本发明涉及经修饰的膜破裂性肽。本发明还涉及含有所述经修饰 的膜破裂性肽的传递复合物和该传递复合物的应用。 在基因治疗的领域中需要可以用来有效转染细胞的简单非病毒基 因传递剂。阳离子型肽通过静电作用与DNA缩合并且已被用于制备 简单和可复制的肽：DNA制剂。其制备和提纯方法业已被广泛报导。 阳离子型肽还被作为化学锚用于其他肽类或非肽类实体的引入，以协 助经包装的基因从细胞外位置向预期靶细胞核的通过。 数组科研人员证实，当采用阳离子型肽作为体外传递剂时，只有 在被认为通过提高基因进行转运从而脱离胞内囊泡的能力而起作用的 外源性试剂的存在下转染才是最理想的，所述囊泡在细胞摄取过程中 或摄取后包封基因。外源性试剂的实例是氯喹或膜破裂性肽。可以确 信生物膜的去稳定化是这些试剂作用的核心。任何对于传递复合物的 通过来说成为屏障的膜的结构的破裂将增强其到达核的能力。然而， 有理由假设对于许多体内应用而言，除使制剂复杂化之外，外源性试 剂如小有机分子氯喹的使用将受到小分子和大分子之间建立的不同的 体内清除机制以及扩散速率的阻碍。融合或膜破裂性肽如Wagner (Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)或Smith(国际专利申请WO 97/35070)所述的那些可以锚合复合物形成之前的缩合结构，或锚合预 形成的肽：DNA复合物，但这也是复杂的制剂制备过程。此外，此类 肽在促进基因转移方面显示出比腺病毒低下的有效性(Gottschalk等， Gene Therapy，3,448-457，1996；Wagner等，PNAS，89，7934-8，1992)， 因此研究工作仍在继续寻找更加有效的肽。 能够缩合DNA并破裂生物膜的肽将简化制剂，并且可以产生更 有效的转染。 蜂毒肽是一种公认的膜破裂性肽；但是，虽然其成为一种研究最 广泛的肽序列，但只有两个实例描述了其在基因传递中的应用。首先， 是以与蜂毒肽连接的二油酰基磷脂酰乙醇胺-N-[3-(2-吡啶基二硫基)丙 酸盐](一种DOPE衍生物)的形式(Legendre等，Bioconjugate Chem.， 8,57-63，1997)，其次公开在美国专利US-A-5,547,932中。在Legendre 等的描述中，脂质的偶联是一个昂贵和复杂的步骤，而且报导了DOPE 体内应用所存在的问题。在美国专利US-A-5,547,932中公开了与核酸 结合剂连接的内体分解(endosomolytic)试剂的制剂。所述制剂形成相 对无效的转染制剂，其也可能对被转染细胞产生毒性。事实上，蜂毒 肽的毒性可以用来解释为什么它至今无法作为单独的肽成功地应用于 非病毒制剂中。 本发明提供一种经修饰的膜破裂性肽，其中膜破裂性肽被修饰成 共价连接的多聚体。 优选经修饰的膜破裂性肽进一步修饰成基本上连续的α螺旋。 现在发现，通过经修饰的膜破裂性肽使其形成多聚体并优选使其 形成基本上连续的α螺旋，肽的毒性可以被降低，而且当用于向细胞 传递核酸时，该肽产生增高了的转染水平。 不受任何理论的约束，建议膜破裂性肽必须采取单体的形式以便 能够插入膜中，在其中聚集形成管孔。管孔的形成肯定对细胞具有毒 性，因为它增强了被动的离子通透性。肽的多聚化阻止了单体的形成， 由此防止管孔形成且降低细胞毒性。多聚体由于非极性两亲性α螺旋 占优势而仍然保留了一些膜破裂特性。肽通过修饰可以获得基本上连 续的α螺旋；由于基本上连续的α螺旋可以实现与细胞膜的相互作用， 因此提高了肽的膜破裂特性。肽的多聚化也具有优越性，使肽无法从 任何结合的核酸上解离下来。 术语“膜破裂性肽”是指能够促进膜破裂并降低分子横贯膜所需要 的能量的肽。利用试验如红细胞溶解试验可以测定出一种肽是否是膜 破裂性肽；然而，不同的膜破裂性肽具有不同的细胞特异性，其可以 溶解不同于红细胞的细胞。因此，在溶胞试验中应采用其他细胞种类 来测定一种肽是否是膜破裂性肽。膜破裂性肽优选是一种毒性膜破裂 性肽。进一步优选膜破裂性肽是通过将其自身以单体的形式向膜内插 入来产生毒性。更加优选膜破裂性肽是毒性α螺旋膜破裂性肽，例如 蜂毒肽、杀菌肽A、杀菌肽P1、杀菌肽D、爪蟾抗菌肽2、铃蟾抗菌 肽(bombolittin)类或pardaxin(Saberwal等，Biochimica et Biophysica Acta， 1197，109-131，1994)。优选膜破裂性肽构成一种两亲性α螺旋，该螺旋 具有一个富集阳离子残基且能够缩合DNA的面，和一个能够与膜脂 质相互作用的疏水面。另外，优选膜破裂性肽含有α螺旋区域和位于 肽的C末端的碱性区域，该碱性区域可以与核酸缩合。优选膜破裂性 肽不是人体杀菌/渗透性增强蛋白(BPI)(Gray等，J.Biol.Chem.，264， 9505，1989和美国专利US-A-5,856,302)。优选膜破裂性肽是蜂毒肽。 在此所用的术语“肽”是指具有10至150个氨基酸链长的氨基酸 的聚合物。该术语不是指或不包括肽的修饰，例如糖基化、乙酰化和 磷酸化。该定义包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨 基酸)的肽，具有取代键以及其他所属领域已知的修饰的肽，包括天然 或合成的。 术语“修饰成多聚体”是指修饰膜破裂性肽使其共价连接一种或多 种其他膜破裂性肽。优选该多聚体是二聚体、三聚体或四聚体，更优 选是二聚体和四聚体，首选二聚体。形成多聚体的膜破裂性肽可以相 同或不同。 