[0001] 本发明涉及中药技术领域，具体地说，是关于一种治疗胃癌的中药组合物及其应用。

[0002] 2022年全球胃癌确诊病例97万，死亡病例达66万，为全球第五大常见癌症和第五大癌症死亡原因，尽管近年来胃癌发病率和死亡率均有所下降，但胃癌仍是造成全球癌症负担的重要因素。作为消化道恶性肿瘤之一，胃癌具有早期诊断率低、肿瘤负荷大、异质性强、患者预后差等特点，确诊中晚期的胃癌患者术后5年生存率小于30％，而早期患者经过及时治疗5年生存率可大于90％。

[0003] 白花蛇舌草首次记载于1959年《广西中药志》，是茜草科耳草属植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草，性寒味苦甘，归心、肝、脾、大肠经，具有清热解毒、利尿除湿的作用。作为清热解毒药物，白花蛇舌草具有很好的抗炎活性。菝葜入药始载于魏晋梁时陶弘景的《名医别录》，为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，味甘、微苦、涩、平，归肝、肾经。具有利湿去浊，祛风除痹，解毒散瘀的功效。蜀羊泉是中国先秦时期重要的传统中药之一，在《神农本草经》中被列为“中品”。原植物为茄科植物欧白英Solanum dulcamara L.，以果实入药，味苦微寒，能清热解毒，治疗龋齿，是一味以治疗皮肤病为主的传统中药。有研究发现蜀羊泉散加味联合同步放化疗对中晚期宫颈癌患者疗效、血清指标及生存的影响进行了研究，发现蜀羊泉散加味联合同步放化疗对中晚期宫颈癌疗效显著，可有效减轻患者疼痛，提高患者生存率及生活质量，降低血清CYFRA21‑1、SCC‑Ag、TK1、HE4水平，具有一定临床应用价值。

[0004] 目前医学中对胃癌的治疗还主要采用手术、放疗和化疗，但这些对早期病人治疗效果较好，手术也是局部治疗，对于转移到血液或者其他组织中的肿瘤细胞效果不佳，同时还可能产生副作用，所以亟需疗效显著且无副作用的治疗手段，而中药逐渐成为治疗胃癌的重要方式，目前关于如本发明的一种治疗胃癌的中药组合物及其应用还未见报道。

[0039] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0040] 实施例1本发明治疗胃癌的中药组合物(一)

[0041] 白花蛇舌草375份、蜀羊泉375份、菝葜375份。

[0042] 实施例2本发明治疗胃癌中药组合物(二)

[0043] 白花蛇舌草375份、蜀羊泉335份、菝葜395份。

[0044] 实施例3本发明治疗胃癌的中药组合物(三)

[0045] 白花蛇舌草335份、蜀羊泉395份、菝葜335份。

[0046] 实施例4本发明治胃癌的中药组合物(四)

[0047] 白花蛇舌草395份、蜀羊泉335份、菝葜415份。

[0048] 实施例5本发明治疗胃癌的中药组合物(五)

[0049] 白花蛇舌草335份、蜀羊泉415份、菝葜375份。

[0050] 实施例6本发明治疗胃癌的中药组合物(六)

[0051] 白花蛇舌草415份、蜀羊泉375份、菝葜335份。

[0052] 实施例7本发明治疗胃癌的中药组合物(七)

[0053] 白花蛇舌草375份、蜀羊泉395份、菝葜335份。

[0054] 实施例8本发明治疗胃癌的中药组合物(八)

[0055] 白花蛇舌草335份、蜀羊泉335份、菝葜415份。

[0056] 实施例9本发明治疗胃癌的中药组合物(九)

[0057] 白花蛇舌草395份、蜀羊泉415份、菝葜375份。

[0058] 实施例10本发明治疗胃癌的中药组合物(十)

[0059] 白花蛇舌草335份、蜀羊泉375份、菝葜335份。

[0060] 实施例11本发明治疗胃癌的中药组合物(十一)

