技术领域
[0001] 本发明涉及植物提取物技术领域，更具体的说是美国薄荷提取物的应用及其制品。
相关背景技术
[0002] 随着生活水平的提高，消费者对美白产品有了更高的要求，特别是在亚洲美容护肤市场，美白依然是消费者最为关注的。目前色素沉着是皮肤常见的问题，其发病机制复杂，涉及黑色素生成增加、分布异常和代谢失衡等因素。色素沉着的临床表现多样，如日晒斑、雀斑和黄褐斑等，影响美观。虽然熊果苷、曲酸、氢醒及其衍生物等化学药物已在临床上使用，但由于其活性较低、易使皮肤敏感，因此，开发新的天然抗黑色素药物变得迫在眉睫。
[0003] 美国薄荷是唇形科美国薄荷属的一种一年生草本植物。原产美洲，近年来成功引种我国。美国薄荷被广泛用于缓解感冒、消化不良和各种皮肤病等症状。近年来研究也发现，美国薄荷具有抗氧化、抗炎、抗菌和改善认知障碍等多重功效。但并不存在美国薄荷提取物在美白作用的相关研究。
[0004] 因此，如何提供一种具有美白功效的天然植物提取物，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
具体实施方式
[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 本发明实施例所用实验材料和仪器如下：
[0033]
[0034] 实施例1
[0035] 美国薄荷水提物的制备:
[0036] (1)预处理：取美国薄荷整花，清洗去除杂质和灰尘、晾晒；
[0037] (2)分离提取：将美国薄荷整花按照料液比1‑8‑1:10，加入蒸馏水中，常温下浸泡12‑18h后；置于80‑85℃下煎煮1‑1.5h,固液分离；向固体分离物种加入500ml蒸馏水继续煎煮1‑1.5h，固液分离，将两次分离所得液体合并，过200nm的滤纸，3500‑4000r/min离心10‑
15min，取上清液备用；
[0038] (3)纯化：向步骤(2)上清液中加入质量分数1％的白土，在40‑45℃下水浴搅拌加热40min，再通过300号和10号硅胶土以质量比3：1的比例制成的滤饼过滤；
[0039] (4)浓缩干燥：取出滤液在30r/min，75‑80℃下旋蒸浓缩40‑60min，高温喷雾干燥，得美国薄荷水提物粉末。
[0040] 美国薄荷精油的制备:
[0041] (1)预处理：取新鲜美国薄荷整花，清洗去除杂质和灰尘；
[0042] (2)提取：将美国薄荷整花按照料液比为1:10放入圆底烧瓶中，并加入2～3颗沸石，冷浸1h之后用挥发油提取器装置提取精油，加热回流提取1h，将水层与精油分离，在精油中加入无水硫酸钠脱水2h，即得美国薄荷精油。
[0043] 胡椒薄荷精油的制备:
[0044] (1)预处理：取新鲜胡椒薄荷，清洗去除杂质和灰尘并折断；
[0045] (2)提取：将胡椒薄荷按照料液比为1:10放入圆底烧瓶中，并加入2～3颗沸石，冷浸1h之后用挥发油提取器装置提取精油，加热回流提取1h，将水层与精油分离，在精油中加入无水硫酸钠脱水2h，即得胡椒薄荷精油。
[0046] 左旋多巴(1mg/mL)的配制：精细克重称取10mg，用三蒸水溶解并定容至10mL。
[0047] 酪氨酸酶溶液(100U/ml)的配制：在25KU的酪氨酸酶药品瓶中加入2.5ml三蒸水，配成10000U/ml的酪氨酸酶母液，然后取10ul母液加入990ul三蒸水中，配成100U/ml的酪氨酸酶溶液。
[0048] 磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L，pH＝6.8)的配制:取98.6ml的0.3mol/L磷酸氢二钠溶液+1.4ml 0.3mol/L磷酸二氢钠溶液。
[0049] 实施例2
[0050] 体外酪氨酸酶活性检测