膜破裂性肽可以沿肽的长度在任何位点连接在一起；然而，优选 肽在各个肽的N末端和/或C末端连接在一起，最优选肽在各个肽的 N末端连接在一起。 优选地，通过用能够经二硫键或连接基团与另一种经修饰的膜破 裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换膜破裂性肽的氨基酸， 可以使膜破裂性肽修饰成二聚体。另外，经二硫键或经连接基团直接 形成共价键的氨基酸可以增加于膜破裂性肽中。优选增加的或替换肽 氨基酸的氨基酸为半胱氨酸，其可以与另一种肽的半胱氨酸残基形成 二硫键。形成二聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形成二聚 体的肽相同。 优选地，通过用两个或多个能够经二硫键或经连接基团与其他经 修饰的膜破裂性肽的氨基酸直接形成共价键的氨基酸替换两个或多个 氨基酸，可以使膜破裂性肽修饰成三聚体或四聚体。另外，可以将两 个或多个能够直接或经连接基团形成二硫键的氨基酸增加在膜破裂性 肽中。形成三聚体或四聚体的膜破裂性肽不一定相同；然而，优选形 成三聚体或四聚体的肽相同。 膜破裂性肽可以经连接体如市售连接体相连在一起，所述连接体 包括双马来酰亚胺或双乙烯基砜连接体。 术语“基本上连续的α螺旋”是指形成α螺旋并且不含有一个或多个 破坏该α螺旋形成的氨基酸的膜破裂性肽的区域。优选该基本上连续 的α螺旋在长度上至少为10个氨基酸。优选所述的基本上连续的α螺 旋占该经修饰的膜破裂性肽长度的至少5％，更优选占该经修饰的膜 破裂性肽长度的40％-90％，最优选占该经修饰的膜破裂性肽长度的 约80％。利用标准圆二色分析法可以很容易地测定出肽中α螺旋的存 在。 可以破坏α螺旋形成的氨基酸包括脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苏 氨酸和丝氨酸。然而，所属领域技术人员理解，氨基酸破坏α螺旋的 能力依赖于肽的整体序列和其他因素，例如肽折叠的溶液的pH。 优选的可以破坏α螺旋形成的氨基酸是脯氨酸。 优选膜破裂性肽通过用不破坏α螺旋形成的氨基酸来替换破坏α 螺旋形成的氨基酸而修饰成基本上连续的α螺旋。 在一个优选实施方式中，本发明的经修饰的膜破裂性肽具有氨基 酸序列CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ。进一步优选经修饰的 膜破裂性肽经在N末端半胱氨酸氨基酸之间的二硫键直接形成二聚 体。 通过加入其他官能团，例如脂质、靶向基团(如使肽以特定细胞 种类为靶向的抗体或抗体片段)、抗原肽、糖和中性亲水性聚合物(如 PEG和PVP)，可以进一步修饰本发明的经修饰的膜破裂性肽。适合 增加在本发明的经修饰的膜破裂性肽中的官能团公开在国际专利申请 WO 96/41606中，并且也公开了使此类基团连接在肽上的方法。 优选地，通过将氨基酸添加在肽的基本上连续的α螺旋区域，可 以进一步修饰本发明的经修饰的膜破裂性肽，其中附加氨基酸延伸了 基本上连续的α螺旋区域的长度。优选该基本上连续的α螺旋区域延伸 至该α螺旋区域在长度上至少为10个氨基酸，更优选至少20个氨基 酸。 优选通过将碱性氨基酸增加在肽的C末端区域使本发明的经修饰 的膜破裂性肽得到进一步修饰。 本发明的经修饰的膜破裂性肽的C末端区域是指从C末端氨基 醮延伸至形成基本上连续的α螺旋区的区域。 碱性氨基酸为所属领域技术人员熟知，其中包括赖氨酸、精氨酸 和组氨酸。优选通过增加1-50个碱性氨基酸、更优选5-15个碱性氨 基酸来修饰C末端区域。 本发明还提供了本发明的经修饰的膜破裂性肽的功能同系物。 优选的本发明经修饰的膜破裂性肽的功能同系物是那些仍然保留 其活性并对本发明的肽来说具有优选至少80％、更优选90％和首选95％ 的同源性的同系物。这些优选的含有本发明肽的片段的功能同系物只 在1-10个氨基酸上不同。进一步优选这种氨基酸变化是保守性的。保 守性变化是指那些用侧链相关的氨基酸种类中的一个替换另一个氨基 酸的变化。譬如，有理由认为，亮氨酸用异亮氨酸或缬氨酸、天门冬 氨酸用谷氨酸、苏氨酸用丝氨酸孤立替换，或用结构上相关的氨基酸 进行氨基酸的相似保守性替换，将对肽的生物活性没有严重影响。 然而，有时希望通过改变氨基酸来改变肽的生物活性。譬如，消 除或提高肽的一种或多种功能的突变特别有用。这种突变一般可以通 过改变肽的任何保守序列来实现。优选此类同系物具有与本发明的蛋 白质或其片段至少80％、更优选90％和最优选95％的同源性。此类改 变了的蛋白质或其片段适宜在1-10个氨基酸上不同。 本发明还提供本发明的经修饰的膜破裂性肽在将核酸传递至细胞 的传递复合物中的应用。 本发明的经修饰的膜破裂性肽可以用于将带负电荷的聚合物，优 选核酸，传递至任何细胞种类。优选的细胞种类包括：原核细胞如大 肠杆菌(E.coli)；和真核细胞，例如哺乳动物细胞，包括离体初级细胞， 如HUVEC和DC细胞；哺乳动物细胞系，包括HeLa、HepG2、CHO 和骨髓瘤细胞系；和低等真核细胞，如酵母。优选利用本发明的经修 饰的膜破裂性肽将核酸传递至哺乳动物细胞。 本发明还提供含有本发明的膜破裂性肽和核酸的传递复合物。 优选所述传递复合物由被传递核酸和本发明的经修饰的膜破裂性 肽组成。 本发明的传递复合物可以是含有被传递核酸和本发明的经修饰的 膜破裂性肽的任何传递复合物。 