紫苏蛋白在制备提高巴沙鱼免疫力的饲料中的应用 发明领域 [0001] 本申请属于饲料领域和蛋白领域，具体地，本申请提供了紫苏蛋白在制备提高巴沙鱼免疫力的饲料中的应用。 背景技术 [0002] 巴沙鱼属于鲶形目，原产于越南湄公河流域。该鱼产量大，肉质鲜美且无肌间小刺，是一种优良的淡水食用鱼类。巴沙鱼是越南水产品中出口量最大的品种，在我国南方各省也多有养殖。巴沙鱼对水质、氧气要求较低，且抗细菌感染能力较强，实际养殖中对其危害较重的是腮部或皮肤的寄生虫，如车轮虫、指环虫的感染。 [0003] 紫苏为唇形科紫苏属的草本植物，主要分布在东亚和南亚地区。紫苏有着悠久的药用和食用历史，可用于制备油、香料，中医学上认为其有解表散寒、行气宽中、安胎等作用。现代医药研究则发现了紫苏及其中的很多成分有抗菌消炎、抗肿瘤、镇痛等效果。 [0004] 紫苏最常见的用途为榨油，紫苏榨油后剩余的紫苏粕中含有大量紫苏蛋白，目前主要用作饲料和肥料，甚至遗弃。基于紫苏已知的药用用途，可以对紫苏蛋白进行深加工和功能发掘，开发饲料用或药用成分。 发明内容 [0005] 一方面，本申请提供了紫苏蛋白在制备提高巴沙鱼免疫力的饲料中的应用。 [0006] 另一方面，本申请提供了紫苏蛋白在制备提高巴沙鱼免疫力的药物中的应用。 [0007] 另一方面，本申请提供了紫苏蛋白在制备预防寄生虫感染的药物中的应用。 [0008] 进一步地，所述寄生虫为车轮虫。 [0009] 进一步地，所述紫苏蛋白为经过木瓜蛋白酶或胰蛋白酶酶解的紫苏蛋白。 [0010] 进一步地，所述经过木瓜蛋白酶或胰蛋白酶酶解的紫苏蛋白的制备方法为：使用水为溶剂配制包含100mg/mL紫苏蛋白，500U/mL木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，pH 7‑7.5的酶解用组合物；将酶解用组合物在45‑50℃下，酶解4‑5小时。 [0011] 进一步地，所述紫苏蛋白的制备方法为：将脱脂紫苏粕粉碎后加入20倍脱脂紫苏粕质量的水中，混合；调pH至10；60‑70℃水浴中处理1小时；离心取上清液；将上清液pH调至 4.5；离心取沉淀；将沉淀水洗后冷冻干燥得到紫苏蛋白。 [0012] 进一步地，所述紫苏蛋白为序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的紫苏蛋白免疫肽。 [0013] 进一步地，所述饲料中包含配合饲料。 [0014] 所述配合饲料可以为各种市售配合饲料或自制配合饲料，可以为粉状、颗粒状等形式。 [0015] 进一步地，所述药物中包含兽药中可接受的辅料。 [0016] 所述兽药中可接受的辅料本领域技术人员可以根据兽药学书籍以及对兽药和家禽类产品的相关监管规定确定具体种类，包括但不限于填充剂、分散剂、粘合剂、润滑剂、调味剂、包衣剂、溶剂、助溶剂、pH调节剂、渗透压调节剂等。 [0017] 本申请还提供了巴沙鱼用饲料，所述饲料包含上述紫苏蛋白。 [0018] 本申请还提供了提高巴沙鱼免疫力，抗寄生虫感染的药物，所述药物包含上述紫苏蛋白。 [0019] 紫苏为可用于食品原料，其经过食品用酶酶解产物的安全性较有保证，本申请的酶解物和免疫肽为巴沙鱼养殖提供了一类新的饲料添加剂和药物选择。 附图说明 [0020] 图1为免疫肽ZS‑6的质谱图； [0021] 图2为免疫肽ZS‑7的质谱图； [0022] 图3为使用免疫肽和酶解物喂养巴沙鱼后对鱼体非特异性免疫(补体C3、IgM)的影响。 具体实施方式 [0023] 实施例1紫苏蛋白酶解物的制备 [0024] 使用来自某油脂生产企业的脱脂紫苏粕为原料生产紫苏蛋白。将脱脂紫苏粕粉碎后加入20倍脱脂紫苏粕质量的水中，混合；调pH至10；60‑70℃水浴中处理1小时；离心取上清液；将上清液pH调至4.5；离心取沉淀；将沉淀水洗后冷冻干燥得到紫苏蛋白。 [0025] 使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶(夏盛，食品级)酶解实施例1获得的紫苏蛋白。并进一步浓缩、冻干得到酶解物，具体条件如下： [0026] 表1酶解条件 [0027] [0028] 实施例2巴沙鱼养殖实验 [0029] 实验地点和条件： [0030] 实验地点位于广西壮族自治区南宁市郊区某养殖场，实验时间为6‑7月份，养殖池为经过充分消毒的混凝土池，养殖用水为经过晾晒和充气的地下水。 [0031] 实验用鱼： [0032] 使用在室内育种玻璃池中养育的巴沙鱼作为实验对象以保证基本无寄生虫干扰； 选用感染严重的鱼池中人工鉴定出的，腮和皮肤上有明显车轮虫感染的巴沙鱼作为病鱼； 所用巴沙鱼规格均为1kg±100g，接近商品规格。 [0033] 饲养方案： [0034] 按照低于常规养殖密度的密度在每个约20平米的养殖池中放养85条健康巴沙鱼，使用市售“宜海”牌巴沙鱼配合饲料(添加0.1％重量紫苏蛋白酶解物)，按照常规成鱼方式喂养(日投喂量2％)、管理和调控条件，但不使用硫酸铜、阿维菌素等抗寄生虫药物。详见表 2： [0035] 表2各养殖池的实验条件 [0036] [0037] 养殖60日时间，之后统计各池巴沙鱼死亡数量，并逐一人工检查巴沙鱼的感染情况(以人工检查腮和皮肤上有3处以上寄生虫感染的白斑、鳞片脱落、出血为染病)。 [0038] 结果表明，由于实验前消毒充分，饲养密度较低，对照养殖池1中巴沙鱼全部存活，且均无明显寄生虫感染症状，因此其他鱼池中的感染基本可以认为是车轮虫导致；入染病鱼的对照养殖池2中巴沙鱼死亡32条，且存活鱼的染病率达到81.1％；养殖池4、5中的情况与养殖池2类似；养殖池3、6中的情况则明显较好，分别仅有11、8条死亡，余下鱼的患病率不足15％。 [0039] 表3养殖实验结果 [0040] [0041] [0042] 因此，紫苏蛋白木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物用于饲料中可以增加巴沙鱼的免疫力，提高对寄生虫的抗病性能。 [0043] 从后续实际使用中看，紫苏蛋白木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物对指环虫也有较好的抑制效果。 [0044] 实施例3免疫肽的鉴定 [0045] 为明确效果并获得有更好饲用、药用价值的产品，申请人尝试在紫苏蛋白木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物中鉴定功能肽。 [0046] 将酶解物使用3kDa的超滤管离心；过柱除盐。使用LC‑MS/MS方法分离并鉴定：液相为岛津LC‑20AD(自装C18柱75μm×25cm；流动相1:2％ACN，0.2％甲酸，流动相2:98％CAN， 0.2％甲酸；柱流量为300nL/min，柱温为40℃)，直连质谱仪(赛默飞世尔MALDI‑TOP，一级扫 6 描范围：200‑1800m/z，AGC target：3e，分辨率：70000，最大注入时间：50ms)： [0047] 质谱结果使用MaxQuant 1.5.3.30分析，Mascot 2.3.02鉴定，对Uniprot数据库进行分析，在紫苏蛋白木瓜蛋白酶酶解物中和紫苏蛋白胰蛋白酶酶解物各获得2条免疫活性肽。 [0048] 由于预测毒性和合成难度不理想，去除了木瓜蛋白酶酶解物中的2条活性肽。将紫苏蛋白胰蛋白酶酶解物的2条活性肽委托NovoPro(上海纽普)固相树脂法(Fmoc)合成，合成品质谱图如图1和图2所示。 [0049] SEQ ID NO.1：IVAWSP； [0050] SEQ ID NO.2：FGLVQPG。 [0051] 实施例4免疫肽的效果验证 [0052] 设置4个实验池，每个室内育种玻璃池(2m×1.5m×0.7m)中放养500g±100g的巴沙鱼亚成鱼10条。使用市售“宜海”牌巴沙鱼配合饲料(不添加其他成分、添加0.005％重量2种合成多肽、0.1％重量紫苏蛋白胰蛋白酶酶解物)，按照常规成鱼方式喂养(日投喂量 2％)、管理和调控条件。 [0053] 表2各养殖池的实验条件 [0054] [0055] 饲养30日后，4组鱼均无死亡，杀鱼后取各组鱼的肠道样品(体表样本受环境影响大，因此使用具有大量上皮细胞且能代表消化道系统免疫能力的肠组织)，混合后加入10倍质量PBS(pH 7.0)破碎匀浆并离心取上清。使用天恩泽的BAC法蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，使用Klamar的IgM和补体3检测试剂盒(比浊法)来检测IgM和补体3含量(3份样品平均值)。 [0056] 结果如图3所示，结果显示，饲料中添加酶解物二十分之一质量的ZS‑6、ZS‑7即可达到比酶解物更明显的增强鱼体非特异性免疫的效果。设计适合的基因工程菌大量表达后有望用作饲料或药物成分。