过用紫外分光光度计测定浓度使用 合成的引物。
制作的引物如表1所示。
序列号1和序列号2(序列号1/2)、序列号3和序列号4(序列 号3/4)作为MAGE引物用于RT-PCR或初次PCR，序列号5和序列 号6(序列号5/6)用于二次PCR(嵌套式PCR)。
序列号7和序列号8(序列号7/8)及序列号9和序列号10(序 列号9/10)作为用于GAGE检出的引物，序列号7/8用于RT-PCR或 初次PCR，序列号9/10用于嵌套式PCR。 实施例2
<总RNA的分离>
各种癌组织在使用前一直保存在-70℃下。在组织中加入1-2ml RNAzol B(Tel-Test Inc.，U.S.A.)后，用组织粉碎机粉碎组织。在完 全除去培养基并用生理盐水清洗一次后，通过加入RNAzol B分离培 养的癌细胞系。胃癌的腹腔细胞是通过打开腹腔后，在腹腔下部加入 100ml生理盐水并收集腹腔细胞后，以1200rpm的转速离心5分钟而 收集的。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞一次后，将细胞沉淀物加 到RNAzol B中并混合。分离正常血液的白细胞时，首先在加入了抗 凝剂的5ml血液中加入20ml灭菌蒸馏水(DEPC-DW)并放置17秒 种后，加入2倍浓度的磷酸盐缓冲液20ml并混合后，以1200rpm(转 /分钟)的转速离心5分钟，仅收集有核细胞。在收集的细胞中加入1ml RNAzol B完全溶解细胞。通过收集50ml尿后，进行离心，收集尿细 胞。此时，加入磷酸盐缓冲溶液清洗细胞一次后，在细胞中加入1ml RNAzol B并混合。
在溶解有各种组织及细胞的RNAzol B溶液中添加1/10量的氯 仿、振摇而混合后，以12000rpm的转速离心15分钟，分离蛋白质层 和RNA，边注意分离的上层RNA溶液边收集，并转移到1.5ml试管 中。在RNA溶液中添加等量的100％异丙醇并混合后，在-20℃下保 存16小时以上，使RNA沉淀。通过以12000rpm的转速离心RNA-异 丙醇混合液而使RNA沉淀后，除去上清液，添加1ml70％的冷乙醇 清洗RNA沉淀后进行离心，完全除去上层乙醇溶液，将RNA沉淀溶 解于灭菌蒸馏水(DEPC-DW)，利用分光光度计测定RNA的浓度和 纯度。通过将100μgRNA加到DNase(脱氧核糖核酸酶)溶液(20mM MgCl2，20mM Tris-HCl，0.4U DNase 1，0.8U RNasin)中，将一部分试 剂在37℃处理1小时后，再次提取RNA用于前述的RT-PCR或RNA PCR中。
通过添加等量的稳定剂(Roche Diagnostics，Mahnheim， Germany)、振摇混合使痰完全液化后，使用mRNA分离试剂(Roche Diagnostics，Mahnheim，Germany)分离RNA后，将其用于RT-PCR。
实施例3
收集总RNA并按如下方法实施PCR，以研究基因组MAGE DNA 是否被污染。首先通过混合10X PCR缓冲液3μl、25mM MgCl2 1.8μl、 10mM dATP 0.3μl、10mM dGTP 0.3μl、10mM dTTP 0.3μl、10mM dCTP 0.3μl、50μM有义和反义引物0.25μl、Taq聚合酶(5U/μl，Promega Co.， U.S.A.)0.25μl，使最终溶液量为25μl，来制作PCR反应液。将PCR 反应液加入PCR试管中，在其中添加总RNA溶液(0.1μg/μl)5μl并 混合后，滴入一滴矿物油，然后加入PCR器(Cetus 480，Perkin Elmer Co.， U.S.A.)中，在以下条件下实施PCR：首先在94℃加热5分钟后，以 在94℃下30秒、57℃下45秒、72℃下45秒作为一个周期，反应30- 35个周期以扩增DNA，最后在72℃下处理5分钟，结束PCR。在1 ％琼脂糖凝胶中加入PCR产物进行电泳后，使用UV透照仪观察被扩 增的DNA条带。
实施例4
<逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)>