所属领域技术人员熟知多种向细胞传递核酸的传递复合物。由病 毒包膜蛋白质的氨基酸序列衍生的肽业已在与聚赖氨酸DNA复合物 联合给药时用于基因转移(Plant等，1994，J.Biol.Chem.269：12918-24)； Trubetskoy等，1992，Bioconiugate Chem.，3：323-327；Mack等，1994，Am. J.Med.Sci.307：138-143)提出，聚赖氨酸偶联物与阳离子型脂质的 共缩合可以改进基因转移的效率。WO 95/02698公开了病毒成分在尝 试提高阳离子型脂质基因转移的效率中的应用。 在一个优选实施方式中，本发明的传递复合物含有经修饰的膜破 裂性肽和包封在毫微-或微-颗粒如聚交酯乙交酯和脂质体等中的核 酸。 在另一优选实施方式中，本发明的传递复合物含有核酸、核酸缩 合肽和本发明的经修饰的膜破裂性肽。 核酸缩合肽可以是任何能够缩合核酸的肽，包括聚赖氨酸和组蛋 白衍生的肽。优选的核酸缩合肽公开在国际专利申请WO 96/41606和 WO 98/35984中。 优选通过核酸缩合肽缩合核酸生成缩合的核酸复合物得到所述的 传递复合物。随后，该缩合的核酸复合物用本发明的经修饰的膜破裂 性肽包被。 本发明提供一种本发明传递复合物的方法，包括： 1.使核酸与核酸缩合肽缩合形成缩合的核酸复合物；和 2.该缩合的核酸复合物用本发明的经修饰的膜破裂性肽包被。 现在发现，转染过程中血清的存在可以提高转染的水平。优选的 血清是胎牛血清。所属领域熟知其他可使用的适宜血清，其中包括正 常人血清和正常小鼠血清。 本发明的经修饰的膜破裂性肽可以在体内、体外和离体处理中用 于向细胞传递治疗性核酸。核酸在不同疾病中的治疗用途为该领域技 术人员所熟知。 传递给细胞的治疗性核酸可以是任何形式的DNA或RNA载体， 包括质粒、直链核酸分子、核酶和脱氧核酶以及附加型载体。业已在 将质粒DNA注射到肌肉(Wolff J.A.等.，1990，Science，247：1465-1468； Carson D.A.等，美国专利No.5,580,859)、甲状腺(Sykes等.，1994， Human Gene Ther.，5：837-844)、黑色素瘤(Vile等，1993，Cancer Res.， 53：962-967)、皮肤(Hengge等，1995，Nature Genet.，10：161-166)、肝脏 (Hickman等，1994，Human Gene Therapy，5：1477-1483)中之后和与气道 上皮接触之后(Meyer et al.，1995，Gene Therapy.2：450-460)观察到异 源基因的表达。 有效的治疗性核酸序列包括那些编码受体、酶、配体、调节因子 和结构蛋白的核酸序列。治疗性核酸序列还包括编码核蛋白、细胞质 蛋白、线粒体蛋白、分泌性蛋白、细胞质膜相关性蛋白、血清蛋白、 病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原和寄生虫抗原的序列。适用于本 发明的治疗性核酸序列还包括编码蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白和 核酸(例如，RNA如核酶或反义核酸)的序列。由核酸编码的蛋白或多 肽包括激素、生长因子、神经递质、酶、凝血因子、载脂蛋白、受体、 药物、癌基因、肿瘤抗原、肿瘤抑制剂、结构蛋白、病毒抗原、寄生 虫抗原和细菌抗原。这些化合物的具体实例包括胰岛素原、生长激素、 肌营养不良蛋白、雄激素受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长 因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、上皮生长因子TGF-α、TGF-β、 PDGF、血管生成因子(酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生 长因子和血管生成素)、基质蛋白(IV型胶原、VII胶原、层粘连蛋白)、 苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、癌基因(ras，fos，myc，erb，src，sis， jun)、E6或E7转化序列、p53蛋白、Rb基因产物、细胞因子(例如IL-1， IL-6，IL-8)或其受体、病毒壳体蛋白，和来自病毒、细菌和寄生虫生物 的可以用来诱导免疫反应的蛋白，以及在机体中具有有益重要性的蛋 白。可以掺入的化合物仅仅受到核酸序列对被掺入蛋白或多肽的适用 性的限制。所属领域技术人员应很容易理解，由于鉴定出了更多的蛋 白和多肽，所以可以将它们整合在所选择的传递复合物中，利用本发 明的经修饰的膜破裂性肽转染并且表达。 利用本发明的经修饰的膜破裂性肽传递的核酸包括那些编码患者 可能缺乏的蛋白质的核酸，或临床上在高于正常的浓度下有效的核 酸，以及那些被设计用来消除不需要蛋白的翻译的核酸。用于消除有 害蛋白的核酸是反义RNA和核酶，以及编码它们的DNA表达构建体。 锤头类的核酶是最小的已知核酶，其自身提供给体外合成和传递 给细胞(Sullivan概述，1994，J.Invest.Dermatol.，103：85S-98S；Usman 等，1996，Curr.Opin.Struct.Biol.，6：527-533)。 本发明还提供用于治疗的本发明的经修饰的膜破裂性肽或传递复 合物。 