[0001] 本发明属于降解多环芳烃微生物领域，具体地，涉及一种副干酪乳杆菌、含有该副干酪乳杆菌的菌剂，及其所述副干酪乳杆菌和菌剂在降解多环芳烃中的应用。

[0002] 多环芳烃是指含两个或两个以上苯环的芳烃，简称PAHs。根据苯环的连接方式不同，它们主要可分为两大类。一类是非稠环型，其中包括联苯及联多苯和多苯代脂肪烃。苯环间以σ键连接成的化合物称为联苯。联苯类衍生物及联多苯类化合物都是以联苯为母体命名。多苯代脂肪烃类是由若干个苯环取代脂肪烃中的氢原子而形成的化合物。此类化合物以苯基作为取代基、脂肪烃为母体来命名。联苯及联多苯和多苯代脂肪烃这几种非稠环型多环芳烃的结构和性质与单环芳烃相似。另一类是稠环型，即两个碳原子为两个苯环所共有。例如萘，萘的分子式是C10H8，它是两个苯环共用相邻两个碳原子稠合而成。萘是白色片状晶体，熔点80℃，沸点218℃，不溶于水，易溶于热的酒精、乙醚等有机溶剂。易挥发、易升华、有特殊气味。萘是煤焦油中含量最多的化合物，在高温煤焦油中约含10％。蒽的分子式为C14H10，由三个苯环稠合而成。蒽存在于煤焦油中，含量约为0.25％。菲也存在于煤焦油中，与蒽互为同分异构体。

[0003] 多环芳烃的来源分为自然源和人为源。自然源主要来自陆地、水生植物和微生物的生物合成过程，另外，森林、草原的天然火灾及火山的喷发物和化石燃料、木质素和底泥中也存在多环芳烃；人为源主要是由各种矿物燃料(如煤、石油和天然气等)、木材、纸以及其他含碳氢化合物的不完全燃烧或在还原条件下热解形成的。

[0004] 与其他全球禁止生产和使用的持久性有机污染物不同，大多数PAHs的主要释放源通常与人类活动息息相关。因此，目前多环芳烃在环境中的存在广为大家所关注。多环芳烃普遍存在于各种环境中，它们主要通过大气沉积、河流径流、城市和工业废水以及运输过程泄漏直接进入地表水。水是多环芳烃在环境中迁移的重要介质，地表径流、大气沉降、土壤‑泥沙和气‑水界面输入交换都是其扩散的有效方式。这种污染物在水中溶解度极低并且具有很强的亲和力与生化持久性，对海洋沉积物的吸附作用强，往往能在自然界的不同介质中稳定存在。然而，当沉积物经由外力作用，如波浪，潮汐和洋流，拖网捕鱼，船舶交通与水利工程运营等时，沉积物中的污染物质被释放，使污染加剧。

[0005] 绝大部分的多环芳烃对生物体都存在强烈的毒副作用包括免疫毒性以及致癌性。其中，苯并[a]芘已被国际原子能机构分类为第1组，对人类有致癌作用。其他的多环芳烃被分为2A组和2B组。同时，多环芳烃有很高的生物积累性，这使不良影响更为严重。即使微量也会导致各种疾病对人体造成严重危害。越来越多的证据表明，长期暴露于多环芳烃环境中不仅会导致某些特定的癌症，同时也会导致某些其他疾病，如肥胖和2型糖尿病(T2D)等。

[0006] PAHs污染的治理传统上采用物理法及化学法。常规利用温度、电动力及氧化还原的方法，具有周期短见效快的优点，但是其耗能高且对原场地破坏明显的缺点不容忽视。微生物降解法因具有较其他降解方法成本更低、操作更方便等优点，逐渐成为PAHs降解的主要研究方向。

