本发明涉及使用失去在体外或植物中旺盛繁殖能力的农杆菌菌株、 尤其是使用营养缺陷型农杆菌菌株产生转化植物。 发明背景 近年发展了许多植物遗传转化技术。这些方法的最终目标是获得转 基因植物，转基因植物中所有细胞都含有稳定整合入它们的基因组、尤 其是核基因组的含有目的基因的外源DNA。 不同的植物转化方法已得到描述并已可分为物理DNA转移方法(例 如电穿孔、PEG介导的DNA摄取、biolistics)或农杆菌介导的DNA 转移。后者更高效、简单、转基因植物质量更高(一般包括更少量的转 基因并有更低的异常转基因发生率)。 农杆菌介导的植物DNA转化的基础是某些农杆菌菌株将它们Ti 质粒的部分即T-DNA导入植物细胞并将此T-DNA整合入细胞核基 因组的能力。据发现，被转移和整合的Ti质粒的部分的特征是特定DNA 序列即所谓的左右T-DNA边界序列并且这些边界序列之间的天然T- DNA序列可被外源DNA(欧洲专利公开“EP”116718；1967 Deblaere 等(1987)酶学方法153：277-293)置换。 农杆菌介导的转化方法常需要使用易于再生的离体植物组织、器官 或器官的部分如叶盘、节间段、茎段等。选择性地，将体外培养的组织 (例如致密的胚发生愈伤组织)、悬浮培养物或单细胞(原生质体)用 作转化的起始材料。对于拟南芥，已描述接种种子或完整植物的方法(即 所谓的植物中转化方法)。 所有方法的共同特征是将待转化的细胞、组织或植物与农杆菌菌株 共培养一定时间，然后运用杀菌剂或抑菌剂如抗生素限制或排除农杆菌 菌株的繁殖，尤其是需要进一步体外培养时更是如此。抗生素的使用浓 度经常干扰、甚至抑制转化植物细胞的有效再生。实际上已证明具β内 酰胺核心结构的某些抗生素如羧苄青霉素在植物培养基中的添加会有细 胞分裂素样效应(WO 97/12512)。目的农杆菌菌株通常包含细菌表达的 抗生素抗性基因，例如但不限于β-内酰胺酶，进一步限制合适抗生素 的范围。 经常在某些难以转化的植物物种转化时观察到的问题是可再生的细 胞层不易进行农杆菌介导的转化。实际上，组织发生分析已证实，例如 在番茄中，细胞分裂素处理诱导的苗可从一些新形成层细胞产生 (Monacelli等，1988，原生质体142，156-163)。 另一在农杆菌介导的转化中常遇到的问题是，旺盛繁殖的农杆菌菌 株在植物或植物部分上运动的逆境，尤其是在体外培养转化植物或组织 时，会导致细胞和外植体的再生抑制或者甚至死亡。 Lippincott等，1965(细菌学杂志90，1155-1156)描述了农杆菌菌株 B6的营养缺陷型突变体的侵染性大大降低(＜亲本特异侵染性的1-30 ％)。 Lippincot和Lippincott(1966，细菌学杂志92，937-945)描述了腺 嘌呤、甲硫氨酸或天冬酰胺营养缺陷型农杆菌突变菌株的特性鉴定并提 出在用营养缺陷型农杆菌侵染的同时向受侵染的叶提供所需养分可增加 侵染性。 Christen等(1984，Z，Pflanzenphyxiol，Bd.，113 S.213-221)证实 需亮氨酸和组氨酸的根瘤农杆菌突变体在分裂的烟草xanthi原生质体存 在时生长极弱并建议在有限量的允许农杆菌暂时分裂的所需养分存在时 用这样的营养缺陷型菌株与植物原生质体共培养作为抗生素使用的替代 方法。 Chang等(1994，植物杂志5，551-558)描述了针对拟南芥的转化方 法，包括在其基部切割顶枝、在切割位点用农杆菌接种并在植物中从切 割位点再生枝条以产生稳定转化的后代。 针对拟南芥的植物中转化方法的改进由Bechtold等(1993，C.R. Acad.Sci.Paris.Sciences de la vie 316：1194-9)描述，基于农杆菌细胞悬 浮液向拟南芥植物中的真空浸润，接着选择T1种子的转化后代。作者 认为转化效率的主要限制因素是从萌发期直至种子形成细菌在植物中的 有存留。 发明概述 根据本发明，提供制备包含整合入其至少部分细胞的基因组的外源 DNA片段的转基因植物的方法，包括以下步骤：1)提供植物或植物的部 分，它们已用营养缺陷型农杆菌菌株、优选地需甲硫氨酸或半胱氨酸或 需组氨酸和腺嘌呤的营养缺陷型农杆菌菌株、尤其是LBA4404met或 ATHVade，his系统侵染，菌株携带与至少一个T-DNA边界序列连接 的目的DNA以便能转入到植物细胞中，其中侵染的植物优选地从用所 述营养缺陷型农杆菌菌株接种的外植体组织再生；2)从系统侵染的植 物分离的单细胞或细胞群、优选地通过从系统侵染的植物分离的外植体 组织、原生质体或小孢子的体外再生或选择性地通过系统侵染的植物的 转化后代种子萌发产生转基因植物。 此方法可进一步包括在从系统侵染的植物产生转化植物之前，向系 统侵染的植物的至少部分、优选地向系统侵染植物的花序分生组织或未 成熟花序提供所需养分。 本发明还提供甲硫氨酸或半胱氨酸营养缺陷型或腺嘌呤和组氨酸营 养缺陷型农杆菌菌株、尤其是LBA4404met或ATHVade，his以及它们 在农杆菌介导的植物转化、尤其是农杆菌介导的玉米原生质体转化或选 择性地农杆菌介导的胚发生愈伤组织，尤其是来自黄瓜或甜菜的胚发生 愈伤组织转化中的用途。 发明详述 本发明基于以下发现：如下所定义的营养缺陷型农杆菌菌株接种于 外植体时可以存活并成功建立再生植物的系统侵染。即使没有杀菌或抑 菌化合物，特定营养缺陷型农杆菌的存在也不影响植物再生。而且，这 样的细菌仍能转化细胞，这可以通过检测再生植物中标记基因表达的转 化区来证明。最后，来自系统侵染的植物的组织外植体可进一步在体外 培养，而细菌不在外植体上过度生长。 本发明的营养缺陷型农杆菌菌株允许在植物中及在体外共培养时细 菌细胞的可控繁殖，而接种的植物、组织或细胞不再有繁殖细菌的过度 生长。本发明的农杆菌菌株因此可用于建立以这样的菌株系统侵染的植 物。增加与接种的农杆菌菌株的接触时间，使细菌得以穿入内层植物组 织并到达和转化适当靶组织如基础可再生细胞。然而，这种延长的接种 只有在细菌的旺盛繁殖可以得到控制而又不将它们杀死时才可以实现， 而这一点用本发明的营养缺陷型农杆菌菌株可以实现。此方法在产生系 统侵染植物需体外培养步骤时(例如从组织外植体如茎段再生系统侵染 植物)尤其有用。 此外，运用营养缺陷型农杆菌菌株产生以这样的菌株系统侵染的植 物并且同时局部提供所需营养成分允许农杆菌在特定靶组织，例如但不 限于花序形成分生组织中局部和受控的生长。 