本发明涉及药物残留检测的方法，尤其是关于一种快速检测β2-兴奋 剂的方法。 β2-肾上腺素能兴奋剂(简称β2-兴奋剂)中有一类人工合成激素类 药物，如克伦特罗(Clenbuterol)，Salbutamol等，临床上用于治疗哮喘 和支气管痉挛等疾病，但如提高剂量5-10倍，并长期使用，还有增强肌 肉，减少脂肪的副作用，这一特点使它常被用作为生长促进剂而添加饲 料中，提高家畜的瘦肉率(这些药物俗称瘦肉精)(Biancotto Getal J.Mass Spectrum.34(1999)1346)。这些药物的滥用对消费者健康造成危害。欧盟 96年已禁止β-兴奋剂作为生长促进剂(E.C Directive 96/22/EC of 29/4/1996，Official Journal of the European Communities，No L125/3， 23.5.96.)，我国也已制定法规，上海市政府已承诺让市民吃到“放心肉”。 但利益驱使，兴奋剂在养猪业中已成为泛滥之势。上海等8省市饲料、 养殖等有关行业中违禁品检出率高达19.8％(人民日报2000年6月9日 出版)。因此迫切需要建立准确、快速的检测方法。 国内外现有检测方法较多，较成熟的方法主要有二类：一类为仪器 分析类(Biancotto G，et al.，Mass Spectrum.34(1999)：1346.)，准确灵敏， 但操作烦琐，时间长，耗费人力和物力，成本高，不适于筛选工作；第 二类为免疫分析类，存在假阳性结果的可能，需仪器法确证。以上二类 方法需使用精密仪器，只能实验室操作，无法在现场测试(蔡纯等，现代 商检科技，8(1998)：52)。有报道采用免疫纸片快速检测法(Vanoosthuyze K.E.I.et al，J，Agric.Food.Chem.45(1997)：3129；Ploum M.E，et al.J， Chromatography 564(1991)：413.)，但由于其抗原-抗体结合的免疫学原理 仍存在一些固有的弱点，如抗原-抗体亲和力不高；仍存在假阳性的可能； 一种抗体只能检测一种或具有共同抗原决定簇的几种药物，无法检出所 有β2-兴奋剂等。 本发明的目的是提供一种基于受体-配基结合原理的快速检测β2-兴 奋剂方法。在灵敏度、特异性、耗时等指标上优于现有免疫分析法，适 用于现场快速检测，并适用于所有β2-兴奋剂的检测。 本发明提供一种快速检测β2-兴奋剂的方法，它是基于受体-配基结 合原理，应用细胞化学方法，将β2-受体或含有该受体的细胞固定于固相 基质，加入测试样品及酶标记的β2-兴奋剂作竞争抑制试验，加底物显色 后确定样品中β2-兴奋剂的有无或作定量计算。 本发明方法中采用的材料 (1)固相基质 可分为二类，一类为塑料基质的微孔板，如细胞培养板、酶标板等； 另一类为各种滤膜，如尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等，这些基质都能结 合大分子的蛋白质或细胞。 (2)β2-受体或含有该受体的细胞 β2-受体是一种细胞膜蛋白，可以是重组或天然提取，生理条件下， 它与β2-兴奋剂结合后，通过偶联的G蛋白激活腺苷酸环化酶，由此导 致的第二信使cAMP含量增高，引发细胞一系列生理效应。应用分离纯 化的β2-受体固定于固相基质上，虽已不能引发生理效应，但仍能结合相 应配基。 β2-受体分布于多种类型的细胞(如淋巴细胞、肌肉细胞等)的表 面。采用适当的固定技术，这些细胞表面的β2-受体仍具有对β2-兴奋剂 的结合能力，其功能与上述β2-受体类同。 (3)酶标配基 采用化学交联方法将酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)与配 体β2-兴奋剂(如Clenbuterol或Salbutamol)交联，制得酶标配基，与样 品中的β2-兴奋剂竞争结合β2-受体结合位点，与底物反应后根据显色强 弱可判断结果。 