总RNA溶液在70℃水浴中放置10分钟使其变性后，保存在冰 中。首先，将5X RT缓冲液2μl、10mM dATP 0.25μl、10mM dGTP 0.25μl、10mM dTTP 0.25μl、10mM dCTP 0.25μl、MMLV逆转录酶 (200U/μl)0.25μl、RNase(核糖核酸酶)抑制剂(28U/μl)0.25μl、50μM 低聚dT引物0.5μl和灭菌蒸馏水(DEPC-DW)4μl加到PCR试管中， 制作RT反应液。在RT反应液中加入在冰中保存的总RNA溶液 (1μg/μl)2μl后，滴入一滴矿物油，将全部溶液在室温下放置10分 钟。将该试管放入PCR器中，在42℃下热处理60分钟结束逆转录反 应，将逆转录反应产物用蒸馏水以1∶1的比例稀释后用于PCR。在 上述PCR反应产物25μl中加入逆转录反应产物5μl，混合后，滴入一 滴矿物油，将其放入PCR器中在下述条件下实施PCR：首先在94℃ 加热5分钟后，以在94℃下30秒、57℃下45秒、72℃下45秒作为 一个周期，反应18-35个周期以扩增DNA，最后在72℃处理5分钟， 结束PCR。
实施例5
<嵌套式PCR>
用蒸馏水将PCR或RT-PCR产物稀释10倍后，取2μl。在其中 添加上述的PCR试剂后，实施二次PCR。
实施例6
从培养的胃癌细胞系(SNU484、SNU638、SNU668)、头颈癌 细胞系(AMC-HN-3、AMC-HN-4、AMC-HN-7)、子宫颈癌细胞系 (HeLa、Caski)、肺癌细胞系(NCI H1703、NCI H522)、大肠癌细 胞系(HT29)、转移性前列腺癌细胞系(LN.CAP)、早幼粒细胞性 白血病(HL60)及骨肉瘤(SaOS2)细胞系中提取总RNA后，实施 用于检出MAGE的PCR和RT-PCR(图1)。
图1的A是以总RNA为对象，使用序列号1/2进行PCR的结果， B是将DNase处理到总RNA中后，使用序列号1/2进行PCR的结果。 C是以总RNA为对象，使用序列号3/4进行PCR的结果，D是以总 RNA为对象，使用序列号3/4进行PCR后，使用序列号5/6进行嵌套 式PCR的结果。结论是，为使用序列号1/2，需要进行DNase处理， 但是序列号3/4或序列号5/6不进行DNase处理也可检出MAGE，通 过扩增基因组DNA，没有显示假阳性反应。序列号3/4和序列号5/6 能够检出从MAGE-1至MAGE-6的至少6种MAGE亚型(MAGE 1-6)。
实施例7
<使用序列号3/4、序列号5/6的RT-PCR法的癌诊断特异性评价>
为研究使用序列号3/4、序列号5/6的RT-PCR法的癌诊断特异 性，提取SNU484细胞系和正常血液的白细胞实施RT-PCR及嵌套式 PCR，结果显示，在SNU484中，MAGE 1-6只能在RT-PCR和嵌套 式PCR中检出，当实施PCR和嵌套式PCR时DNA没有扩增(图2A)。 在正常的白细胞中没有检出MAGE 1-6(图2B)。
实施例8
<癌细胞系中的MAGE测定>
以14种癌细胞系为对象，测定了MAGE的各亚型和MAGE 1-6。 以具有MAGE特异性的序列号3为引物，通过RT-PCR测定MAGE 的各亚型，使用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR， 测定MAGE 1-6。与各亚型的测定结果相比，MAGE 1-6的测定实验 显示更高的阳性率(78.6％)(图3)。
实施例9
<乳腺癌中的MAGE测定>
以乳腺癌患者的癌组织为对象，测定了MAGE的各亚型和MAGE 1-6。通过以序列号3/4为引物的RT-PCR和使用具有MAGE特异性 的序列号5引物的嵌套式PCR，测定MAGE的各亚型，但使用序列 号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，测定MAGE 1-6。 结果显示，与各亚型的测定相比，MAGE 1-6测定的阳性率(91.2％) 更高(图4)。
实施例10
<头颈癌及头颈阳性瘤中的MAGE测定>
测定了头颈癌和头颈阳性瘤中的MAGE 1-6。使用序列号3/4及 序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定了MAGE 1-6。27例癌中 19例呈阳性(70.3％)，阳性瘤中没有检出一个(图5，图5中的M 是尺寸标记，-是没有加入cDNA的PCR结果)。 实施例11
<头颈癌中的MAGE亚型的测定>
在头颈癌样本中，被检出MAGE 1-6的样本中MAGE的各亚型 和MAGE 1-6被测定。通过以序列号3/4为引物的RT-PCR和使用具 有MAGE特异性的序列号5引物的嵌套式PCR，测定MAGE的各亚 型，使用序列号3/4及序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定 MAGE 1-6。各亚型的测定方法的效率比MAGE 1-6的检出方法低(图 6)。
实施例12
<其他癌组织和腹腔及尿细胞中的MAGE 1-6测定>