适用于本发明方法的营养缺陷型农杆菌菌株是那些如果不在确定成 分培养基中加入特殊要求的养分就不能在该培养基中繁殖的农杆菌菌 株。优选地，农杆菌不能在植物组织中或植物组织上旺盛繁殖。 特别优选的营养缺陷型农杆菌菌株是针对仅以有限量存在于植物组 织或胞间液中的分子、更具体地针对核苷或核苷酸(嘌呤或嘧啶)或氨 基酸的营养缺陷。特别优选的是氨基酸营养缺陷型、尤其是含硫氨基酸 营养缺陷型、特别是半胱氨酸或甲硫氨酸营养缺陷型农杆菌菌株。特别 优选的是产生缺陷型高半胱氨酸甲基转移酶(EC 2.1.1.14)或不产生高半 胱氨酸甲基转移酶的农杆菌菌株。然而，也已知其它基因如编码高丝氨 酸琥珀酰转移酶(EC 2.3.1.46)、胱硫醚(γ)合酶(EC 4.2.99.9)或胱硫醚(β) 裂合酶(EC 4.4.1.8)的基因中的突变也可导致甲硫氨酸营养缺陷型农杆 菌，并且这些菌株可用于相似效应。 另一特别优选的农杆菌菌株是需要两种不同养分、尤其是需要腺嘌 呤和组氨酸的营养缺陷型农杆菌菌株如ATHVade，his。 优选的是营养缺陷型农杆菌突变菌株应具有低回复突变率。导至低 回复突变率的缺失突变在本领域内已知，并且在细菌中产生缺失的方法 为熟练技术人员所知(例如Van Haute等1983，欧洲分子生物学杂志 2：411-417)。 根据本发明，所有农杆菌菌株，无论它们属于毛根农杆菌、根瘤农 杆菌或放射形农杆菌都可用作宿主以携带将目的基因转移给植物细胞所 必须的T-DNA载体和辅助质粒，只要它们带有上述使它们营养缺陷的 突变。优选的菌株是营养缺陷的LBA4404菌株，尤其是LBA4404met。 同时应当明确营养缺陷型宿主所携带的T-DNA载体或辅助Ti- 质粒的类型对实施本发明并不重要。已证明某些Ti质粒如pTiBO542 衍生的pEHA101(Hood等，1986，细菌学杂志168：1291-1301)可提高T -DNA向植物中转移的频率。也已证明，将高毒性Ti质粒如pTiBO542 的Vir基因、尤其是VirG或VirG和VirB导入如pTOK47所例示的 与固有Ti-辅助质粒相容的复制子(Jin等，1987细菌学杂志169：4417- 4425)可提高T-DNA向植物中转移的频率。显然包含这样的质粒的营 养缺陷型菌株可用于本发明的植物转化方法。已进一步证明包含高毒性 Ti质粒的额外VirG基因、尤其是来自pTiBO542的VirG基因的所谓 的超双元载体可提高向某些植物(例如EP0604662)转移的频率并且包含 这样的T-DNA载体的营养缺陷型菌株可用于本发明的植物转化方法。 根据本发明，提供 1.一种制备包含整合入其至少部分细胞的基因组的外源DNA片段 的转基因植物的方法，包括以下步骤： 1)提供用带有与至少一个T-DNA边界序列可操作连接的目的 DNA的营养缺陷型农杆菌菌株系统侵染的植物，并且 2)从衍生自系统侵染植物的转化单细胞或转化细胞群再生转化植 物。 在优选的实施方案中，通过用如此处所述的包含目的DNA的营养 缺陷型农杆菌菌株接种外植体组织，然后使外植体和营养缺陷型农杆菌 菌株在体外共培养足以建立成功侵染的一段时间而产生系统侵染的植 物。然后除去过量的细菌并再生系统侵染的完整植物。 培养营养缺陷型农杆菌的方法在本领域内众所周知。为了进行成功 的系统侵染，认为重要的是在接种步骤以前不能完全除去培养基中带有 的所需养分。另外，本发明方法中可以包括在接种之前将营养缺陷型农 杆菌菌株在诱导vir基因表达的植物酚类化合物如乙酸丁香酮存在的情 况下下培养。这种用植物酚类化合物预培养的方法已在可看到的文献中 得到详细描述(例如Vernade等，1988，细菌学杂志170：5822-5829)。 选择性地，诱导vir的化合物可局部提供给系统侵染的植物。 预计所用接种方法无关紧要。优选地，将外植体浸没在密度或OD600 范围从0.01到2、优选地0.1到1.5、尤其是约0.1的农杆菌细悬浮液中。 而且，其它方法如植物或植物部分中的真空浸润、农杆菌细胞的浸润、 等都可用于得到同样效果。 应当明确的是转化外植体组织的细胞不是必须的，只要外植体受到 农杆菌菌株侵染以便能再生成农杆菌系统侵染的植物。 认为外植体组织的主要限制因素在于其形成完整植物、优选地可育 植物的能力。因此，取决于要转化的植物物种，大多数外植体可用作本 发明转化方法的起始材料，例如茎段或节间段，愈伤组织、优选地胚发 生愈伤组织、尤其是谷类植物的致密胚发生愈伤组织。 在优选的实施方案中，将外植体和农杆菌菌株的体外共培养延长2 至5天，但认为此时间间隔也可缩短至不足1天或延长至多达10天。 特别是对于延长的培养时间，应注意由于接种时细菌培养基带有的残留 所需养分而继续分裂的农杆菌不完全长满外植体。 粘附在外植体表面的多余细菌可选择性地例如通过冲洗或在无菌纸 巾上吸干简单去除。 最后，用目的农杆菌系统侵染的植物在体外、在土壤中或同时在体 外在土壤中再生。当需体外再生时，此方法尤其有利，因为营养缺陷型 农杆菌即使在缺乏抗生素时不能在末补加养分的常用植物培养基(如 Murashige和Skoog培养基)上生长。 在从外植体组织再生植物的过程中，通过在含有本领域内众所周知 的针对转化植物细胞的选择试剂的培养基上培养可以富集转化的植物细 胞。然而，对于本发明方法，重要的是农杆菌可耐受所用的选择试剂。 已知存在于系统侵染的再生植物中的营养缺陷型农杆菌具有将目的 DNA转移到几种组织中的能力，并且转基因的表达已在至少花药、叶、 花原基等组织中得到证明。鉴于观察到的稳定转化组织的多样性，认为 农杆菌可进入所有组织中的所有细胞，尤其是可再生细胞和组织。 再生植物将一般由转化和未转化细胞的嵌合体组成，认为转基因细 胞的不同块可能源于独立的转化事件。为挑选不同的转化事件，此方法 中优选地包括“克隆”步骤。“克隆”是指从单细胞或细胞群开始再生 植物的过程。配子发生提供天然发生的克隆过程。因而单倍体克隆植物 可例如通过小孢子培养产生。然后很容易得到作为“加倍的单倍体”的 带有限量转基因插入的纯合植物。然而很显然，配子可用于使或被相应 配子受精以产生合子胚。 种子、优选地通过再生植物自交而得到的种子允许在以农杆菌菌株 系统侵染的再生植物后代中分离含有限量转基因的转化植物株系。显然 不必所有后代种子都产生转基因植物，但检测转基因存在的方法 (Southern、PCR、报告基因表达)在本领域内众所周知。 应当理解上述克隆方法仅适用于可育植物。不能进行配子发生的植 物将需要运用体外克隆方法。