本发明进一步提供本发明的经修饰的膜破裂性肽或传递复合物在 制备遗传疾病治疗用药物中的应用。 遗传疾病被定义为可以在遗传水平上治疗的疾病，即通过给需要 此类治疗的患者施用核酸进行治疗。遗传疾病包括但不限于：酶缺失(例 如肝脏、消化系统、皮肤和神经系统的那些酶)、内分泌缺乏(例如缺 少生长激素、生殖激素、血管活性激素和流体静力压激素)、外分泌缺 乏(例如胰腺激素分泌的缺乏)、神经变性疾病(例如阿耳茨海默氏病、 肌萎缩性侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、泰-萨二氏病等)、癌症、肌肉 营养不良和白化病。 本发明还提供一种治疗遗传疾病的方法，该方法包括给需要此类 治疗的患者施用有效量的含有治疗性核酸和本发明的经修饰的膜破裂 性肽的传递复合物。 本发明现在以所附的实施例、参考下列附图进行举例说明。 图1表示CP36二聚体(CP36D)、CP36单体(CP36M)和蜂毒肽(CP1) 的红细胞溶解活性。 图2表示CP36和CP48的红细胞溶解活性。 图3表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在下， 当用在不同电荷比例下复合的CP12、18、36、39、41、42、43、44、 45和48转染时HepG2细胞的转染。 图4表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在下， 当用在不同电荷比例下复合的CP12、18、36、39、41、42、43、44、 45和48转染时HepG2细胞的蛋白水平。蛋白水平的降低是对细胞产 生毒性作用的指征。 图5表示在DTT存在或不存在下和在10％胎牛血清的存在或不 存在下，用与CP36/1(第一批)、CP36/1.2(第二批)复合的pCMVβ对 HepG2细胞的转染。命名Red是指还原形式，即在5mM DTT的存在 下；NR是指非还原形式，即没有加入DTT。 图6表示从比较HUVEC的萤光素酶表达的试验获得的数据，其 中HUVEC用在四种电荷比例下的CP36复合DNA转染，CP36为不 同批次的CP36肽。肽的批次是指不同的合成，它们被称作CP36/1、/3、 /4、/5、/6。 图7表示多个比较HUVEC的平均萤光素酶表达的试验的汇编(括 号中表示试验的编号)，其中HUVEC用不同电荷比例或N∶P比例的 CP36复合DNA和PEI复合DNA转染，所用PEI为22kDa的线性 PEI(Exgen-500)。 图8表示比较来自HUVEC的表达GFP的细胞平均百分率的试验 的编译(括号中表示试验的编号)，其中HUVEC用不同电荷比例或N∶P 比例的CP36复合DNA和PEI复合DNA转染，所用PEI为22kDa的 线性PEI(Exgen-500)。 图9表示利用不同的肽给予75μg DNA后萤光素酶在多种组织中 的体内表达。 图10表示HUVEC的平均萤光素酶表达，其中HUVEC用被CP36 二聚体包被的NBC28：DNA颗粒转染。 实施例 材料和方法 肽的合成和纯化 方法1：多肽合成仪(MPS) 在P.E.Biosystems Pioneer肽合成仪上运行1.7版的设备软件来合 成肽。该仪器安装了一个与柱位2相连的单一MPS部件，其由运行 1.3版软件的工作站控制。 各个合成是以0.05mmol的规模、利用Fmoc-PAL-PEG-PS树脂(P.E. Biosystems)进行。合成中采用由该仪器提供的延伸、缓慢活化和偶联 循环。利用含20％哌啶的DMF溶液进行脱保护。下列氨基酸衍生物 在适宜时用于肽中：Fmoc-L-Ala-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Cys (Trt)-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L- Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Nle-OH，Fmoc-L-Pro-OH，Fmoc- L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH，Fmoc-L- Val-OH，Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH。利用TBTU和DIPEA实现氨基酸的 活化。在合成最后步骤中，脱除Fmoc基，此后溶剂更换为二氯甲烷， 在干燥氮气流下干燥树脂。取出含有树脂的柱子并且进一步在真空和 室温下干燥2-3小时。 用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)95∶2.5∶2.5从树脂上裂 解下不含半胱氨酸残基的肽，用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷 (TIS)/乙二硫醇(EDT)92.5∶2.5∶2.5∶2.5裂解下那些含有半胱氨酸残基的 肽。将一个空的5ml注射器与各个柱子的一端相连，并且将一个含有 裂解混合物的2.5ml注射器连接在柱子的另一端。将裂解混合物(1ml) 注射到各个柱上，令它们静置30分钟，随后再注射1ml，30分钟后 注射最后的0.5ml。静置30分钟后，取下空的2.5ml注射器，将剩余 的裂解混合物抽入5ml注射器内。