[0007] 在自然环境之中，微生物对有机物的分解转换机制是非人为干涉条件下有机污染物去除的最主要方法，这种降解转化机制就是人为使用微生物法处理有机污染物的核心思路。当场地的污染物为链状石油烃类物质或有机农药时，微生物法往往有较好的处理效果，但是当遇到具有较高疏水性的PAHs时，微生物法的效果常常不尽如人意。为达到更好的修复效果，不单单要完善修复方法，还要明确微生物降解的自身特性，筛选并开发与修复目标污染物的结构特征、物理化学性质相契合的微生物，以达到更佳的降解效果。

[0025] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0026] 本发明提供一种副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，所述副干酪乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.24463。本发明提供的副干酪乳杆菌(保藏编号CGMCC No.24463)为兼性厌氧菌，革兰氏阳性，是从天津某多环芳烃污染土壤中筛选分离获得。

[0027] 具体筛选分离步骤为：

[0028] (1)驯化

[0029] 取3～5g土壤加入已灭菌的无机盐培养基中，培养基的装液量为150mL/250mL三角瓶，再加入菲作为唯一碳源，振荡摇匀，置于30℃，150r/min摇瓶柜内培养。5d后取培养瓶中菌液1mL进行转接，至少重复3次。

[0030] (2)分离

[0031] 将驯化后的菌液稀释至适宜稀释度后采用平板划线法对菌液划线分离。每个浓度梯度作3个平行样。划线后将培养皿置于培养箱中30℃下培养3d。

[0032] (3)纯化

[0033] 观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色、性状等的不同，拍照片保存。对未形成单菌的菌落进行反复纯化，直至在同一平板中的菌落大小形态均一。

[0034] 将纯化得到的副干酪乳杆菌(命名为F1)送至北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行16S rDNA菌株鉴定，菌种的基因拼接后的序列与NCBI比对结果显示该菌株与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei strain)的基因序列的同源性为100％，分离菌株F1被鉴定为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

[0035] 本发明提供的副干酪乳杆菌F1菌落呈乳白色，为圆形，直径大多1.0mm以上，表面光滑、隆起，边缘整齐。

[0036] 本发明的发明人研究发现：该副干酪乳杆菌(保藏编号CGMCCNo.24463)对各种类型的多环芳烃均具有较好的降解活性；将含副干酪乳杆菌(保藏编号CGMCC No.24463)的菌剂加入到多环芳烃污染的土壤或地下水中，可修复土壤或地下水的多环芳烃污染。

[0037] 所述菌剂中还可以含有辅料。所述辅料可以为不会对副干酪乳杆菌的活性造成影响的、本领域常用的辅料。

[0038] 所述菌剂的制备方法可以为本领域常规的制备方法。优选的情况下，所述制备方法包括：将如上所述的副干酪乳杆菌活化后在培养基中进行培养，得到菌液原液；将菌液原9
液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液(菌悬液中的活菌数通常为10cfu/mL以上)，得到菌剂。其中，所述培养基可以为本领域常规用于培养副干酪乳杆菌的培养基。

[0039] 所述多环芳烃是指含有2个或2个以上苯环的芳烃，既包括稠环型多环芳烃，也包括非稠环型多环芳烃。

[0040] 所述稠环型多环芳烃包括但不限于萘、蒽、菲、芘、 苯并芘、苯并蒽、苯并荧蒽、茚并芘中的至少一种。所述苯并芘包括如苯并[a]芘、苯并[e]芘。所述苯并蒽包括如苯并[a]蒽、二苯并[a,h]蒽。所述茚并芘包括如茚并[1,2,3‑cd]芘。

[0041] 所述非稠环型多环芳烃包括但不限于联苯(即联二苯)、联多苯和多苯代脂肪烃的至少一种。所述联多苯可以为联三苯等，所述多苯代脂肪烃可以为二苯甲烷、二苯乙烷等。