[0061] 白花蛇舌草415份、蜀羊泉335份、菝葜395份。

[0062] 实施例12本发明治疗胃癌的复方蛇舌草颗粒的制备

[0063] 1)提取物制备：取权利要求1‑3任一项重量份配比的药材，分别加8倍量的水煎煮2次，第一次2h，第二次1.5h。煎毕，煎液滤过，合并滤液后静置12‑16h，取上清液浓缩至相对密度为1.30‑1.35(80‑85℃)的清膏，分装密封后储存于‑80℃低温冰箱中备用；

[0064] 2)颗粒剂制备：将上述清膏与可溶性淀粉、糊精和甘露醇按1：1：1：1的质量比混合并加入蒸馏水作为润湿剂，混合均匀、不断揉搓，直至软材“轻握成团，推之即散”。将软材放置于16目不锈钢筛网上，挤压过筛，收集过筛颗粒。将颗粒平摊于托盘中，置于80℃烘箱中烘干3h后即得颗粒。

[0065] 实施例13细胞实验

[0066] 1实验材料

[0067] 1.1细胞株

[0068] 本部分实验所用人正常胃黏膜上皮细胞GES‑1和人胃癌细胞株AGS、HGC‑27、MKN‑1、MKN‑28均来源于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。

[0069] 1.2主要试剂

[0070] 复方蛇舌草水提取物(清膏)(上海练塘药业)；通关藤口服液(消癌平口服液)(河南新四方制药)；槲皮素(MCE，中国)；磷酸盐缓冲溶液(广州硕谱生物)；RPMI 1640培养基、Ham's F‑12K培养基(上海源培生物)；JC‑1线粒体膜电位试剂盒、Edu细胞增殖检测试剂盒(广州锐博生物，中国)；BCA蛋白定量检测试剂盒(上海碧云天生物，中国)；CCK‑8试剂盒(MCE，中国)。

[0071] 1.3主要仪器

[0072] 二氧化碳细胞培养箱(Thermo fisher scientific，美国)；台式低温高速离心机(Eppendorf，德国)；Leica倒置荧光显微镜(Leica，瑞士)；Western Blot制胶夹，支架、Western Blot转膜槽、Western Blot电泳、Western Blot电源(Bio‑rad，美国)、往复式脱色摇床(江苏其林贝尔仪器，中国)；SIM‑F124制冰机(SANYO，日本)；Tannon化学发光成像系统(上海天能，中国)；多功能酶标仪(BioTek，美国)。

[0073] 其他在实施例中提及的试剂以及仪器均为市售的常用仪器、试剂，可为本领域技术人员常规购买获得，这里不再一一列出。

[0074] 2实验方法

[0075] 2.1测定复方蛇舌草对胃癌细胞的生长活性及增殖能力的影响

[0076] 2.1.1测定复方蛇舌草对胃癌细胞活力的影响

[0077] CCK‑8法检测细胞活力，取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在96孔板中按照5000个/孔的密度接种细胞，每孔加入200μL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中培养；待细胞生长至汇合度达60‑70％时，准备给药。弃去旧培养基后，按照对照组(完全培养基)，实验组(复方蛇舌草水提取物(清膏)(Compound ofHedyotis diffusa‑extract，CHD‑E，以下简称CHD‑E)浓度为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、16mg/mL、32mg/mL、64mg/mL的含药培养基，以梯度稀释法制得)的分组，向96孔板每孔加入200μL培养基，每组设置6个复孔。将96孔板转移至37℃、5％CO2培养箱中培养至实验所需时间(24h或36h)；药物孵育结束后，弃去旧培养基，每孔加入150μL PBS(phosphate buffered saline，磷酸盐缓冲溶液)清洗残留培养基，清洗3次后移液枪吸干残余液体。避光下，按照CCK‑8试剂体积：完全培养基体积＝10：100的比例配制CCK‑8检测溶液，每孔加入110μL，并设置一组空白孔，即该组只加入CCK‑8检测溶液。
将96孔板转移至37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后，避光转移，酶标仪450nm波长处检测各孔的OD(optical density，光学密度)值。

[0078] IC50(halfmaximal inhibitory concentration，半抑制浓度)的计算方法：在GraphPad Prism 8.0软件中“XYTables”项下建立数据集，“NewAnalysis”项下选择“Transform concentrations(X)”作浓度变换后，对生成的数据集在“XY Analyses(curve fit)”项下选择“Dose‑response‑Inhibition/Log(inhibitor)vs.response‑Variable slope(fourparameters)”。