从5ml注射器上取下柱子，倒置并 更换，此后将含有裂解混合物的新的2.5ml注射器连接在另一末端， 重复裂解过程。将5ml注射器的内容物排出到含有乙醚(45ml)的50ml 离心管中。令所得沉淀在室温下静置1-2小时，倾出上清液。剩余的 乙醚在干燥氮气流下吹除，沉淀块进一步在真空下干燥2-3小时。 方法2：肽的连续流动合成 在P.E.Biosystems Pioneer肽合成仪上运行1.7版的设备软件来合 成肽。该仪器安装了一个与柱位2相连的单一MPS部件，其由运行 1.3版软件的工作站控制。 各个合成是以0.2mmol的规模、利用Fmoc-PAL-PEG-PS树脂 (P.E.Biosystems)进行。为了偶联除半胱氨酸之外的所有氨基酸，采用 仪器所提供的延伸偶联循环。为了偶联半胱氨酸，采用一个特殊的延 伸(1小时偶联时间)溶剂交换循环，使偶联在DMF/DCM1∶1中进行。 采用含20％哌啶的DMF溶液进行脱保护。下列氨基酸衍生物在适宜 时用于肽中：Fmoc-L-A1a-OH，Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-L-Cys (Trt)-OH，Fmoc-L-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-L-His(Trt)-OH， Fmoc-L-Ile-OH，Fmoc-L-Leu-OH，Fmoc-L-Lys(Boc)-OH，Fmoc-L-Pro- OH，Fmoc-L-Ser(tBu)-OH，Fmoc-L-Thr(tBu)-OH，Fmoc-L-Trp(Boc)-OH， Fmoc-L-Val-OH，Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH。利用TBTU和DIPEA在DMF 中活化除半胱氨酸之外的氨基酸。利用存在于DMF中的TBTU和存 在于DCM中的均三甲基吡啶活化半胱氨酸。在合成最后步骤中，脱 除Fmoc基团，随后溶剂更换为二氯甲烷，并且在干燥氮气流下干燥 树脂。把柱子中的树脂冲洗到过滤漏斗中，使其风干数分钟，转移到 预称重烧瓶内，在真空下进一步干燥直至获得恒定重量。 室温下1.5小时用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS) 95∶2.5∶2.5(20ml)从树脂上裂解下不含半胱氨酸残基的肽，室温下1.5 小时用三氟乙酸(TFA)/水/三异丙基甲硅烷(TIS)/乙二硫醇(EDT) 92.5∶2.5∶2.5∶2.5(20ml)裂解下那些含有半胱氨酸残基的肽。在各种情况 中，随后滤出树脂，用纯的TFA(3×5ml)洗涤，合并的滤液和洗涤液蒸 发至体积减小至约3ml。残余物转移到含有乙醚(45ml)的50ml离心管 内。室温下令所得沉淀静置1-2小时，倾除上清液。。剩余的乙醚在 干燥氮气流下吹除，沉淀块进一步在真空下干燥2-3小时。 肽的纯化 利用反相HPLC纯化肽。较高极性的肽在Shandon Hypersil SAS 柱(120，10μ，150×21.2mm)上利用水(0.1％TFA)乙腈(0.1％TFA)的梯度 纯化，一般为20分钟内水中10-65％乙腈的梯度，流速为24ml/分钟， 或在Phenomenex Jupiter C4柱(120，5μ，250×10mm)上利用水(0.1％ TFA)乙腈(0.1％TFA)的梯度纯化，一般在30分钟内水中30-100％乙 腈的梯度，流速为6ml/分钟。 根据飞行质谱的基质辅助激光解吸附/电离时间(matrix assisted lazer desorption/ionisation time of flight mass spectrometry)(MALDI-TOF MS)和HPLC的测定，将含有感兴趣肽的级份合并且冷冻干燥。 肽多聚体形成 为了完成经二硫键或半胱氨酸键二聚合或低聚合，将纯的肽溶于 新制的20mM碳酸氢铵中，室温下放置16小时。通过分析凝胶过滤 色谱、利用Pharmacia Superdex Peptide HR 10/30柱、用存在于含 0.1％TFA的水中的20％乙腈洗脱、以0.8-1.0ml/分钟的流速证实了二 聚合。通过监测洗脱液在214nm的吸光度证实了二聚合肽的洗脱时间 减小。 为了合成双乙烯基砜连接的偶联物(CP48)，将2.0mg Biolink 6 (Molecular Biosciences，Colerodo)溶于100μl乙腈，用25mM HEPES， pH7.2使体积达到1.0ml。随后将200μl的该溶液加入15mg溶于800μl 缓冲液中的CP36单体(5.2μmol)。该反应通过MALDI和RP-HPLC监 测，并且在24℃下1小时后判断反应完全。用Phenomenex Jupiter C4 半制备柱在30分钟内在含0.1％TFA的水中乙腈由30增高至100％的 梯度纯化可以分离出终产物。终产物的质谱由MALDI-TOF MS证实。 红细胞溶解试验 向9.0ml血液中加入1.0ml 110mM柠檬酸盐(pH5)阻止凝固。血 液在2000rpm下旋转5分钟。抽出血浆上清液，并且通过连续混合、 离心和抽吸用HBS洗涤沉淀团至少6次。抽吸澄清的上清液，沉淀团 用适当的缓冲液洗涤2次：或HBS(pH 7.4)或15mM乙酸钠pH5，150mM NaCl。