[0042] 本发明的副干酪乳杆菌和菌剂适用于含多环芳烃的各类污染物，包括但不限于含多环芳烃的土壤或含多环芳烃的地下水。

[0043] 本发明的一些实施方式中，当所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的土壤时，以多环芳烃计，所述多环芳烃的含量为2‑1000mg/kg土壤，例如可以为2mg/kg土壤、5mg/kg土壤、10mg/kg土壤、50mg/kg土壤、100mg/kg土壤、200mg/kg土壤、300mg/kg土壤、500mg/kg土壤、700mg/kg土壤、1000mg/kg土壤中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。其中，所述土壤重量以干基计。

[0044] 本发明中，所述副干酪乳杆菌F1或所述菌剂的使用量可以在较宽的范围内进行选择。本发明的一些实施方式中，所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的土壤时，所述副干7 9
酪乳杆菌F1或所述菌剂的用量使得所述含多环芳烃的土壤中活菌数为10 ‑10 cfu/g。其中，所述土壤重量以干基计。

[0045] 本发明的一些实施方式中，当所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的地下水时，以多环芳烃计，所述多环芳烃的浓度为2‑1000mg/L地下水，例如可以为2mg/L地下水、5mg/L地下水、10mg/L地下水、50mg/L地下水、100mg/L地下水、200mg/L地下水、300mg/L地下水、500mg/L地下水、700mg/L地下水、1000mg/L地下水中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。

[0046] 本发明的一些实施方式中，所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的地下水时，7
所述副干酪乳杆菌F1或所述菌剂的用量使得所述含多环芳烃的地下水中活菌数为10 ‑
9
10cfu/mL。

[0047] 将副干酪乳杆菌F1或菌剂与含有多环芳烃的污染物接触的条件通常为自然环境条件，例如温度为15‑40℃，本发明的菌种可以在较宽的pH值为5‑10的范围内发挥降解多环芳烃的作用。

[0048] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的范围并不局限于这些实施例。

[0049] 石油烃污染土壤生物修复方法的土壤模式评价方法

[0050] 土壤石油烃污染生物修复方法的好坏，最终要通过石油烃在土壤中的降解效果来评价，因此建立了石油烃污染土壤生物修复方法的土壤模式评价方法。模式评价方法为：①将菌剂在目标污染物作为唯一碳源的无机盐培养基中富集；②离心分离，得到富集菌剂；③将菌剂与保水剂、土壤调节剂、营养物质一起投入到土壤中；④在土壤中加入目标污染物；⑤定期检测土壤石油烃含量及土壤细菌总数，计算石油烃的降解效果。

[0051] 具体操作步骤为：

[0052] 1.取1.5mL菌液于装有150mL无机盐培养基的三角瓶中，再加入目标污染物，150r/min振荡5‑10天(视菌量决定)，得到富集菌液。

[0053] 2.将得到的富集菌液8000r/min离心固液分离，弃去上层培养基溶液，加入无机盐培养基100mL，充分振荡后再次8000r/min离心固液分离，弃去上层溶液，留底层固体备用。

[0054] 3.将保水剂、土壤调节剂、营养物质和底层固体加入到土壤中，充分搅拌，同时加入去离子水，使土壤含水量维持在某一范围。

[0055] 4.向土壤中加入目标污染物，搅拌均匀。

[0056] 5.每周检测土壤目标污染物含量以及土壤细菌总数。

[0057] 6.每两天补一次水，保持土壤含水量在某一范围，每周翻土1‑3次。

[0058] 无机盐培养基：NH4Cl 0.67g、NaNO3 1.06g、MgSO4·7H2O 0.1g、CaCl20.1g、K2HPO4·3H2O 1.5g、KH2PO4 0.5g、FeCl3·6H2O 0.1g、去离子水1L，pH值7.0～7.5。

