本发明涉及检测分析技术领域，公开了一种检测甲氨蝶呤浓度的纳米粒子及其制备方法和应用。本发明公开的纳米粒子包括与金纳米颗粒连接的带有标记基团的发夹DNA和可以被甲氨蝶呤特异性识别的适体链DNA，并且适体链DNA与行走链DNA杂交为双链DNA连接在磁珠上，一方面，通过标记荧光团的DNA链，收集荧光信号来测量MTX浓度；另一方面，失去DNA保护的金纳米，加入氯化钠后在高盐条件下聚集颜色发生变化，通过收集紫外值来测量MTX浓度。本发明提供的纳米粒子，各部分之间相互作用，对信号进行放大，发挥双重检测MTX浓度的效果，为能够实时、准确掌握药物浓度，提高治疗安全性和效果提供了一种强有力的策略。