[0079] IC10(10％抑制浓度)和IC20(20％抑制浓度)的计算方法：在GraphPad Prism 8.0软件中“XY Tables”项下建立数据集，“NewAnalysis”项下选择“Transform concentrations(X)”作浓度变换后，对生成的数据集在“XY Analyses(curve fit)”项下选择“Dose‑response‑Special/Log(agonist)vs.response‑Find ECanything”。在弹出的对话框中填写F值，F值为10，计算即得IC10；F值为20，计算即得IC20。

[0080] 2.1.2测定复方蛇舌草对胃癌细胞平板克隆形成能力的影响

[0081] 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力，取生长状态良好，处于对数生长期的3
AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在6孔板中按照1×10个/孔的密度接种细胞，每孔加入2mL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至培养箱中培养；贴壁培养48h后，弃去旧培养基，用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、
9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。细胞在含药培养基中培养2h；弃去含药培养基，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后，更换为完全培养基。自铺板起计算，细胞在37℃、5％CO2培养箱中共培养7天；取出细胞培养板，弃去旧培养基，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后，每孔加入1mL 4％多聚甲醛，室温固定30min；弃去固定液，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后，每孔加入1mL结晶紫染液染色，室温下摇床慢速孵育30min；染色结束，回收结晶紫染液，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后晾干干燥；拍照后用Image J计数每孔克隆数量。每组实验重复三次。

[0082] 2.1.3Edu染色法检测复方蛇舌草对胃癌细胞增殖能力的影响

[0083] 取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在96孔板中4
按照1×10个/孔的密度接种细胞，每孔加入200μL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中培养24h至贴壁稳定；弃去旧培养基，用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、
6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。细胞在含药培养基中培养24h；Edu溶液按照1000：1的比例用培养基稀释，备用；弃去含药培养基，PBS洗3次后，每孔加入配好的200μL Edu培养基，在37℃、5％CO2培养箱内孵育细胞2h；弃去Edu(5‑ethynyl‑2’‑deoxyuridine，5‑乙炔‑
2‑脱氧尿嘧啶核苷)培养基，PBS洗3次后，每孔加入50μL4％多聚甲醛固定液，室温固定
30min；弃去固定液，PBS洗3次后，每孔加入50μL 20mg/mL甘氨酸溶液，摇床慢速孵育5min；
弃去甘氨酸溶液，PBS洗3次，摇床慢速，每次5min。每孔加入100μL渗透剂(0.5％Triton‑X‑
100的PBS溶液)，摇床慢速孵育10min；配置染色液。500μL染色液体系组成如表1。

[0084] 表1Edu染色液体系组成(500μL)

[0085]

[0086] 弃去渗透剂，PBS洗1次，摇床慢速，5min。每孔加入100μL染色液，避光、室温孵育30min；弃去染色液，每孔加入100μL渗透剂，摇床慢速孵育2‑3次，每次10min；按三蒸水体积：试剂F体积＝100：1的比例稀释试剂F，即Hoechst 33342染料，每孔加入100μL稀释后的Hoechst 33342染料，避光、室温、慢速摇床孵育30min；弃反应液，PBS洗3次，每孔加入100μL PBS后于倒置荧光显微镜下拍照观察。每组实验重复三次。

[0087] 2.2复方蛇舌草对胃癌细胞迁移、侵袭能力，下调胃癌转移相关蛋白表达的影响[0088] 2.2.1划痕实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞迁移能力的影响

[0089] 取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在12孔板中5
按照3×10个/孔的密度接种细胞，每孔加入1mL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中培养。待细胞生长至汇合度达
100％时，准备划痕。弃去旧培养基后，用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、
9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。以12孔板的盖子为尺，每组做平行且宽度一致的划痕，用PBS淋洗3次，至无明显细胞漂浮。每孔加入1mL完全培养基后在倒置显微镜下拍照，此时划痕宽度记录为0时刻；拍照结束，弃去培养基，移液枪吸干残余液体后，按照对照组和实验组的分组，每孔分别加入2mL培养基后，将12孔板转移至
37℃、5％CO2培养箱中培养24h；孵育结束，弃去旧培养基，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后，每孔加入1mL完全培养基后在倒置显微镜下拍照，此时划痕宽度记录为24h时刻。