[0059] 分析方法

[0060] 异养菌测定方法参照《工业循环冷却水水质分析方法》GB/T14643.1‑1993标准平皿计数法。

[0061] 土壤多环芳烃含量测定方法参照《土壤和沉积物半挥发性有机物的测定气相色谱‑质谱法》HJ 834‑2017。其中，使用二氯甲烷‑丙酮混合溶液对多环芳烃进行加压流体萃取。当定容体积为1.0mL，进样体积为1.0μL时，测定多环芳烃的方法检出限为0.06‑0.3mg/kg，测定下限为0.24‑1.20mg/kg。

[0062] 土壤细菌总数测定方法

[0063] 土壤中细菌总数的测定采用平板培养菌落计数法，土壤细菌的培养基选择肉膏蛋白胨培养基。

[0064] 具体测定步骤为：

[0065] 称取10g土壤样品，放入盛有90mL无菌去离子水的三角瓶中，置于摇床上以160次/min的速度室温振荡4h，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中‑1分离出来。此为10 土壤悬液，吸取1mL此土壤悬液于9mL含8.5g/L NaCl的无菌水中，用无菌‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑8
吸管吹吸3次混匀，制成10 土壤悬液。以此类推依次制成10 、10 、10 、10 、10 、10 不同稀释度的土壤悬液。选择适当的稀释度后通过混合平板计数法测定土壤悬液的细菌总数。

[0066] 土壤中细菌总数x(个/g)，按照以下公式进行计算。

[0067]

[0068] 式中：

[0069] x——土壤细菌总数，个/g；

[0070] e——土壤悬液的细菌总数，个/mL；

[0071] V——土壤悬液的体积，mL；

[0072] m——取样量，g；

[0073] w——土壤含水率，％。

[0074] 肉膏蛋白胨培养基组成：NaCl 10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、琼脂18g，去离子水1L，pH值7.2～7.4。

[0075] 以下实施例和对比例均采用如下试验方法：

[0076] 所用土壤为250℃灭菌24h的干燥土壤。加入锯末，改良土壤透气性；加入聚丙烯酸，提高土壤保水性；加入尿素，补充土壤N源。混合均匀。将菌液固体部分与去离子水充分混合，加入到土壤中，最后将目标污染物多环芳烃溶于3mL丙酮，加入到土壤中。土壤环境温度范围为18‑23℃。

[0077] 每周翻土一次，并补去离子水至土壤含水量为初始值，除此之外不采取其他干预措施。

[0078] 所述菌液固体部分的获取方法包括：(1)取1.5mL菌液于装有150mL无机盐培养基的三角瓶中，再加入目标污染物作为唯一碳源，置于30℃、150r/min摇瓶柜内恒温振荡5‑10天，得到OD600为1.0的富集菌液。(2)将得到的富集菌液8000r/min离心固液分离，弃去上层培养基溶液，加入无机盐培养基100mL，充分振荡后再次8000r/min离心固液分离，弃去上层溶液，得到所述菌液固体部分。

[0079] 无机盐培养基组成：NH4Cl 0.67g、NaNO3 1.06g、MgSO4·7H2O 0.1g、CaCl2 0.1g、K2HPO4·3H2O 1.5g、KH2PO4 0.5g、FeCl3·6H2O 0.1g、去离子水1L，pH值7.0～7.5。

[0080] 以下实施例和对比例中：

[0081] 联二苯购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0082] 1,4‑联三苯购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0083] 二苯甲烷购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0084] 萘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0085] 蒽购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0086] 菲购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0087] 芘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0088] 苯并[a]芘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0089] 寡养单胞菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC1.6393；

[0090] 不动杆菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC1.10395T；

[0091] 迪茨氏菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号CGMCC1.6332T。

[0092] 实施例1

[0093] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg联二苯。

[0094] 实施例2

[0095] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg 1,4‑联三苯。

[0096] 实施例3

[0097] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg二苯甲烷。

[0098] 实施例4

[0099] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg萘。

[0100] 实施例5

[0101] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg蒽。

[0102] 实施例6

[0103] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg菲。

[0104] 实施例7

[0105] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg芘。

[0106] 实施例8

[0107] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取副干酪乳杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg苯并[a]芘。