将适当的缓冲液加入血液沉淀团中使总体积为6ml，从该储备 制剂中取1ml，用缓冲液稀释15倍，得到最终的工作溶液。在96孔 平板中一式三份，通过把75ml存在于适当缓冲液中的血液溶液加入 100ml存在于相应缓冲液内的肽溶液中并混合，可以测试连续稀释的 肽。血液和肽在37℃下温育1小时。在这个阶段中，向不含有肽的血 液溶液内加入1％Triton X-100用作100％溶解的对照。细胞在2500rpm 下离心5分钟，取80ml上清液用于在450nm下分光光度分析。 复合物的制备 以40μg/ml存在于HBS(HEPES缓冲盐水)(pH7.4)中的质粒DNA 迅速与等体积的存在于HBS中的适当浓度的转染剂混合，令其在室温 下温育1小时。对于肽利用最终预期电荷比例，或对于PEI(Exgen-500， Euromedex，France)利用氮(产自PEI)：磷酸(产自DNA)的最终预期比 例，可以测定出转染剂的浓度，按照Felgner等(1997)(合成基因传递 体系的命名法，Gene Therapy，(1997)8：511-512)的定义计算电荷比例。 HepG2转染试验 1.β-Gal转染方案 在转染前一天将HepG2以5×104个细胞/孔铺板在96孔板中的 DMEM+10％FCS(含有抗生素)内，并且在37℃下培育。次日，细胞用 100μl/孔PBS洗涤。把含有10％FCS和抗生素的90μl HEPES缓冲RPMI 加入细胞，随后加入10μl转染复合物，其按照上述方法制备并含有 质粒pCMVβ受体质粒(编码β-半乳糖苷酶的质粒)。复合物在5mM DTT 存在或不存在下配制用于还原所有肽的二硫键。利用有关对照，证实 制剂中本身存在的DTT对于转染没有观测得到的影响。用各种复合物 一式三份转染细胞。该细胞在1100rpm下离心，随后在潮湿条件下于 非通气培育箱中37℃下培育5小时。5小时后，除去转染培养基，细 胞用100μl/孔PBS洗涤，随后在DMEM/10％FCS(含有抗生素)培养 基中、于CO2通气培育箱中培育19-20小时。最后，细胞用PBS洗涤 2次，用30ml 0.1％Triton、250mM Tris，pH8溶解，并且在β-gal试验 之前冷冻在-20℃下。 2.β-Gal试验 冷冻的溶解细胞在室温下解冻，从各孔中取10μl用于蛋白试验。 剩余的细胞溶解物通过Galacton-Sstarβ-gal试验(TROPIX)分析β-gal 报告体，并且利用运行SPC模式的96孔TopCount闪烁计数器测量发 光。利用DC蛋白分析试剂盒(BioRad)测定溶解物中总的蛋白含量。 利用在得自相同96孔平板上未转染细胞的细胞溶解物中绘制的β-gal 标准曲线，转染数表达为pgβ-gal/ng总蛋白。 HUVEC转染试验 荧光素酶转染试验 在转染前一天将初级HUVEC(Promocell，Germany)以1×104个细 胞/孔铺板在0.1％明胶包被的96孔平板中含有补充物的内皮生长培养 基中(EGMS)(Promocell，Germany)，并且在37℃下于CO2通气培育箱 内培育。次日，细胞用PBS洗涤。向细胞中加入90μl/孔含10％FCS 和抗生素的培养基M199(Sigma)，随后加入10μl/孔转染复合物，其 用pCMVLuc报告质粒(编码萤火虫荧光素酶的质粒)制成。对于各个 复合物，细胞一式三份转染。该细胞在1100rpm下离心5分钟，随后 在37℃下在CO2-通气培育箱内培育1小时。1小时后，除去转染培养 基，细胞用100μl/孔PBS洗涤，随后在100μl/孔EGMS中于37℃下 在CO2通气培育箱内培育20-24小时。 荧光素酶试验 20-24小时后，采用LucScreen试验(TROPIX)、利用运行SPC模 式的96孔TopCount闪烁计数器(Packard)测量的发光可以测定荧光素 酶的表达。 GFP转染方案 在转染前一天初级HUVEC以1.5×105个细胞/孔接种在6孔平板 中的2ml EGMS中。次日，细胞用2ml/孔PBS洗涤2次，加入1ml/ 孔转染溶液，其组成为：100μl用pCMVEGFP报告质粒(编码绿色荧 光蛋白的质粒)制成的转染复合物并且与900μl含10％FCS和抗生素的 M199混合。对于各种复合物，细胞一式二份转染。该细胞在37℃下 在CO2通气培育箱中培育2小时，此后将培养基重新更换为2ml/孔的 EGMS。细胞在37℃下在CO2通气培育箱中进一步培育24小时。 GFP试验 24小时后，细胞用2ml/孔PBS洗涤，胰蛋白酶消化，用M199 培养基+10％FCS重新悬浮。通过FACS分析测定转染细胞的百分比。 利用肽的pCMVLuc的体内传递 以500μg/ml存在于HBS中的pCMVLuc与等体积(通常为500μl) 的适当浓度的肽或聚赖氨酸(127聚体)(Sigma)混合达到预期的电荷比 例。该电荷比例由等Felgner等(Hum.Gene Ther.，8(5)，511-2，1997)定 义。将3-4秒内将肽或聚赖氨酸加入DNA并且在涡旋搅拌器上以 800rpm混合。复合物在室温下培育1小时。将300μl的复合物注射到 CD-1小鼠的尾静脉。20小时后，处死小鼠，各取出80-200mg的器官， 简单弄干以除去过量液体，在液氮中冷冻并且保存在-80℃下。称量冷 冻的组织，在溶解缓冲液(10mM磷酸钠，含有1mM EDTA、1％Triton X-100、15％甘油、8mM MgCl2、0.5mM PMSF、1mM DTT)中解冻， 用微型珠搅拌器-8(Stratech Ltd)和1mm玻璃珠匀浆0.3-2分钟。