[0051] 以0.2M磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂，蘑菇酪氨酸酶配置成100U/mL，设置4组实验，具体如下：
[0052] 空白组A(140μL PBS+100μL左旋多巴)；
[0053] 空白对照组B(90μL PBS+50μL蘑菇酪氨酸酶+100μL左旋多巴)；
[0054] 样品背景对照组C(20μL样品+120μL PBS+100μL左旋多巴)；
[0055] 样品组D(20uL样品+70μL PBS+50μL蘑菇酪氨酸酶+100μL左旋多巴)；
[0056] A组加入140μL PBS和100μL左旋多巴；B组加入90μL PBS和100μL左旋多巴，放入37℃恒温箱中孵育10min，再放入50uL蘑菇酪氨酸酶；C组加入20μL样品、120μL PBS和100μL左旋多巴；D组加入20uL样品、70μL PBS、100μL左旋多巴，放入37℃恒温箱中孵育10min，再放入50uL蘑菇酪氨酸酶。继续孵育20min后，于475nm下测定吸光值，平行3次。
[0057] 按照公式(抑制率＝[(B‑A)‑(D‑C)]/(B‑A)×100％)计算酪氨酸酶的抑制率。
[0058] 将美国薄荷水提物、美国薄荷精油和胡椒薄荷精油分别作为样品进行酪氨酸酶活性实验，实验结果分别如图1、图2和图3所示。
[0059] 结果分析：如图1显示体外酪氨酸酶活性随美国薄荷水提物浓度升高而降低；图2显示所示体外酪氨酸酶活性随美国薄荷精油浓度升高而降低；图3显示胡椒薄荷精油对体外酪氨酸酶活性有促进作用。表明美国薄荷水提物和精油都有对酪氨酸酶活性的抑制效果，而其他类别的薄荷精油(胡椒薄荷精油)并没有抑制酪氨酸酶活性的作用。
[0060] 实施例3
[0061] (一)斑马鱼胚胎受试物处理毒性实验
[0062] 在实验中设立8组美国薄荷水提物处理组(0.4mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL和0.00625mg/mL)，空白对照为不含受试物的斑马鱼胚胎培养液培养的胚胎。以24孔培养板为实验容器，每孔放置10枚斑马鱼胚胎，每孔加入2000μL对应受试物浓度的胚胎培养液，设3个复孔，观察并记录各组斑马鱼胚胎形态。
[0063] 受试物处理48h后，每个浓度随机挑选9只胚胎测定体内酪氨酸酶活性与黑色素生成量，其余继续培养至96h观察受试物毒性，实验结果如图4所示。
[0064] 结果分析：如图4所示，随着药物浓度增加，斑马鱼的孵化率和存活率显著下降，尤其在高浓度(0.40000mg/ml)和长时间(72小时)暴露下，毒性效应最为显著。而0.05mg/ml的浓度下对斑马鱼无明显毒性影响，为后续实验提供了剂量基础。
[0065] (二)斑马鱼幼鱼黑色素含量变化情况
[0066] 在受试物处理至48h时在显微镜下观察胚胎的黑色素生成情况并拍照，用无菌吸管小心吸出并竖直放置，待斑马鱼下沉至管口时，轻轻挤压吸管将其滴到凹玻片凹槽中，吸弃胚胎培养液，滴加1～2滴羧甲基纤维素，在显微镜下将斑马鱼调整至头部朝上，尾部与身体处于同一水平，在相同的放大倍数和光照强度下，拍摄清晰的斑马鱼俯视图，结果如图5所示；同时利用Image J软件进行图片分析，将图片转化为8‑bit灰度图，消除背景(参数设置为130pixels)后，设置阈值参数，计算斑马鱼黑色素斑点面积总和，比较不同浓度处理组黑色素面积与总面积之比的差异，每组计算6条以上取平均值，实验结果如图6所示。
[0067] 体表色素相对含量(％)＝S样品/S空白×100，
[0068] 式中：S空白为空白组黑色素面积占比；S样品为样品组黑色素面积占比。
[0069] 结果分析：如图5和图6所示，随着美国薄荷提取物浓度的升高，斑马鱼头部黑色素明显降低；斑马鱼幼鱼表面黑色素面积随美国薄荷提取物浓度升高而降低，表明美国薄荷提取物可有效抑制黑色素的生成。