本领域有几种可用方法，包括但不限于原 生质体法(例如Lijsebettens等，1986，分子生物学杂志188，129-145)、 组织机械破碎(Meins和Binns，美国国家科学院院报74，2928-2932)或 从外植体如叶盘产生苗。一般认为存在于植物组织中的营养缺陷型农杆 菌菌株不能在用于体外培养的植物培养基上生长的特性允许使用体外克 隆系统而不必不得不求助于杀菌或抑菌化合物，这构成了所述转化方法 的主要优点。 通过在无所需养分和杀菌化合物如抗生素存在时培养完整再生植 物，可除去再生植物中系统扩散的农杆菌。应该注意，在此阶段，不再 需要再生，因此可以使用杀菌化合物，尽管它们对再生有潜在的有害影 响。一般还认为农杆菌不通过种子传播。因此收获后代种子代表着实现 从植物去除农杆菌的可选方法。 根据本发明，提供转化方法，包括局部刺激地方性农杆菌种群的生 长，优选地在适当靶组织的位点、尤其是在花序分生组织位点的生长的 另一步骤。为此目的，向营养缺陷型农杆菌系统侵染的再生植物局部供 应所需养分、尤其是所需甲硫氨酸以局部刺激农杆菌分裂以及目的DNA 向目的靶组织的转移。施用方式被认为是不重要的，这些向植物施用化 学物质的方法一般可在本领域内得到(例如用70％丙酮中的所需养分溶 液喷雾)。 在优选的实施方案中，提供所需养分给产生配子和最终种子的细胞 谱系、尤其是花序分生组织或未成熟花序。在另一实施方案中，提供所 需养分给特别适于体外再生的组织。 优选的是在进行到克隆步骤以前留出一段时间、具体地至少一天。 这一点在花序分生组织或未成熟花序都有所需养分供应的情况下非常清 楚。优选的是留出足够时间以允许配子或种子的收获。 很显然，对于本发明方法，并不严格要求整株植物都受营养缺陷型 农杆菌侵染。根据本发明方法，其中只有部分如叶片受营养缺陷型农杆 菌侵染的植物可用作适当的材料以分离转化细胞用于再生转化植物。 在此方面，重要的是注意，如此处所用的，“系统侵染的植物”是 其中农杆菌菌株存在于植物的至少某一部分、优选地存在于植物的至少 几个部分的植物。 预期所述的使用营养缺陷型农杆菌的植物中转化方法适用于任何植 物的转化，只要对于这些植物具备从外植体组织再生的方法。本发明的 方法将特别适用于其中转化和再生不能一步实现的植物的转化。植物中 转化方法尤其适用于甜胡椒(Capsicum annuum)、黄瓜(Cucumis Sativus)、向日葵(Heliantus annuum)、韭葱(Allium ampeloprasum)、玉 米(Zee mays)、小麦(Triticum属种类，尤其是T.aestivum和T. turgidum)、大麦(Hordeum Vulgare)、黑小麦(Triticosecale属种类)、燕 麦(Avena属种类)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oriza Sative)的转化。 很显然，本发明的营养缺陷型农杆菌菌株可用于任何农杆菌介导的 植物转化方案，由此排除了用杀菌或抑菌化合物控制农杆菌繁殖的需 求。据信本发明的营养缺陷型农杆菌菌株、优选地需甲硫氨酸的农杆菌 菌株、尤其是LBA4404met特别适合用于植物原生质体，尤其是胡萝卜 叶柄原生质体、甜菜保卫细胞原生质体和玉米原生质体的转化，以及用 于愈伤组织、优选地胚发生愈伤组织、尤其是来自甜菜或黄瓜的胚发生 愈伤组织的组织转化。预期本发明的营养缺陷型农杆菌可用于转化所有 植物，无论双子叶还是单子叶植物，但尤其适用于转化甜胡椒(Capsicum annuum)、黄瓜(Cucumis Sativus)、向日葵(Heliantus annuum)、韭葱 (Allium ampeloprasum)、甜菜(Beta属种类)，萝苣(Cichorium属种类)、 玉米(Zee mays)、小麦(Triticum属种类，尤其T.aestivum和T. turgidum)、大麦(Hordeum Vulgare)、黑小麦(Triticosecale属种类)、燕 麦(Aveta属种类)、黑麦(Secale cereale)和水稻(Oriza Sative)。 尽管不打算将本发明限制于任何一种学说或作用方式，但营养缺陷 型细菌在所用的体外培养基中的适合度下降对通过降低由旺盛繁殖和相 关病理过程在植物中引起的逆境从而提高转移效率是关键的，而且避免 了所加的杀菌或抑菌化合物对植物细胞、尤其是原生质体的消极影响。 以下实施例详细描述了本发明的方法。除非实施例中另外声明，所 有重组DNA技术根据Sambrook等(1989)分子克隆：实验指南，第二 版，冷泉港实验室出版社，纽约和Ausubel等(1994)分子生物学常用方 法，常用方法，美国的第一卷和第二卷进行。植物分子工作的标准材料 和方法描述于R.D.D.Croy的植物分子生物学实验室传真(1993)，由 BIOS科学出版有限公司(UK)和Blackwell科学出版社，UK联合出版。 在本发明的描述和实施例中，参照序列表中的序列。以下都包括在 序列表中： <223>人工序列描述：pGSV71的T-DNA <223>LB：T-DNA右边界 <223>CaMV35S P3启动子 <223>编码膦丝菌素乙酰转移酶的区域 <223>3’nos：包含农杆菌T-DNA胭脂氨酸合酶基因的多腺苷 酸化信号的3’非翻译区。 菌株LBA4404metHV和ATHVade，his已于1998年8月20日保 藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)，微生物实验室- Bacterienverzameling(LMG)Universiteit Gent.K.L Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，比利时并已得到以下保藏号： LBA4404metHV：LMG P-18486 ATHVade，his：LMG P-18485。 实施例 实施例1：营养缺陷型农杆菌菌株的选择 将来自新鲜培养的根瘤农杆菌菌株LBA4404的单菌落(补加 25μg/ml链霉素的LB培养基)接种于5ml LB培养液中，并于28℃在 旋转摇床上培养48小时。用X射线以600千拉德照射2ml此培养物37.5 分钟或200千拉德12.5分钟。向1ml经照射的培养物加入2ml补加1g/L 水解酪蛋白质氨基酸和25g/ml链霉素的基本M9培养基(60mM K2HPO4， 33mM KH2PO4，0.75mM(NH4)2SO4，0.17mM柠檬酸三钠2H2O，0.02％ MgSO4，0.2％葡萄糖，0.0005％硫胺素)，于28℃振荡培养48小时。