本发明方法用于检测β2-兴奋剂的具体步骤包括： (1)酶标配基的制备 选用酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。 采用过碘酸氧化法或重氮化交联配基(Clenbuterol或Salbutamol) 和辣根过氧化物酶，即可制得辣根过氧化物酶标配基(朱培坤，1983， 免疫学技术，山东科学技术出版社；Yamamoto I，et al.1982 J.Immunoassay 3：155)； 采用戊二醛或disuccinimidyl suberate交联配基(Clenbuterol或 Salbutamol)和碱性磷酸酶，即可制得碱性磷酸酶标配基(朱培坤，1983， 免疫学技术，山东科学技术出版社；Leary J，et al.1983， Pro.Natl.Acid.Sci.USA，80：4045.)。 (2)β2-受体或含有β2-受体的细胞固定化 将β2-受体或含有β2-受体的细胞悬液滴于固定基质上，例如选用尼 龙滤膜或硝酸纤维素滤膜作固相基质，将动物细胞悬液滴于膜上，烘干， 适当的细胞固定剂固定。β2-受体则不需用固定剂固定。 (3)封闭 采用1—2％脱脂奶粉或牛血清白蛋白封闭上述膜片，37℃烘干，4℃ 保存备用。 (4)竞争抑制反应 将上述封闭后的膜片，放入装有待测动物体液(如尿液、血浆)的 容器中，10-20分钟后取出洗涤，装入有酶标配基的溶液中，10分钟后 取出洗涤，加入酶底物(辣根过氧化物酶底物为二氨基联苯胺(DAB)， 棕色；碱性磷酸酶底物为5-溴4-氯3-吲哚-磷酸(BCIP)和氮兰四唑 (NBT)，兰紫色，管中显色，10分钟内取出。 (5)结果判定 根据显色情况判定结果：样品滤膜颜色与弱阳性滤膜对照。如颜色 深于对照则为阴性，如颜色浅于对照为阳性。也可制备系列标准品，经 分光光度仪扫描标准点和样品点，通过绘制标准曲线计算样品中β2-兴奋 剂含量。 本发明方法以含有β2-受体的细胞为受体时的步骤如下所示： 本发明方法中的酶标配基的制备及封闭后的固定化细胞滤膜均在实 验室中预先完成，在现场检测时，加入测试样品即能快速地进行样品中 β2-兴奋剂的检测。 本方法在检测操作中，也可应用可套于注射针筒上的过滤膜盒进行 上述竞争抑制试验，内装上述滤膜，注射针筒可施压，分别输入测试样 品，洗液，酶标配基溶液，可使反应及洗脱均在其中进行，则本试验所 需时间可进一步缩短，既达到快速的目的，使用也更方便。 本发明方法检测β2-兴奋剂残留量的样品种类可包括：饲料、尿液、 血浆、内脏(肺、肝、肾等)、肌肉、毛发、视网膜等。检测样品是动物 体液，如尿液或血浆，则可直接现场快速进行检测。对动物固体样品则 需经前处理成为溶液后也就能用本法检测。而且本发明方法还具备直接 检测固体样品中β2-兴奋剂的潜力，因此应用本发明方法使固体样品的现 场快速检测也会成为可能。 本发明优点：因本发明方法是根据受体-配基结合理论，受体与配基 的结合具有如下特点： 1、高特异性—受体的立体构象具有高度选择性，能准确识别并特 异结合某些立体特异性配基，二者间具有锁-钥关系。 2、高亲合力—受体-配基解离常数10-9—l0-12M。抗原-抗体解离常 数为10-6—10-9M。因此前者比后者的亲和力高3个数量级。理论上讲， 达到平衡结合时，前者耗时少，后者耗时多。在单位时间内的结合数量 前者多而后者少。因此，由受体-配基系统和抗原-抗体系统的二种检测方 法作比较，前者反应更快，灵敏度更高。 3、β2-兴奋剂配基，包括许多结构类似物，如Clenbuterol， Salbutamol，Terbutaline、Methylclenbutarol等，它们都能与β2-受体结合。 生理条件下，它们产生相同的生理效应(瘦肉增加，脂肪减少)。