[0070] (三)采用NaOH裂解法测定斑马鱼体内黑色素含量
[0071] 受试物处理72h后收集100只斑马鱼胚胎，置于‑80℃处死，然后PBS缓冲液洗涤3次，加入含1％Triton X‑100的PBS缓冲液100μL，超声破碎处理5min后，在10000r/m，4℃条件下离心15min，取沉淀；
[0072] 向离心后的沉淀物中加入300μL含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液重悬，置于80℃水浴2h。冷却后转移入96孔培养板，以不加受试物处理的斑马鱼作为空白对照，测定在405nm下的吸光值A405，即为斑马鱼体内黑色素含量，结果如图7所示，相对黑色素含量按下式计算
[0073] 相对黑色素含量(％)＝A样品/A空白×100，
[0074] 式中：A空白为空白组吸光值；A样品为加入样品后的吸光值
[0075] 结果分析：如图7所示，斑马鱼体内黑色素含量随美国薄荷提取物的浓度升高而降低，表明黑色素含量呈浓度依赖性降低。
[0076] (四)斑马鱼体内酪氨酸酶活性检测
[0077] 受试物处理72h后收集100只斑马鱼胚胎，置于‑80℃处死，然后PBS缓冲液洗涤3次，加入含1％Triton X‑100的PBS缓冲液100μL，超声破碎处理5min后，在10000r/m，4℃条件下离心15min，上清液即斑马鱼酪氨酸酶粗提液。
[0078] 采用酪氨酸酶活性抑制实验对斑马鱼酪氨酸酶活性进行测定。BCA试剂盒测定粗酶液中的蛋白质含量，并将各组蛋白浓度调整至同一浓度。取粗酶液50μL于96孔板中，加入100μL 1mg/mL L‑DOPA，以空白组的斑马鱼胚胎作为对照，以实施例2的方法进行实验，实验结果如图8，酶活性按下式计算：
[0079] 酪氨酸酶活性(％)＝A样品/A空白×100
[0080] 结果分析：如图8所示，酪氨酸酶活性以空白组为对比，酶活性随美国薄荷提取物浓度的升高而降低，表明酶活性呈剂量依赖性降低。
[0081] 实施例4
[0082] 皮肤抗氧化和/或皮肤美白的乳霜制备：
[0083] 将美国薄荷水提物与其他成分进行配比，制备乳霜，成分和占比如下所示：
[0084] 表1皮肤抗氧化和/或皮肤美白的乳霜成分和配比
[0085] 成分 占比％1 水 79.87
2 1,3丙二醇 5
3 乙二胺四乙酸 0.03
4 甘油 6
5 鲸蜡硬脂醇 1.2
6 二甲基硅油 2
7 甲基葡糖倍半硬脂酸酯 2.5
8 羟丙基甲基纤维素 0.6
9 1,2‑戊二醇 1
10 苯氧乙醇 0.8
11 美国薄荷水提物 1
[0086] 人体测评试验
[0087] 测评方法如下：用皮肤测试仪MPA580接上黑色素皮肤检测仪 MX 18探头测黑色素值，选取20名受试者，年龄35‑40岁，受试者均存在皮肤较黑、暗褐色斑点等现象。且受试者身体健康，无皮肤病和过敏病史，非敏感皮肤，能够按规范使用护肤品。受试者每日早晚分别将美国薄荷水提物制备的乳霜喷涂脸部，每天早晚各一次，连续使用，对比只用乳霜第三周第六周时的特定部位皮肤黑色素值，重复测试5次，去掉最高值与最低值后计算的平均值为每个志愿者当次测试的数据。每次测试前志愿者需用洁面乳统一清洁面部后，静坐30min后再测量。统计各组受试者的黑色素指数(MI)，MI值越大，皮肤越黑，实验结果如图9所示。
[0088] 结果分析：如图9所示，随着使用时间的增加，受试者MI值逐渐降低，变化显著。
[0089] 说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0090] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