将 这些培养物以适当稀释度铺板，在补加和未补加1g/L水解酪蛋白氨基 酸的基本培养基(25μg/ml链霉素上)筛选存活的菌落(约106CFU/ml)。 分离2个不能在未补加的基本培养基上生长的菌落。然后将这些营养缺 陷型菌落用于接种一系列分别补加0.1mM每种氨基酸的2ml液体基本 M9培养基培养物并于28℃振荡培养约48小时。第一个营养缺陷型菌 种在补加异亮氨酸和苏氨酸的培养基上生长良好并且在天冬酰胺、苯丙 氨酸或丙氨酸上生长微弱。第二个营养缺陷型突变菌株仅在补加甲硫氨 酸的基本培养基上生长。后一个菌株称为LBA4404met。 LBA4404met不能在含甲硫氨酸、高半胱氨酸的直接前体的培养基 上生长。因此可以推测LBA4404met中的突变影响高半胱氨酸甲基转移 酶。 通过将LBA4404met的致密培养物在基本培养基平板(不补加甲硫 氨酸)上铺板并于28℃培养长时间来评估回复突变率。甚至在两星期之 后，也未在以10μl未稀释细菌培养物(1.7×105CFU/ml)接种的平板上观 察到菌落，从而估测回复突变率为0.5×10-7以下。 实施例2：通过加入源自高毒性辅助Ti质粒的Vir基因提高农杆菌 LBA4404met介导的转化效率 使用包含T-DNA载体pNUN25的几乎等基因的菌株LBA4404met 和LBA4404met HV评估营养缺陷型农杆菌菌株中的高毒性辅助Ti质粒 对转化效率的影响。通过将质粒pTOK47(Jin等，上述)导入LBA4404met (通过电穿孔)得到LBA4404metHV菌株。pUNU25是T-DNA载体， 包含在nos启动子控制下且与T-DNA边界之间的nos终止子可操作连 接的nptII基因以及T-DNA边界之外细菌表达的nptII基因。它可通 过将包含源自Nicotiana sylvestris的谷氨酰胺合酶编码区的(具有录入 号X66940下登记的EMBL序列的核苷酸67到核苷酸1363)并已通过 PCR扩增在其上改造了XbaI位点(起始密码子的5’端)和EcoRV位 点(编码区的3’末端)的DNA片段导入XbaI/Eco1CRI线性化的 pUNN5(WO 94/29465)来得到构建。 将烟草叶盘在加有1mg/L BAP(苄基氨基嘌呤)的5ml MS20培养基 [补加20g/L蔗糖的Ms盐(Murashige和skoog，1968，植物生理学15， 473-497)]中培养2天，而后与LBA4404met(pNUN25)或 LBA4404metHV(pNUN25)一起培养至终OD600 0.05。在16小时/8小 时光照/黑暗循环周期下于27℃培养2天。接着，将叶盘转移至加有1mg/L BAP和100mg/L卡那霉素的固化MS20培养基上。当卡那霉素抗性苗 出现时，将其取出并在选择培养基上进一步培养。当使用LBA4404met (pNUN25)时，从约100个叶盘分离到约60株转化苗；而使用 LBA4404metHV(pNUN25)时，从约100个叶盘分离到约223株转化苗。 由此可得出结论，即高毒性Ti质粒的vir基因在营养缺陷型背景 下仍发挥与Jin等在原养型背景下所观察到的(上述)相同的作用。 实施例3：黄瓜(Cucumis sativa)的植物中转化 基因型Gu1665-M的黄瓜种子通过在70％乙醇溶液中放置1分钟 随后在4％次氯酸盐溶液中放置15分钟表面杀菌。种子在无菌H2O中 洗3次并在体外培养成植株。从无菌生长的细胞收获24个节间段并将 其在10ml液体MS20中培养30分钟，向其中加入LBA4404met(pNUN8) 细菌(培养于加有0.1mM甲硫氨酸、100mg/L卡那霉素、25mg/L链霉 素和2mg/L四环素的LB中)至终OD600 0.1。pNUN8是与pVDH99 (见以下描述)相似的T-DNA载体，其中包含nptII嵌合报告基因的 EcoRI/XhoI DNA片段已由包含在CaMV35S衍生的启动子和终止子序 列之间的嵌合膦丝菌素乙酰转移酶编码区的DNA片段置换。从细菌悬 浮液中取出节间段并通过在滤纸上迅速吸干除去多余的细菌。接着将接 种的节间段转移到MS20固体培养基上再生。 然后使用看来健康的再生植物通过组织化学染色证明花中细菌的存 在以及花部分中β-葡糖醛酸酶活性的存在。 为证明农杆菌的存在，将来自限菌生长植物的30朵花在1ml LB 中培养。在培养2-3天后，在28个样品中观察到细菌生长。 也按照Jefferson(1987)(植物分子生物学报告5(4)：387-405)对花进 行β-葡糖醛酸酶活性的组织化学染色。在至少6朵花中，观察到六个 表现GUS活性从而表明这些组织中DNA转移的点。使来源于传粉的雌 性花的种子在含有膦丝菌素的培养基上发芽以得到转化的植物。 实施例4烟草(Nicotiana tabacum)的植物中转化 从无菌生长的烟草植物(SR1)分离节间段并在 LBA4404meHV(pVDH8)细菌的悬浮液(OD600 0.05/30ml MS20中)中培 养120分钟。接着将节间段转移到补加10μM乙酸丁香酮的固化MS20 培养基上。对来自体外再生植物的幼叶进行组织化学GUS染色并在几 片叶中观察到不同大小的蓝色部分。染色部分的大小差异可能反映了T -DNA进入细胞谱系中的前身细胞这一时间点的入口。使用再生植物 的叶作为起始材料分离叶盘，叶盘在含PPT的培养基上培养以获得转 基因苗和最终的转基因植物(根据Horsch等，1984，科学223：496-498 描述的方法)。 实施例5：番茄(Lycopersium esculentum)的植物中转化 从无菌生长的番茄植物(Moneymaker)分离节间段并在 LBA4404metHV(pVDH99)细菌的悬浮液(OD600 0.05/30ml MS20中)中培 养15分钟。PVDH99是包含带有如van Canneyt等(1990，Mol.Gen. Genet.220：245-250)所述的35S-GUS-内含子嵌合基因以CaMV35S- nptII嵌合选择基因的T-DNA的质粒。此质粒还包含细菌卡那霉素抗 性。接着将节间段转移到补加10μM乙酸丁香酮的固化MS20培养基上。 对来自体外再生植物的幼叶进行组织化学GUS染色并在几片叶中观察 到不同大小的蓝色部分。