测定了其他癌组织和腹腔及尿细胞中的MAGE 1-6。使用序列号 3/4及序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定MAGE 1-6。测定 的对象是甲状腺癌(A)、淋巴瘤(B)、囊腺瘤(C)、肉瘤(D)、 皮肤纤维肉瘤(E)、恶性混合瘤(F)、胃癌患者的腹腔细胞(G)、 膀胱癌患者的尿(H)、其他患者的尿(I)。(图7，图7中M为尺 寸标记，-是没有加入cDNA的PCR结果)。
在甲状腺癌中没有检出MAGE 1-6，但在其他癌和胃癌患者的腹 腔细胞及膀胱癌患者的尿细胞中，检出了多种MAGE。
实施例13
<癌细胞系、癌组织及尿细胞中的GAGE测定>
以14种各种癌细胞系为对象，测定了GAGE 1-8。通过使用序列 号7/8的RT-PCR或PCR及使用序列号9/10的嵌套式PCR测定了 GAGE 1-8。
不进行逆转录反应进行PCR及嵌套式PCR时，全部没有检出 GAGE，逆转录后进行PCR及嵌套式PCR时，在14个反应中有13 个呈阳性(92.9％)(图8)。在胃癌中80％呈阳性，乳腺癌中为85.7 ％，膀胱癌的尿细胞中为55.6％，没有患癌症的患者的尿中没有一例 呈现阳性反应(图9)。
实施例14
<肺癌组织和痰中的MAGE测定>
以肺癌组织8例、肺癌患者的痰14例、没患肺癌的住院患者的 痰16例为对象，测定了MAGE 1-6。使用序列号3/4及序列号5/6实 施RT-PCR及嵌套式PCR，进行测定。肺癌组织8例中的7例、肺癌 患者的痰14例中的4例中检出了MAGE 1-6，没患肺癌的住院患者的 痰16例中全部没有检出MAGE(图10)。
实施例15
<血液中的MAGE测定>
以癌患者血液20例和正常血液15例为对象，测定了MAGE。使 用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，进行测定。 癌患者血液20例中的3例中检出了MAGE 1-6，在正常人的血液中全 部没有检出MAGE(图11，图11中+为在正常人的血液5ml中添加 了5个SNU484细胞(MAGE 1-6阳性细胞)的样品)。
以上根据本发明的适当实施形式进行了说明，但在不脱离本发明 权利要求的范围的情况下，实验者可以进行多种改变。 发明效果
同时检出从MAGE-1至MAGE-6的引物序列号3/4和序列号5/6、 同时检出从GAGE-1至GAGE-8的序列号7/8、序列号9/10与分别测 定各亚型的方法相比，可以用作特异性及癌诊断率高的癌诊断剂。
另外，它们不仅由于在各种正常细胞及阳性肿瘤中均不呈现阳性 而具有非常高的癌诊断特异性，而且通过使用这些共同引物也可以检 出尿细胞中的MAGE，因此其也可以用作以非组织的非侵入性试样为 对象的癌诊断剂。另外，通过同时测定MAGE或GAGE的多种亚型， 本发明可以减少时间及花费。
参考文献
1)Li J，Yang Y，Fujie Y，Tanaka F，Mimori K，Haraguchi M，Ueo H， Mori M，Akiyoshi T.“人类胃癌中MAGE基因家族的表达”(Expression of the MAGE gene family in human gastric carcinoma)，抗癌研究 (Anticancer Res.)17：3559-3563，1997.
2)Inoue H，Li J，Honda M.“胃癌中MAGE-1 mRNA表达” (MAGE-1 mRNA expression in gastric carcinoma)，胃肠病学 (Gastroenterol)109：1522-1525，1995.
3)Inoue H，Mori M，Honda M.“常用于表达MAGE基因的肿瘤 排斥抗原的人类食道癌”(Human esophageal carcinomas frequently express the tumor-rejection antigens of MAGE genes)，国际癌杂志(Int J Cancer)63：523-526，1995.
4)Mori M，Inoue H，Mimori K.“人类结肠直肠癌中MAGE基因 的表达”(Expression of MAGE genes in human colorectal carcinoma)， 外科学年鉴(Ann Surg)224：183-188，1996.
5)Weynants P，Lethe B，Brasseur F，Marchand M，Boon T.“由非 小细胞肺癌表达MAGE基因”(Expression of MAGE genes by non-small celllung carcinomas)，Int J Cancer 56：826-829，1994.