[0090] 伤痕愈合率计算方法：用Image J对实验结果进行定量统计，伤痕愈合率＝(0时刻伤痕区域面积‑24h时刻伤痕区域面积)/0时刻伤痕区域面积*100％。每组实验重复三次。

[0091] 2.2.2Transwell实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞迁移能力的影响

[0092] 取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，胰蛋白酶消化后用1mL基5
础培养基重悬，进行细胞计数。按照4×10个/mL的密度用基础培养基稀释细胞悬液后备用；准备适配24孔板的Transwell小室。用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。用镊子将Transwell小室放置于24孔板内，每孔加入细胞悬液200μL(移液枪垂直加入)；另取该孔板内其余孔，按照分组设置分别加入600μL培养基。用镊子将加入细胞悬液的小室转移至含培养基孔内，转移过程中避免产生气泡；注意观察原孔内是否存在小室漏液情况，如出现漏液，更换小室后重新加入细胞悬液；做好标记，轻拍侧壁使细胞分散均匀后，将24孔板转移至37℃、5％CO2培养箱中培养至实验所需时间(根据预实验结果，AGS细胞药物刺激8h；HGC‑
27细胞药物刺激4h)；药物刺激结束，用镊子将小室转移至预先添加了600μL完全培养基的孔内，转移至37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h；孵育结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其转移至预先添加了600μL4％多聚甲醛固定液的孔内，室温固定30min；固定结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其转移至预先添加了600μL结晶紫染色液的孔内，室温下摇床慢速孵育30min；染色结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其在装有三蒸水的烧杯中清洗，清洗3次后倒置备用。用棉签小心擦除小室内部未穿透小室PC膜的细胞；晾干后于正置显微镜下拍照，用Image J对实验结果进行定量统计。每组实验重复三次。

[0093] 2.2.3Transwell实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞侵袭能力的影响

[0094] 按照说明书制备实验所需基质胶溶液。提前打开37℃水浴锅预热。用37℃水浴回温的基础培养基稀释试剂C，制备0.5×C缓冲溶液，如向19mL基础培养基内加入1mL试剂C。密封后可于4℃存放一周，实验当天使用前密封置于37℃水浴中；将试剂A置于37℃水浴
10min至完全溶解。用37℃水浴回温的基础培养基稀释溶解的试剂A，如500μL试剂A与500μL基础培养基混匀后得到1mL 1×试剂A。现用现配，使用前密封置于37℃水浴中，降低胶黏度；准备适配24孔板的Transwell小室；用37℃水浴回温的0.5×试剂C稀释1×试剂A，根据预实验结果，稀释15倍；用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。用镊子将Transwell小室放置于24孔板内，每孔加入100μL稀释后的试剂A(移液枪垂直加入)。将24孔板密封后置于4℃冰箱内静置2‑3h；取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，调整细
5 6
胞密度，制备细胞悬液。按照预实验结果，AGS细胞1.5×10个/孔/100μL，即1.5×10个/mL；
5 6
HGC‑27细胞1.0×10个/孔/100μL，即1.0×10个/mL；取出静置后的24孔板，每孔加入100μL细胞悬液(移液枪垂直加入)；另取该孔板内其余孔，按照分组设置分别加入800μL培养基。
用镊子将加入细胞悬液的小室转移至含培养基孔内，转移过程中避免产生气泡；做好标记，轻拍侧壁使细胞分散均匀后，将24孔板转移至37℃、5％CO2培养箱中培养至实验所需时间(根据预实验结果，AGS细胞、HGC‑27细胞药物刺激6h)；药物刺激结束，用镊子将小室转移至预先添加了800μL完全培养基的孔内，转移至37℃、5％CO2培养箱中继续培养至实验所需时间。按预实验结果，AGS继续培养24h；HGC27细胞继续培养48h；孵育结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其转移至预先添加了800μL4％多聚甲醛固定液的孔内，室温固定
30min；固定结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其转移至预先添加了800μL结晶紫染色液的孔内，室温下摇床慢速孵育30min；染色结束，移液枪小心吸出小室内液体，用镊子将其在装有三蒸水的烧杯中清洗，清洗3次后倒置备用。用棉签小心擦除小室内部未穿透小室PC膜的细胞；晾干后于正置显微镜下拍照，用Image J对实验结果进行定量统计。每组实验重复三次。