染色部分的大小差异可能反映了T-DNA进入 细胞谱系中的前身细胞这一时间点的入口。使用再生植物的叶作为起始 材料分离叶盘，在含卡那霉素的培养基上培养以获得转基因苗和最终的 转基因植物(根据MC Cormick等，1986植物细胞报告5：81-84描述 的方法)。 实施例6：韭葱(Allium ampeloprasum)的植物中转化 为此目的，使用并收获完全成熟的田间生长植物。让植物干燥3天 以减少侵染。收集阳茎基片，切成4片(彻底清除根部)，并且随后通 过70％乙醇中浸没1分种，接着用2％NaOCl(商业漂白剂)处理20 分钟来灭菌。这样处理之后将外植体用无菌水洗4次，每个冲洗步骤之 间有10分钟间隔。 将这些外植体转移至诱导培养基[DS大量元素(Dunstan和Short， 1979，Sci Hort 112：37-43)，MS微量元素(Murashige和Skoog，1968， 下述)，FeEDTA，硫胺素10mg/L，吡哆醇1mg/L，烟酸1mg/L，肌醇 100mg/L，蔗糖30g/L，异戊烯腺嘌呤(2-IP)4mg/L，NAA 1.25mg/L，琼 脂8g/L]。在光强度2000至4000勒克斯下于21℃培养3至4周后，开 始出现第一个小植株，然后将其用于接种农杆菌 LBA4404metHV(pVDH99)。为此目的，从最初的外植体切下幼下植株， 在幼小植物的底部进行切割。将此创伤的底部在OD600约0.01的农杆菌 悬浮液中浸泡30分钟时间。在转移到诱导培养基之前通过在滤纸吸干 迅速除去多余的农杆菌悬浮液。接种的植物发育出一些不定植株，对其 中的一些植株通过组织化学GUS染色进行测试以验证推测的转基因部 分的存在。将相似的不定小植株转移到允许成熟韭葱植株生长的培养基 [与诱导培养基相似，除了NAA减至0.1mg/L并且蔗糖减至20g/L]上。 从再生的成熟植物收获种子，并且使种子萌发以获得转基因植物。转基 因植物通过它们在含卡那霉素的培养基上的生长能力识别。通过插入的 T-DNA序列的PCR探测进一步识别转基因植物。 实施例7：农杆菌介导的来自黄瓜(Cucumis sativa)的胚发生愈伤组 织的转化 来自黄瓜基因型941687-G的胚发生愈伤组织如所述的(Chee，P. (1990)Hortscience 25(7)，792-793)产生。在培养皿中将愈伤组织切成小 于1mm小块，置于5ml MS30 2/0.5 2-4D/kin[另加30g/L蔗糖、2mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和0.5mg/L细胞分裂素的MS盐(Murashige和 Skoog，1968植物生理学15，473-497)]。向此培养皿加入根瘤农杆菌 LBA4404metHV(pTOK47)(pVDH99)悬浮液至0.5终OD600。细菌已于28 ℃、在补加0.1mM甲硫氨酸、100mg/L卡那霉素、25mg/L链霉素和2mg/L 四环素的10ml LB中振荡培养2天。通过离心收集细菌，用MS30 2/05 2-4D/kin培养基洗并以原始密度重新悬浮。 在黑暗中于27℃共培养4天后，愈伤组织用25ml液体MS30 2/0.5 培养基洗2次，铺在加有199mg/L卡那霉素的固化MS30 02/0.5培养基 上，并于27C、黑暗中培养。2周后，如Jetterson(1987)(植物分子生 物学报告5(4)：387-405)所述对选择的愈伤进行组织化学GUS染色。至 少在5个愈伤中可见蓝色部分，意味着细胞已由pVDH99的T-DNA 转化。将生长在选择培养基上的看来健康的愈伤部分切下并转移到无卡 那霉素的相似培养基上使之再生。 实施例8：营养缺陷型农杆菌菌株介导的胡萝卜原生质体的转化 根据Dirks等，1996(R.Dirks，V.Sidorov，C.Tulmens 1996， Theor.Appl.Genet.93：809-815)从Daucus Carrota变种Sytan B142叶 柄中分离胡萝卜原生质体，并将其以8×105原生质体/ml的密度重新悬 浮于加有0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA(CPP培养基 根据Dirks等，1996，略去了水解酪蛋白氨基酸)中。使4个装有1.5ml 原生质体悬浮液的培养皿与根瘤农杆菌LBA4404met(pUNU20)(加至 终OD600 0.05)于27℃共培养2天。原生质体培养基中不加抗生素。在 加入原生质体前收集并洗涤细菌以去除甲硫氨酸。 pUNU20是T-DNA载体，包含带有嵌合选择性nptII基因的T -DNA和由CaMV 35S启动子、与启动子可操作连接的H+ATPase β 亚基(Shinozaki，k.，Devo，H.，Keto，A.和Suginec，M.(1983)基因24， 147-153；EMBL数据库录入号K00507)和随后的胭脂氨酸合酶基因终止 子组成的嵌合基因。该质粒进一步包含T-DNA边界之外的细菌卡那霉 素抗性基因。 2天后，向每个培养皿加1.5ml藻酸盐，包含原生质体的藻酸盐盘 浮在3ml含0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA中约12天， 而后加100mg/L卡那霉素，继续培养约2周。然后，将藻酸盐盘溶解在 40mM柠檬酸钠中，洗涤，重新悬浮于5ml补加0.1mg/L NAA(萘乙酸) 和0.2mg/L玉米素的CPP-CA 30/20 S/N中并铺在含75或100mg/L卡 那霉素的固体培养基(含0.1mg/L 2，4-D和0.2mg/L玉米素的CPP-CA 30/20 S/N)上。当在选择培养基上健康生长的愈伤出现时，将其转移到 新鲜选择培养基上。从4.8×106原生质体得到约285个绿色卡那霉素抗 性愈伤。将这些愈伤转移到加有200mg/L Calforan和100mg/L卡那霉 素的B5-0.1培养基(B5培养基依据Gamborg，O.，Miller，R.，Ojima K. (1968)Experimental Cell Research 50：151-158，含0.1mg/L2，4-D) 上以诱导胚发生愈伤组织并且使用无生长调节剂的B5培养基再生植 株。 实施例9：用营养缺陷型农杆菌菌株转化菊苣(Cichorium属种类) 菊苣的种子经表面灭菌(2％次氯酸钠中)、冲洗，在MS20培养基 上萌发并于27℃培养4至8周。