一株生产木聚糖酶的菌株及应用 [0001] 技术领域： 本发明属于生物化工技术领域，涉及微生物发酵的菌种选育，具体涉及一株产木 聚糖酶的绿色木霉及其应用。 [0002] 背景技术： 有关木聚糖酶的最早的研究始于1955年，起初将其命名为五糖酶。1961年，国际生 化与分子生物学会将其正式定名为木聚糖酶，其官方的命名为内切‑1,4‑β‑木聚糖酶，但常用的名称有木聚糖酶、内切木聚糖酶等等，其实质是相同的。 [0003] 木聚糖酶是一类重要的木聚糖甘键水解酶，也是一种诱导酶，主要包括1,4‑β‑木聚糖酶、1,4‑β‑D木糖苷酶、1,4‑β‑D甘露糖苷酶、1,4‑β‑D葡萄糖苷酶、α‑L‑ 阿拉伯糖苷酶、α‑D‑葡萄糖苷酸酶、α‑D‑半乳糖苷酶、酯酶等多种酶组成的复合酶系。在这个复合酶系中，多种酶的协同作用可以把木聚糖降解为低聚木糖和木糖。木聚糖酶来源广泛，在海洋及陆地细菌、海洋藻类、真菌和反刍动物瘤胃、蜗牛、甲壳动物、陆地植物组织和各种无脊椎动物中都存在。由于动、植物中酶的含量低，提取及纯化过程相当复杂，不能满足研究的需要，所以大量木聚糖酶来源于微生物中。产酶微生物包括：曲霉、木霉、青霉、酵母菌、裂褶菌、芽胞杆菌等。 [0004] 木聚糖酶在食品行业中的应用主要体现在其生产的低聚木糖具有诸多的生理功效，可用于保健食品的开发；在酿酒方面，能显著提高酒精发酵的效率和产率；在制作烘焙食品时，木聚糖酶还能够改善面团的稳定性和蓬松度，提高面筋的弹性与面食的口感；在饲料行业中添加木聚糖酶等复合酶制剂后，能够将饲料充分转化成容易消化吸收的糖类物质，提高利用率。在造纸行业中添加木聚糖酶对纸浆进行预漂白处理，提高漂白效率，有效减少了造纸工业中化学试剂的使用；在医药行业中木聚糖酶能够改善肠道微生物平衡，提高机体免疫力，预防和治疗腹泻、便秘、肿瘤等。亦有事实证明木聚糖酶在植物组织中具有重要的生理功能，它可能与果实软化、种子发芽以及植物防御机制有关。特别在微生物木聚糖酶的研究过程中，更有学者惊奇发现微生物木聚糖酶能够诱导植物细胞中的乙烯生物合成进而作为植物防御系统的触发剂，所以目前的研究主要集中在微生物所产木聚糖酶上。 [0005] 近几十年来，木聚糖酶的应用潜力一直为众多学者所关注。目前，木聚糖酶在工业化生产中主要存在以下问题：生产的木聚糖酶本身活力不高；木聚糖酶的工业化生产工艺技术不成熟；运输不方便；酶活稳定性不足。以上问题导致木聚糖酶生产成本过高。如何找到高产木聚糖酶的菌株，提高木聚糖酶稳定性，获得不易失活、作用范围广泛的产酶菌株成为研究的重点。 [0006] 发明内容： 为解决以上问题，本发明目的是提供一株能够产木聚糖酶的绿色木霉，具体为木 霉（Trichoderma viride）TP‑1002，该菌株是通过快中子辐照和硫酸二乙酯诱变育种获得，能大大提高木聚糖酶的产量，为低成本、规模化生产木聚糖酶奠定了基础。该菌株已于2022年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.40415。 [0007] 本发明还提供所述菌株绿色木霉（Trichoderma viride）TP‑1002的应用，特别是在生产木聚糖酶中的应用； 进一步地，本发明提供一种采用绿色木霉（Trichoderma viride）TP‑1002完成的 发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的木聚糖酶的液态微生物发酵生产方法，具体如下： 发酵罐培养：将种子液按照移种量8‑12%（v/v）的比例移入发酵罐，培养条件为初始pH 4.5‑5.5，温度30‑34℃，风量：第0‑24h为0.1‑0.25vvm、第25‑48h为0.3‑0.6vvm、第 49h‑放罐0.6‑1.0vvm，转速200‑800rpm，发酵期间pH低于4.5时，补氨控制pH 4.5‑4.7； 进一步地，发酵培养10h后，流加补料培养基补料控制溶氧15‑30%； 进一步地，发酵周期为150‑160h，此时发酵罐酶活增长缓慢，菌体自溶严重，发酵结束时，发酵液中的木聚糖酶的酶活可以达到29000U/ml以上； 进一步地，发酵产酶培养基（w/v）：玉米芯粉 2%‑5%，葡萄糖 2%‑3%，麸皮 0.5%‑ 3%，MgSO40.02%‑0.04%，(NH4)2SO40.4%‑0.7%，K2HPO40.4%‑0.6%，pH 5.0，其余为水。 [0008] 发酵罐灭菌工艺：121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30‑35min。 [0009] 进一步地，补料培养基（w/v）：葡萄糖 40%‑70%，硫酸铵 0.4%‑0.6%，KH2PO40.3%‑ 0.5%，玉米浆 2%‑5%，其余为水，pH 5.0。 [0010] 补料罐灭菌工艺：葡萄糖单独灭菌，121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30‑ 35min；其余的原料一起灭菌，121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30‑35min，灭菌冷却至 40℃后混合。 [0011] 进一步地，提取精制方法如下： 用碱液调节发酵液pH 7.0，加入珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；后加入硅藻土进行 精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；浓缩液用无菌膜进行过滤除菌（可加入稳定剂、防腐剂），得到液体成品酶制剂。 [0012] 进一步地，木聚糖酶的包衣造粒方法如下： 精确量取所需液体木聚糖酶制剂成品，加入液体木聚糖酶重量30%‑50%玉米淀粉， 10%‑20%滑石粉，2%‑7%麦芽糊精，把以上物料在混匀机中充分混匀；放入旋压挤出机中，挤出长条状物料，筛网孔直径为0.6 mm；把挤出的长条状物料倒入滚圆机中，调节滚圆机于合适转速使其充分切断，使酶颗粒呈现球状；把球状酶制剂颗粒进行鼓风干燥，鼓风温度45‑ 55℃，物料温度30‑38℃，鼓风干燥20‑35min，得到木聚糖酶颗粒成品。 [0013] 本发明获得的木聚糖酶，酶学性质如下： (1)最适反应温度为65℃，在80℃条件下保温2.5h，仍能保持85％以上的酶活，热 稳定性较好； (2)最适反应pH为6.0，在pH 3.0‑10.0的条件下处理2h，相对酶活力仍然保持在 80％以上。 [0014] 有益效果： 1、本发明提供了一种适于工业化生产木聚糖酶的绿色木霉菌株，并优化了相应的 发酵机制。该发酵机制，发酵活力更高、制造成本更低，发酵酶活力平均在 29000U/mL以上。 [0015] 2、本发明提供了一种耐热、耐酸碱、酶活力高、性能稳定而且生产成本较低的木聚糖酶产品，本产品利于保藏，运输方便，酶活稳定性好且应用方便，极大增强了颗粒的湿热能力，避免了液体酶制剂诸多的问题，可广泛用于食品、饲料、造纸、医疗等领域，具有广阔的应用前景。 [0016] 附图说明： 图1最适作用温度曲线； 图2最适作用pH曲线； 图3温度稳定性曲线； 图4 pH稳定性曲线。 [0017] 具体实施方式： 为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本 专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。 [0018] 实施例1菌株的诱变育种 1、培养基 斜面活化培养基：PDA培养基。 [0019] 马铃薯洗净去皮，称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸20‑30分钟，用八层纱布过滤，添加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装并加塞包扎，121℃灭菌20分钟。 [0020] 种子活化培养基：麸皮2%，葡萄糖1%，(NH4)2SO40.4%，MgSO40.2%，K2HPO40.1%，KCl 0.05%，FeSO40.01%，其余为水，pH5.0‑5.2。 [0021] 初筛培养基：羧甲基纤维素钠1%，KH2PO40.5%，FeSO40.01%，MgSO40.2%，蛋白胨1%，去氧胆酸钠0.2%，刚果红 0.03%，琼脂粉2.0%，其余为水，pH5.0‑5.2。 [0022] 摇瓶发酵培养基：玉米芯3%，麸皮2.0%，葡萄糖3%，棉籽蛋白1%，KH2PO40.3%，MgSO40.2%，CaCl20.05%，(NH4)2SO40.4%，pH5.0‑5.2。 [0023] 2、菌悬液制备： 用生理盐水将实验室保藏的斜面培养基中的绿色木霉孢子洗脱下来，置于三角瓶 中并放入玻璃珠，摇床上180r/min振荡1.5h，使菌体的分散率达到90%以上，用无菌纱布过滤孢子悬液，用血球计数板计算孢子个数，用生理盐水稀释一定倍数，使孢子浓度保持在 7 8 10‑10cfu/ml。 [0024] 3、诱变的致死率和正突变率 致死率（％）=[（对照组平板菌落数‑诱变后平板菌落数）/对照组平板菌落数]× 100% 正突变率（%）=大于对照组水解圈直径的突变株个数/总菌落数×100% 4、快中子辐照诱变 菌株诱变处理：将菌悬液置于无菌培养皿中，以剂量率为0.003Gy/s，垂直距离为 10cm，剂量为0.2Gy，0.3Gy，0.5Gy，0.7Gy，1Gy，1.5Gy，2.25Gy处理菌悬液，将照射处理后的‑3 ‑6 菌悬液稀释至10 至10 ，从不同稀释倍数的菌悬液中分别吸取各0.2ml涂布于初筛培养基，置于34℃培养箱中培养，以未经辐照诱变处理菌液稀释涂平板作对照。 [0025] 表1 快中子辐照诱变菌株的致死率和正突变率 [0026] 如表所示，随着照射剂量的增加致死率也在逐渐增加，正突变率先上升后降低，在剂量1Gy时正突变率最高为45.2%，致死率为39.6%。确定照射剂量1Gy。 [0027] 5、硫酸二乙酯（DES）诱变 取1ml硫酸二乙酯加入9ml 95%乙醇中制成硫酸二乙酯稀释液，将稀释的硫酸二乙 酯溶液与菌悬液按一定的比例进行混合（硫酸二乙酯稀释液:菌悬液），分别混合成：1:400， 1:250，1:150，1:80，30℃震荡处理15min，20min，30min，40min，加入25%的硫代硫酸钠溶液‑4 ‑5 ‑6 终止反应，依次稀释至10 、10 、10 ，从中各取0.2mL涂布于初筛培养基中，置于34℃培养箱中培养，以未经硫酸二乙酯诱变处理菌液稀释涂平板作对照。 [0028] 表2 硫酸二乙酯诱变菌株致死率和正突变率 [0029] 如表所示，DES溶液/菌悬液为1:250，诱变时间20min，正突变率最高为43.3%。确定硫酸二乙酯诱变最优条件：DES溶液/菌悬液为1:250，诱变时间20min。 [0030] 6、复合诱变 经过以上的两种诱变，确定两种诱变的诱变方式，结合快中子诱变及硫酸二乙酯 诱变进行复合诱变，选取7株水解圈大的突变株，进行摇瓶培养48h，测定木聚糖酶酶活性，以原始出发菌株为对照，结果如表所示。 [0031] 表3 7株突变菌株产木聚糖酶活性 [0032] 经过复合诱变筛选出诱变种子3号，酶活达到4258U/ml，较原始菌株提高了3.4倍。 [0033] 7、遗传稳定性 以此菌株为研究对象确定其遗传稳定性，摇瓶发酵进行产酶活力实验，培养周期 48h，连续传代8次，酶活力保持稳定，结果如表4所示。实验结果表明遗传性状稳定，此菌株可以大规模应用于工业化生产，并将其命名为绿色木霉（Trichoderma viride）TP‑1002，并于2022年11月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.40415。 [0034] 表4 菌株遗传稳定性结果 [0035] 实施例2本发明木聚糖酶活力测定和定义 1、木聚糖酶酶活单位定义 在50℃、pH为5.5的条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活 单位。 [0036] 2、酶活测定方法 取2ml经过稀释的酶液（50℃平衡10min），加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试 剂，电磁振荡3s‑5s。然后加入2mL浓度为1%的木聚糖底物(pH 5.5乙酸‑乙酸钠缓冲液配制)，50℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，电磁振荡3s‑5s。以标准空白样（乙酸‑乙酸钠缓冲溶液4.0mL，DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min冷却，定容至25mL）为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。 [0037] 取2ml经过稀释的酶液（50℃平衡10min），加入到刻度试管中，再加入2mL浓度为1%的木聚糖底物(pH 5.5乙酸‑乙酸钠缓冲液配制)，电磁振荡3s‑5s，50℃精确保温30min。加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s‑5s终止酶解反应。沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，电磁振荡3s‑5s。以标准空白样（乙酸‑乙酸钠缓冲溶液4.0mL，DNS试剂 5.0mL，沸水浴加热5min冷却，定容至25mL）为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。 [0038] 酶活计算公式： [0039] 式中：XD为酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白样吸光度；K为木糖标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。 [0040] 实施例3绿色木霉TP‑1002液体深层发酵产木聚糖酶及产品处理 1、种子罐培养 种子罐培养基：葡萄糖 1.5%，麸皮 2.5%，(NH4)2SO41%，MgSO40.03%，CaCl20.1%，pH5.0，其余为水。 [0041] 种子罐灭菌工艺：121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30min。 [0042] 种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量6%的比例接入种子罐中进行培养，培养条件为温度34℃、罐压0.06Mpa、风量0.3vvm、转速400rpm，培养过程中pH下降到4.4时，补氨控制pH 4.5，培养时间24h，镜检菌体较多。 [0043] 2、发酵罐培养 发酵罐产酶培养基：玉米芯粉 3%，葡萄糖 2.5%，麸皮 1%，MgSO40.03%，(NH4) 2SO40.5%，K2HPO40.5%，pH 5.0，其余为水。 [0044] 发酵罐灭菌工艺：121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌35min。 [0045] 发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照移种量10%的比例移入发酵罐，培养条件为初始pH5.0，温度34℃，罐压0.06Mpa，风量：第 0‑24h为0.25vvm，第25‑48h为0.5vvm、第49h‑放罐为1.0vvm，转速600rpm，发酵期间pH低于4.5时，补氨控制pH 4.5。 [0046] 3、补料培养 补料培养基：葡萄糖 60%，硫酸铵 0.5%，KH2PO40.4%，玉米浆 4%，其余为水，pH 5.0。 [0047] 补料罐灭菌工艺：葡萄糖单独灭菌，121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30min； 其余的原料一起灭菌，121‑123℃，0.11‑0.12MPa条件下，灭菌30min，灭菌冷却至40℃后混合均匀。 [0048] 培养周期10h后补料控制溶氧20%，一直培养至发酵结束。 [0049] 4、发酵结束 酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为150‑160h。准备放罐提取。 [0050] 表5 50L发酵罐发酵实验结果 [0051] 从表5发酵实验结果可知，发酵液酶活稳定，发酵酶活平均达到29000U/mL以上。 [0052] 5、木聚糖酶的提取精制 （1）用1mol/L氢氧化钠调节发酵液pH7.0，加入3%珍珠岩助滤剂，进行板框压滤； （2）将压滤液中加入2%硅藻土进行精滤澄清； （3）用20KDa超滤膜对精滤液进行超滤浓缩； （4）得到超滤浓缩液，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到液体木聚糖成品酶制 剂。 [0053] 6、木聚糖酶的包衣造粒 酶制剂的活性受多种因素的影响，为了降低酶活性的损耗和提高使用的便利性， 对酶制剂进行造粒处理。 [0054] （1）精确量取液体木聚糖酶，加入液体木聚糖酶重量50%玉米淀粉，15%滑石粉，5%麦芽糊精，把以上物料在混匀机中充分混匀。 [0055] （2）放入旋压挤出机中，挤出长条状物料，筛网孔直径为0.6 mm。 [0056] （3）把挤出的长条状物料倒入滚圆机中，调节滚圆机于合适转速使其充分切断，使酶颗粒呈现球状。 [0057] （4）把球状酶制剂颗粒放到垂直式鼓风干燥机中进行鼓风干燥，鼓风温度50℃，物料温度35℃，鼓风干燥30min成型，得到木聚糖酶颗粒成品。 [0058] 颗粒成品的优点是：利于保藏，运输方便，酶活稳定性好且应用方便，极大增强了颗粒的湿热能力，避免了液体酶制剂诸多的问题。 [0059] 实施例4木聚糖酶最适反应温度 取实施例3批次1制备的液体木聚糖成品酶制剂，以正常条件pH 5.5，分别在50、 55、60、65、70、75、80、85、90℃条件下测定木聚糖酶活力，以65℃时的酶活力为100%，分别计算相对酶活。结果如图1所示，最适反应温度为65℃，在80℃时也能保持85%以上的活力。由实验结果可知，该突变菌株所产木聚糖酶的最适反应温度明显高于现有技术其他来源的木聚糖酶，具有很大的市场应用价值，在工业生产中具有很好的应用价值。 [0060] 实施例5木聚糖酶最适反应pH 取实施例3批次1制备的液体木聚糖成品酶制剂，在温度为65℃条件下，分别测定 木聚糖酶在pH值为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0条件下的木聚糖酶活力，以pH6.0时的酶活力为100%分别计算相对酶活。测定结果如图2所示，木聚糖酶的酶活在pH为6.0附近时酶活最高。 [0061] 实施例6木聚糖酶热稳定性 取实施例3批次1制备的液体木聚糖成品酶制剂，将木聚糖酶液置于80℃条件下保 温处理，定时取样测定酶活，实验结果均用相对酶活表示，即初始酶活设定为100%酶活，采用实施例2所述的方法测定酶活，确定在不同时间保温后剩余的木聚糖酶的相对酶活。其实验结果如图3所示。在80℃条件下保温2.5h，仍能保持85%以上酶活，热稳定性好。 [0062] 实施例7木聚糖酶耐酸碱性 取实施例3批次1制备的液体木聚糖成品酶制剂，分别用NaOH或HCl将木聚糖酶的 pH调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6 .0、7.0、8 .0、9.0、10 .0、11.0、12.0，分别置于室温条件下静置2h，静置结束后采用实施例2所述的方法测定酶活，并以未用酸或碱处理之前酶活力为 100％计算相对酶活。测定结果如图4所示，在pH 3.0‑10.0的条件下处理2h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。 [0063] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。