取出 匀浆，用溶解缓冲液洗涤玻璃珠，将洗涤液与匀浆合并。通过在 13000rpm下离心5分钟除去微粒，取80μl在Berthold LB593发光计 中用0.1mM荧光素、0.44mM ATP测定荧光素酶的活性，并且采集 时间为4秒。结果表示为RLU，以mg各组织的重量计。 下列肽制备为单体，或可能的话利用上述方法制备为二聚体或其 他多聚体： CP1 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2 CP2 CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-CONH2 CP18 GIGAVLKVLTTGLAALJSWIKRKRQQ-CONH2 CP36 CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP37 GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2 CP39 Nle-IGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP41 CIGAVLKVLTTGLAALISWLKRKRQQ-CONH2 CP42 CIGAVLKVLTTGLAALLSWLKRKRQQ-CONH2 CP43 CIGACLKCLTTGLWALISWLKRKRQQ-CONH2 CP44 CIGAVLKVLTTGLAWLISWLKRKRQQ-CONH2 CP45 CIGAVLKVLTWGLAALISWLKRKRQQ-CONH2 CP-46 NH2-LLQSLLSLLQSLLSLLLQWLKRKRQQ-CONH2 CP-47 NH2-CLLQSLLSLLQSLLSLLLQWLKRKRQQ-CONH2 CP-49 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWTKRKRQQC-CONH2 CP-50 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQC-CONH2 CP-51 NH2-CIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQ-CONH2 CP-52 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2 ｜ NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP-53 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2 ｜ NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP-54 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP-55 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 \ S S \ NH2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2 CP56 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 ｜ S S ｜ NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2 ｜ NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 ｜ S S ｜ NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP-57 NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRCRQQ-CONH2 CP-58 NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 \ S S \ NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQC-CONH2 CP-59 NN2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2 / S S / NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQK-CONH2 ｜ NH2-CIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 \ S S \ NH2-GIGAVLEVLTTGLAALISWLERERQQC-CONH2 CP-60 NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 ｜ NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2 ｜ S S ｜ NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQKC-CONH2 ｜ NH2-GIGAVLKVLTTGLAALISWIKRKRQQ-CONH2 CP1是蜂毒肽，蜜蜂毒液的主要毒性成分。 