将直径约4-6mm的叶盘转移到补加 1mg/L BAP、0.2mg/L NAA和0.01mM甲硫氨酸的MSN20培养基[MS 盐(Murashige和Skoog，上述)，维生素(根据Nitsch和Nitsch 1965，Ann. Phys.Veg 7，251-266)，甘氨酸2.0mg/L，蔗糖20g/L pH5.8，琼脂8g/L] 上，注意将叶盘的远轴面与培养基接触。1天之后，将叶盘浸入包含T -DNA载体pUNU7的根瘤农杆菌LBA4404met细菌悬浮液(OD600在 0.01和0.1之间)中20分钟。pUNU7是包含带有如Van Canneyt等(同 上)所述的CAMV 35S启动子-GUS-内含子嵌合基因和嵌合选择性 nptII基因的T-DNA的质粒。此质粒进一步包括细菌表达的卡那霉素 抗性基因。 叶盘进一步在补加1mg/L BAP、0.2mg/L NAA的MSN20上培养 2天，而后在液体MS20培养基中洗。将洗过的叶盘在补加1mg/L BAP， 0.2mg/L NAA和100mg/L卡那霉素的选择培养基MNS20上进一步培养 (每14天转移到新鲜选择培养基上)。5周之后，将选择培养基换成含 0.1-1mg/L BAP和100mg/L卡那霉素的MS20。 从48个叶小块产生了约20株卡那霉素抗性转化植物。 实施例10：农杆菌介导的DSM6009玉米原生质体的转化 根据EP 0469273A1制备基因型DSM6009的玉米原生质体，将 其与包含辅助质粒pAL4404和T-DNA载体pGSV71的根瘤农杆菌 LBA4404met共培养2-3天。pGSV71是衍生自pGSC1700(Comelissen 和Vandewiele，1989，核酸研究17：833)的T-DNA载体，区别在于其 缺乏内酰胺酶基因并含有以SEQ ID No.1的序列为特性的T-DNA。 pGSV71包括与CaMV35S可操作连接的选择性嵌合bar标记和胭脂氨 酸合酶基因的3’端。2天后，原生质体用W5缓冲液洗并进一步根据EP 0469273 A1培养。转化细胞的选择和再生至转化玉米植物按EP 0469273 A1中所述的进行。获得膦丝菌素抗性玉米植物并通过聚合酶链式反应 和Southern分析证实转基因的存在。 实施例11：营养缺陷型农杆菌菌株ATHVade，his的分离和评估 对于两种养分营养缺陷的农杆菌菌株通过以下流程从菌株 ATHV(Lazo等描述，1991，生物技术9：963-967，如菌株AGL0)开始 选择。 将菌株ATHV在补加100μg/ml利福平(Rif)的LB中培养过夜。用 1ml此细胞培养物接种含20ml LB/100μg Rif的培养瓶并使之于30℃(同 时振荡)生长4小时。以254mm紫外光照射10ml此细胞培养物2至4 小时。将10μl紫外光照射的培养物在用琼脂固化的LB/Rif培养基上铺 板并于30℃、黑暗中培养2至3天。将所得菌落平板复制到补加100μg/ml 利福平的基本培养基(M9，见实施例1)和LB培养基上。分离不能在 基本培养基上生长的克隆并分析其营养需要。鉴定到生长需添加腺嘌呤 并在加组氨酸时生长明显更好的一个菌株ATHVade，his。(见表1)。 这种对外源补充养分的双重需求允许甚至更好地控制此农杆菌菌株的生 长。 表1：ATHVade，his在含有不同浓度腺嘌呤(ade)和组氨酸(his)的基本培 养基上的生长。这些数值代表生长2天后测定的OD600。 Ade 0mM Ade 0.005mM Ade 0.01mM Ade 0.05 mM Ade 0.1 mM His 0 mM 0.019 0.059 0.067 0.111 0.129 His 0.01 mM 0.034 0.07 0.071 0.111 0.141 His 0.05 mM 0.04 0.093 0.112 0.144 0.196 His 0.1 mM 0.035 0.102 0.123 0.163 0.221 为分析菌株ATHVade，his是否仍能进行T-DNA转移，使用含T -DNA载体pNUN7的衍生菌株(见实施例9)侵染烟草和N sylvestris 的叶盘，并与含相同T-DNA载体的野生型ATHV菌株比较。在烟草 中，用ATHV(pNUN7)接种后从约50个叶片获得约115株转化苗，而 用ATHVade，his(pNUN7)接种后从约50个叶片获得约112株转化苗。 在N.sylvestris中，以ATHV(pNUN7)接种后，从约50个叶片获得约17 株转化苗，而以ATHVade，his(pNUN7)接种后，从约50个叶切片获得 约40株转化苗。 实施例12：矮牵牛(Petunia hybrida)的植物中转化 从无菌生长植物分离节间段或茎尖(在长有最初3至4mm叶片的 节下切割)并与农杆菌LBA4404metHV(pNUN7)细胞悬浮液一起培养约 7到10分钟，如前面实施例所述的吸干并在植物培养基上培养。茎尖不 是浸入而是将切割端置于含农杆菌的容器中。在不同时间对外植体和再 生植物的内部检查揭示GUS表达至少发生在维管束中。 体外培养4周后，评估植物不同部分中的细菌存在。为此目的，摘 取不同叶部分，在含100μl LB的试管中研磨。沉淀后，取20μl上清在 含利福平的LB培养基上铺板。结果总结于表2。 表2侵染的矮牵牛植物的不同部分中测定的细菌数 被测叶片 20μl来自结节培养物的 植物提取物中的细菌数 (个体实验) 20μl来自茎尖培养物的 植物提取物中的细菌数 (个体实验) 上部尖端 204/92/0 ＞200/＞500/0 上部中央 271/0/0 ＞500/6/0 中部尖端 ＞500/5/0＞1000/＞500/26＞ 1000 200/1/＞200/＞1000/＞500/＞ 100/0/5＞1000/＞1000 中部中央 10/0/50 ＞200/19/500 底部尖端 ＞500/449/3 ＞500/19/1000 底部中央 ＞500/0/0 ＞2000/＞1000/0 所有被测植物都含有Rif抗性农杆菌，而所有被测样品的约75％ 含有农杆菌。 实施例13：根瘤农杆菌菌株LBA4404metHV与LBA4404HV在欧洲油 菜转化中转化效率的比较 将根瘤农杆菌LBA4404metHV衍生物(包含带有嵌合β-葡糖醛 酸酶基因的T-DNA载体)在从“Topas”的小孢子培养物获得的胚转 化中的转化效率与LBA4404HV和包含相同T-DNA载体的GV3101 的转化效率进行比较。