因此， 这类β2-兴奋剂都属被禁之列。用β2-受体作“靶”，检测对象是所有与 之结合的β2-兴奋剂，而免疫学抗原-抗体系统中，一个抗体对应于一个 抗原决定簇，尚无证据表明所有β2-兴奋剂都具有共同抗原决定簇。因此， 基于免疫学原理的检测方法，不可能一次检出所有违禁的β2-兴奋剂。而 本发明方法可一次检出所有β2-兴奋剂。 综上所述，本发明方法比现有的免疫分析法(包括免疫纸片法)更 有优越性。反映在：特异性较高，假阳性出现的可能更小；灵敏度较高； 整个反应更快；一次测定可检出所有β2-兴奋剂，可在现场采用预制的固 定有β2-受体或细胞的滤膜进行快速检测，适于做筛选工作。 本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。 实施例1辣根过氧化物酶标记Clenbuterol的制备 5mg辣根过氧化物酶溶于1ml 0.3M碳酸氢钠溶液中(pH 8.1)，加入 1％二硝基氟苯的乙醇溶液0.1ml，搅拌1小时，加入0.08M过碘酸钠1ml， 搅拌半小时，加入0.16M聚乙二醇1ml，搅拌1小时，对0.01M Na2CO31000ml透析，换液3次，加入Clenbutarol 0.5mg，搅拌3小时，加入5mg 氢硼化钠，冰箱过夜，对0.02M磷酸盐缓冲液透析3次，可得约4ml辣 根过氧化物酶标配基，加入4ml甘油，混匀，储于-20℃备用。 实施例2含有β2-肾上腺素能受体的细胞固定化与封闭 剪取4张1×1cm的硝酸纤维素滤膜，每张膜片上滴一滴(约20微 升)动物淋巴细胞悬液(106-107个/ml)37℃烘干，浸于1-3％的戊二醛 生理盐水溶液中，固定1小时，37℃烘干。 将上述膜片浸于1-2％的脱脂奶粉中封闭1小时，37℃烘干，4℃保 存备用。 实施例3 在容器中进行检测样品 取四小管，第一管装1ml阴性尿样，第二管为1ml阳性尿样(即阴 性尿样+10ng Clenbuterol)，第三管1ml为弱阳性尿样(即阴性尿样+1ng Clenbuterol)，第四管为1ml检测样品尿样，每管各加一张固定有细胞的 膜片。10-20分钟后，弃去尿液，每管加1ml生理盐水洗涤，洗三次，每 管加入生理盐水0.5ml，再加稀释的辣根过氧化物酶标配基液(实施例1 制得的酶标配基液用生理盐水稀释10倍)5μl，10分钟后弃去管中溶液， 用生理盐水各洗3次，每管各加底物溶液0.5ml(底物溶液配制：7.5mgDAB 溶解于10ml 0.05M Tris-HCl pH7.5，加入过氧化氢溶液(30％)1微升即得， 10分钟内取出。以上四管中的膜片，如阴性管颜色深棕色，阳性管无色， 弱阳性一管有少许棕黄色，则试验成立。检测样品管与之比色，如颜色 深于弱阳性管则可判定为阴性，反之则为阳性。 实施例4 在注射器中结合过滤膜盒进行检测样品 实验室常用的过滤膜盒为塑料材质，分为二半圆形，因互有阴阳螺 纹，可旋紧为一个整体(中空)，中间可放1张膜片(圆形)。有橡皮垫 圈，随着二半圆旋紧橡皮垫圈就把膜片圆周夹紧，周边不会渗水，这二 半圆都有一个突出开口，可套在注射器针筒上。当注射针筒装上溶液后 套上膜盒，施加压力溶液就进入膜盒，通过膜盒中央的滤膜而从另一半 圆出口流出。 在样品测试中可将固定有细胞的膜片(实施例2制得)装入过滤膜 盒中，旋紧，针筒吸入1ml血浆。套上膜盒入口，轻轻施压，血浆进入 盒中，流经膜片时血浆中β2-兴奋剂与细胞膜上的受体结合，整个过程可 控制在4-5分钟，然后取下针筒吸入3-4ml生理盐水，依上法套上膜盒， 施压，洗涤盒中膜片，再吸入辣根过氧化物酶标配基液(实施例1制得)， 压入膜盒后待3-4分钟，再用生理盐水依上法洗涤。最后旋开膜盒，取 出膜片，浸于底物溶液中显色，与对照物进行比色，就可判定是阳性或 阴性(该步操作与实施例3相同)。全部过程大约15-20分钟，既达到快 速的目的，使用者也方便。