CP2是CP1(G1至C)。这种肽被设计为形成CP1的由N末端半 胱氨酸连接的二聚体。 CP18是CP1(P14至A)。这种肽被修饰成基本上连续的螺旋。 CP36为CP1(G1至C；P14至A)。修饰这种肽生成二聚体并且具 有基本上连续的螺旋。 CP39为CP36(C1至正亮氨酸)。引入该修饰可以提高N末端的 疏水性。 肽CP41至CP45被设计为用于研究保守氨基酸变化对CP36活性 的影响。 CP37为CP18(I20至L)且所有赖氨酸用谷氨酸替换。 CP41为CP36(I20至L)。 CP42为CP36(I17至L；I20至L)。 CP43为CP36(A14至W；I20至L)。 CP44为CP36(A15至W；I20至L)。 CP45为CP36(T11至W；I20至L)。 CP46是含有保守氨基酸变化并且基于DeGrado等，(1981)，J.Am. Chem.Soc.，103,679-681所述序列的蜂毒肽的功能同系物。 CP47为具有适合二聚体形成的附加N末端半胱氨酸的CP46。 CP49为具有适合多聚体形成的附加C末端半胱氨酸的CP36。 CP50为具有适合多聚体形成的附加C末端半胱氨酸的CP18。 CP51是全部赖氨酸残基被谷氨酸替换的CP41。 CP52是通过附加C末端赖氨酸的双胺修饰而形成的CP36的二 聚体。 CP53为具有附加C末端赖氨酸且半胱氨酸残基与CP36相连的 CP36的二聚体。 CP54为具有内插在20位的LAALISW以增加α螺旋长度的 CP36。 CP55为CP36和CP51的杂二聚体。 CP56是由CP52和2个CP36肽组成的四聚体。 CP57是CP1(K23至C)。 CP58是CP36和CP50的杂二聚体。 CP59是由与两个C37肽相连的CP52的二聚体组成四聚体。 CP60是由CP53的二聚体组成的四聚体。 CP61是由CP36和CP51组成的二聚体，其中二硫键在N末端的 半胱氨酸之间形成。 已经观察到，按照在琼脂糖凝胶上质粒生长减缓的测定，虽然蜂 毒肽(CP1)能够有效地结合DNA，但蜂毒肽：DNA复合物很少或不用 于HepG2细胞的转染，蜂毒肽对细胞产生毒性。细胞与此类复合物一 起培育后，每个孔中的总蛋白减少，同时蜂毒肽对DNA(图4)的比例 增高。这提示了蜂毒素形成多种扰乱生物膜的结构的能力可以引起毒 性作用。有关蜂毒肽的机理的文献提出，虽然这种肽在溶液中在高浓 度和/或高离子强度下以四聚体存在，但它必须能够解离为单体形式， 从而能够插入膜中，在膜中其可以聚集成为成孔四聚体。相信蜂毒肽 的成孔四聚体可以促进被动离子渗透性，并且被认为对细胞有毒性。 据称蜂毒肽的二聚合或四聚合应产生一种细胞毒性低的结构。二聚合 或四聚合有效地防止成孔四聚体形成的启动。蜂毒肽二聚体或四聚体 将具有膜破裂特性，因为非极性两亲性螺旋占优势。可以确定，通过 用能够使螺旋延长的残基替换蜂毒肽14位的使螺旋结构扭结的Pro残 基，可以优化蜂毒肽的两亲性螺旋与膜表面之间的相互作用。 如上所述，构建二聚体，并且通过红细胞溶解试验测定它们的膜 破裂特性。令人惊奇地，虽然二聚体的溶解活性在pH7和5时高于 蜂毒肽(参见图1和2)，二聚体对哺乳动物细胞系的毒性较低(参见图 4)。所以认为，孔的形成有毒性，而其他膜破裂/去稳定化结构是无毒 性的。 具有上述螺旋延伸的蜂毒肽的二聚合得到能够结合DNA的构建 体；所得DNA复合物对于HepG2细胞的损害明显较小，如通过蛋白 含量判断法测定(参见图4)的，并且在外源性试剂的不存在下可以有效 用于多种细胞种类的有效转染(参见图3和5)。还发现，转染过程中胎 牛血清的存在使转染水平增高(参见图5)。 图9表示本发明的肽CP36和CP61可以有效提高DNA对多种体 内组织的转染。 用CP36二聚体包被的传递复合物 该传递复合物制备如下： 1.在电荷比例±4和25μg的DNA浓度下制备NBC28：DNA复合 物：在10mM HEPES pH7.4中制备92.6μg/ml的NBC28溶液和50μg/ml 的pCMVluc DNA溶液。将肽溶液以1∶1(v/v)比例加入DNA溶液中， RT下放置1小时。NBC28是具有氨基酸序列 TKKKKKKKKKKKKKKKKKKYCG的核酸缩合肽。 2.复合物的包被： 将包被肽加入复合物中，随后加入约10mM HEPES缓冲液，使 体积达到预期终体积的97％。将所得复合物涡旋10秒，随后保存在4 ℃下过夜。 3.盐的掺加： 次日清晨(约18小时后)，向复合物中加入5M盐(3％终体积得到 150mM盐)，随后涡旋10秒，RT下继续放置1小时。 4.复合物的重构： 在1.5ml微量离心管(Eppendorf)中使复合物在13000rpm下在MSE Microcentaur离心机内旋转30分钟。取出上清液(75％)，加入等体积 的新制HBS，并缓慢涡旋，用Gilson吸管上下抽吸30秒。 5.复合物的超声 转染之前，复合物在1.5ml微量离心管中在超声浴内超声30秒。 随后按照上述方法将复合物转染到HUVEC细胞内。 图10表示用CP36二聚体包被的复合物得到HUVEC细胞的良好 转染，尤其是，该转染水平高于CP36或NBC28单独使用时获得的转 染水平。