在转化中的事件顺序可以总结如下： a.从欧洲油菜的小孢子建立细胞培养物 b.产生体细胞胚 c.将这些胚与包含T-DNA载体的根瘤农杆菌菌株共培养 d.使共培养的胚生长到下胚轴阶段并诱导次级胚发生 e.对次级胚进行选择 f.对存活的胚进行B-葡糖醛酸酶表达的评估 当使用包含带有嵌合β-葡糖醛酸酶基因的T-DNA载体的 LBA4404metHV转化欧洲油菜时，约80％得到的次级胚具有GUS+区， 而用包含相似T-DNA载体的LBA4404HV共培养时，仅5％的次级胚 表现这样的点。在进一步的定量分析中，比较LBA4404metHV、 LBA4404HV和GV3101(都含有带有嵌合β-葡糖醛酸酶基因的T- DNA载体)的转化效率。结果总结于表3中，证明使用LBA4404metHV 转化更有效。 表3转化效率，通过GUS表达分析 宿主菌株 有GUS+区 的胚的百分数 每个胚的GUS+ 区的平均数 LBA4404metHV 82 ＞20 LBA4404HV 67 5-10 GV3101 59 ±5 序列表 <110>Nunhems Zaden BV <120>改良的农杆菌介导的植物转化 <130>B3715A <140> <141> <150>EP 97114654.3 <151>1997-08-25 <160>2 <170>PatentIn 2.0版 <210>1 <211>2345 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列描述：pGSV71的T-DNA <220> <221>misc_信号 <222>(1)..(25) <223>RB：T-DNA右边界 <220> <221>启动子 <222>(53)..(1436) <223>CaMV35S P3启动子 <220> <221>CDS <222>(1437)..(1988) <223>编码膦丝菌素乙酰转移酶的区域 <220> <221>3′UTR <222>(2007)..(2266) <223>3′nos：包含农杆菌T-DNA胭脂氨酸合酶基因的多腺苷酸化信号的3′非翻译区。 <220> <221>misc_信号 <222>(2321)..(2345) <223>LB：T-DNA左边界 <400>1 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga ccgcggtacc cggaattcca 60 atcccaccaa aacctgaacc tagcagttca gttgctcctc tcagagacga atcgggtatt 120 caacaccctc ataccaacta ctacgtcgtg tataacggac ctcatgccgg tatatacgat 180 gactggggtt gtacaaaggc agcaacaaac ggtgttcccg gagttgcgca taagaagttt 240 gccactatta cagaggcaag agcagcagct gacgcgtata caacaagtca gcaaacagat 300 aggttgaact tcatccccaa aggagaagct caactcaagc ccaagagctt tgcgaaggcc 360 ctaacaagcc caccaaagca aaaagcccac tgctcacgct aggaaccaaa aggcccagca 420 gtgatccagc cccaaaagag atctcctttg ccccggagat tacaatggac gatttcctct 480 atctttacga tctaggaagg aagttcgaag gtgaaggtga cgacactatg ttcaccactg 540 ataatgagaa ggttagcctc ttcaatttca gaaagaatgc tgacccacag atggttagag 600 aggcctacgc agcaggtctc atcaagacga tctacccgag taacaatctc caggagatca 660 aataccttcc caagaaggtt aaagatgcag tcaaaagatt caggactaat tgcatcaaga 720 acacagagaa agacatattt ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag 780 gcttgcttca taaaccaagg caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccta 840 ctgaatctaa ggccatgcat ggagtctaag attcaaatcg aggatctaac agaactcgcc 900 gtgaagactg gcgaacagtt catacagagt cttttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc 960 ttcgtcaaca tggtggagca cgacactctg gtctactcca aaaatgtcaa agatacagtc 1020 tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaagga taatttcggg aaacctcctc 1080 ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc 1140 tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc ctctgccgac 1200 agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 1260 accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gacatctcca ctgacgtaag ggatgacgca 1320 caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag 1380 aggacacgct gaaatcacca gtctctctct ataaatctat ctctctctct ataacc atg 1439 Met 1 gac