[0108] 对比例1

[0109] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取寡养单胞菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg联二苯。

[0110] 对比例2

[0111] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取不动杆菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg二苯甲烷。

[0112] 对比例3

[0113] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取迪茨氏菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg菲。

[0114] 对比例4

[0115] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，取迪茨氏菌混于300g去离子水中，形成水溶液3，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2、3，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg苯并[a]芘。

[0116] 对比例5

[0117] 称取6g聚丙烯酸溶于200g去离子水中，形成水溶液1，称取0.96g尿素溶于100g去离子水中，形成水溶液2，称取45g锯末，混于2400g土壤中，然后加入水溶液1、2和300g去离子水，混合均匀。向混合均匀的土壤中加入150mg苯并[a]芘。

[0118] 测试例1

[0119] 定期取以上实施例和对比例土样，测量土样中残留的多环芳烃含量，考察多环芳烃降解情况，结果见表1。

[0120] 表1实施例及对比例土样多环芳烃含量

[0121]  初始 7d 14d 21d 28d 35d 42d 49d
实施例1 50 48.1 43.8 29.4 17.6 8 2.3 0.3
实施例2 50 48.5 44.1 32.4 17.8 9.1 4.1 1.7
实施例3 50 48.5 44.5 31.8 18.6 10.8 5.4 1.9
实施例4 50 48.7 45.8 34.2 20.3 12.6 7.4 2.3
实施例5 50 48.8 46.1 33.8 21.4 13.2 9.8 2.5
实施例6 50 48.4 46.2 35.6 21.5 13.5 9.8 2.5
实施例7 50 49.6 49.2 44.8 38.1 29.8 22.4 15.0
实施例8 50 49.8 49.4 46.2 41.0 33.4 28.4 22.4
对比例1 50 49.8 48.1 43.9 39.6 38.1 36.4 34.3
对比例2 50 49.9 48.6 44.0 39.2 38.2 37.4 35.9
对比例3 50 49.9 48.9 46.7 42.5 41.8 40.7 39.9
对比例4 50 49.9 49.8 48.7 47.6 47.1 47.0 47.1
对比例5 50 49.9 49.9 49.8 49.6 49.2 49.1 49.1

[0122] 注：多环芳烃含量单位为mg/kg。

[0123] 由表1的结果可以看出，本发明的副干酪乳杆菌对于多种类型的多环芳烃均具有明显的降解效果，且优于对比菌种。

[0124] 测试例2

[0125] 定期取以上实施例和对比例土样，测量土样细菌总数，考察微生物生长情况，结果见表2。

[0126] 表2实施例及对比例土壤微生物生长情况

[0127]  初始 7d 14d 21d 28d 35d 42d 49d
实施例1 37 135 657 1358 971 758 297 124
实施例2 38 124 599 1247 912 701 288 136
实施例3 35 130 641 1178 863 640 325 150
实施例4 35 112 495 1046 579 376 298 145
实施例5 36 108 481 1033 531 344 284 123
实施例6 37 116 452 1002 458 325 278 117
实施例7 32 86 245 699 430 298 239 98
实施例8 38 74 213 644 398 245 216 69
对比例1 39 119 478 1095 795 567 221 89
对比例2 38 114 465 937 659 463 216 99
对比例3 35 102 298 682 203 186 145 63
对比例4 38 65 117 367 198 116 86 41
对比例5 0.2 0.3 0.9 8 12 7 4.1 0.4

[0128] 注：细菌总数单位为106cfu/g土壤。

[0129] 由表2的结果可以看出，随着处理时间增长，土壤中副干酪乳杆菌的生长在21d达到峰值，到49d降至与7d相当的水平，在此期间，土样多环芳烃含量持续降低，说明土壤中多环芳烃含量降低是因副干酪乳杆菌的降解所致。

[0130] 以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

[0131] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。