6)Russo M，Traversari C，Verrecchia A.“原发性和转移性人类乳 腺癌中MAGE基因家族的表达：肿瘤特异性免疫疗法的暗示” (Expres sion of MAGE gene family in primary and metastatic human breast cancer：implications for tumor-specific immunotherapy)，Int J Cancer 64：216-221，1995.
7)Fujie T，Mori M，Ueo H，Sugimachi K，Akiyoshi T.“日本乳腺 癌中MAGE和BAGE基因的表达”(Expression of MAGE and BAGE genes in Japanese breast cancer)，肿瘤学年鉴(Ann Oncol)8：369- 372，1997.
8)Yamashita N，Ishibashi H，Hayashida K，Kudo J，Takenaka K，Itoh K，Niho Y.“肝细胞癌中MAGE-1基因表达的高频率”(High frequency of the MAGE-1 gene expression in hepatocellular carcinoma)，肝脏病 学(Hepatology)24：1437-1440，1996.
9)Shichijo S，Tsunosue R，Masuoka K，Natori H，Tamai M，Miyajima J，Sagawa K，Itoh K.“人类淋巴细胞性白血病中MAGE基因家族的表 达”(Expression of the MAGE gene family in human lymphocytic leukemia)，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)41： 90-103，1995.
10)Corrias MV，Scaruffi P，Occhino M，De Bernardi B，Tonini GP， Pistoia V.“成神经细胞瘤中MAGE-1、MAGE-3和MART-1基因的表 达”(Expression of MAGE-1，MAGE-3 and MART-1 genes in neuroblastoma)，Int J Cancer 69：403-407，1995.
11)Russo V，Dalerba P，Ricci A，Bonazzi C，Leone BE，Mangioni C， Allavena P，Bordignon C，Traversari C.“新鲜上皮卵巢癌中MAGE、 BAGE和GAGE基因的表达”(MAGE，BAGE and GAGE genes expression in fresh epithelial ovarian carcinomas)，Int J Cancer 67： 457-460，1996.
12)Van den Eynde B，Peeters O，DeBacker B，Gaugler S，Lucas， Boon T.“由人类黑素瘤上的自体细胞溶解T淋巴细胞识别的抗原用的 新一族基因编码(A new family of genes coding for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human melanoma)，实验医 学杂志(J Exp Med)182：689，1995.
13)パク ジョン ウク、キム イン ホ、 キム ュ サ： MAGE等型或GAGE等型的DNA及蛋白质同质性(MAGE isotypesま たはGAGE isotypes の DNA及び蛋白質同質性)，启明大论文集(啓 明大論文集)18：475-483，1999.
14)イム ハク、ュン ス ジョン、パク ジョン ウク： 肾小球膜细胞中脂多糖衍生的趋化因子基因表达(メサンジウム細胞 でlipopolysaccharide によつて誘導されゐchemokine遺伝子発现)， 大韩肾脏学会志(大韓腎臓学会誌)18：847-855，1999.
15)Mori M，Mimori K，Tanaka F，Ueo H，Sugimachi K，Akiyoshi T. “使用MAGE基因分析对循环癌细胞的分子诊断”(Molecular Diagnosis of circulating cancer cells using MAGE gene assay)，JAMA 278：476-477，1997. 序列表 <110>朴钟旭(PARK，Jong Wook)；株式会社iC&G(iC&G Co.，LTd.) <120>癌诊断用的多MAGE或多GAGE等型识别引物的开发(Development of Multi-MAGE or-
GAGE Isotypes Recognizing Primer for Cancer Detection) <130>C1 <160>10 <170>KOPATIN 1.5 <210>1 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型 <400>1 ggtcacaaag gcagaaatgc t 21 <210>2 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型 <400>2 gcccttggac cccacaggaa ctc 23 <210>3 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型 <400>3 ctgaaggaga agatctgcc 19 <210>4 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型 <400>4 ctccaggtag ttttcctgca c 21 <210>5 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型 <400>5 ctgaaggaga agatctgccw gtg 23 <210>6 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型 <400>6 ccagcatttc tgcctttgtg a 21 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向GAGE1-6的引物；有义引物型 <400>7 agttggcgag gaagatcgac 20 <210>8 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向GAGE1-6的引物；反义引物型 <400>8 cttcttttaa cactgtgatt gc 22 <210>9 <211>19 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向GAGE1-6的引物；有义引物型 <400>9 agcctcctga artgattgg 19 <210>10 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>靶向GAGE1-6的引物；反义引物型 <400>10 gcgttttcac ctcctctgga t 21