cca gaa cga cgc ccg gcc gac atc cgc cgt gcc acc gag gcg gac 1487 Asp Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala Asp 5 10 15 atg ccg gcg gtc tgc acc atc gtc aac cac tac atc gag aca agc acg 1535 Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser Thr 20 25 30 gtc aac ttc cgt acc gag ccg cag gaa ccg cag gag tgg acg gac gac 1583 Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp Asp 35 40 45 ctc gtc cgt ctg cgg gag cgc tat ccc tgg ctc gtc gcc gag gtg gac 1631 Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val Asp 50 55 60 65 ggc gag gtc gcc ggc atc gcc tac gcg ggc ccc tgg aag gca cgc aac 1679 Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg Asn 70 75 80 gcc tac gac tgg acg gcc gag tcg acc gtg tac gtc tcc ccc cgc cac 1727 Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg His 85 90 95 cag cgg acg gga ctg ggc tcc acg ctc tac acc cac ctg ctg aag tcc 1775 Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys Ser 100 105 110 ctg gag gca cag ggc ttc aag agc gtg gtc gct gtc atc ggg ctg ccc 1823 Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu Pro 115 120 125 aac gac ccg agc gtg cgc atg cac gag gcg ctc gga tat gcc ccc cgc 1871 Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro Arg 130 135 140 145 ggc atg ctg cgg gcg gcc ggc ttc aag cac ggg aac tgg cat gac gtg 1919 Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp Val 150 155 160 ggt ttc tgg cag ctg gac ttc agc ctg ccg gta ccg ccc cgt ccg gtc 1967 Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro Val 165 170 175 ctg ccc gtc acc gag atc tga tctcacgcgt ctaggatccg aagcagatcg 2018 Leu Pro Val Thr Glu Ile 180 ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat 2078 tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac 2138 gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat 2198 agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt 2258 actagatcgg gaagatcctc tagagtcgac ctgcaggcat gcaagcttag atccatggag 2318 ccatttacaa ttgaatatat cctgccg 2345 <210>2 <211>183 <212>PRT <213>人工序列 <400> 2 Met Asp Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala 1 5 10 15 Asp Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser 20 25 30 Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp 35 40 45 Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val 50 55 60 Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg 65 70 75 80 Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg 85 90 95 His Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Va1 Ala Val Ile Gly Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro 130 135 140 Arg Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp 145 150 155 160 Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro 165 170 175 Val Leu Pro Val Thr Glu Ile 180