[0095] 2.2.4对胃癌细胞转移相关蛋白表达水平的测试

[0096] 利用WB(westernblot，蛋白质免疫印迹)检测EMT(epithelial‑mesenchymal transition，上皮‑间质转化)相关蛋白，结合前述实验结果，选取QCT(Quercetin，槲皮素)作为阳性药物。经CCK‑8法检测，QCT对AGS细胞的IC50值为130.8±22.1μM；对HGC‑27细胞的IC50值为119.7±10.2mg/mL。依据IC20值，设置WB实验给药浓度，以5mg/mL CHD‑E、70μM QCT处理AGS细胞；以6.5mg/mL CHD‑E、90μM QCT处理HGC‑27细胞。通过总蛋白提取；BCA法测定蛋白浓度；SDS‑聚丙烯酰胺(SDS‑PAGE)凝胶电泳；最后通过凝胶电泳将条带在化学成像系统中进行扫描显影，用Image J对实验结果进行定量统计。每组实验重复三次。检测间充质细胞标志物神经钙黏蛋白(N‑cadherin)和波形蛋白(Vimentin)、转录因子Snail同源物1(Snail)和E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、黏附因子CD44和EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule，上皮细胞粘附分子)的表达水平，反映CHD‑E对细胞转移的影响。

[0097] 2.3测定复方蛇舌草对胃癌细胞凋亡的影响

[0098] 2.3.1流式细胞术检测复方蛇舌草对胃癌细胞凋亡的影响

[0099] 取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在6孔板中按5
照5×10个/孔的密度接种细胞，每孔加入2mL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中培养；细胞生长至汇合度达50‑60％时，弃去旧培养基用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。细胞在含药培养基中培养24h；收集上清液于15mL离心管内，用PBS淋洗3次，移液枪吸干残余液体后，每孔加入1mL胰蛋白酶消化细胞，用收集的上清液终止消化；离心、收集细胞沉淀后，弃去上清液，用预冷的PBS重悬细胞，放入离心机，1000rpm，离心3min；收集细胞沉淀后，弃去上清液，用预冷的1×Binding Buffer重悬细胞，放入4℃预冷离心机，600g，离心3min，反复操作3次；收集细胞沉淀，加入
500μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μLAnnexinV‑FITC染料，轻轻混匀后避光冰上孵育5min；加入5μLPI(propidium iodide，碘化丙啶)染料，轻轻混匀后避光冰上孵育10min；
上机检测，收集数据。用FlowJo分析凋亡数据。每组实验重复三次。

[0100] 2.3.2JC‑1染色法检测复方蛇舌草对胃癌细胞线粒体膜电位的影响

[0101] 取生长状态良好，处于对数生长期的AGS和HGC‑27细胞，细胞计数后，在12孔板中5
按照3×10个/孔的密度接种细胞，每孔加入1mL完全培养基，“十”字型轻轻晃动使细胞分散均匀。做好标记后，将细胞转移至37℃、5％CO2培养箱中培养；细胞生长至汇合度达50‑
60％时，弃去旧培养基，用不同浓度的CHD‑E处理AGS细胞(3.5mg/mL、5mg/mL、9mg/mL)和HGC‑27细胞(5mg/mL、6.5mg/mL、8mg/mL)，每组设置3个复孔。细胞在含药培养基中培养6h，进行凋亡诱导处理；稀释JC‑1(5,5′,6,6′‑Tetrachloro‑1,1′,3,3′‑tetraethyl‑imidacarbocyanine iodide，5,5',6,6'‑四氯‑1,1',3,3'‑四乙基苯并咪唑羰花菁碘化物)工作液。以12孔板为例，每孔需要JC‑1工作液500μL。稀释JC‑1工作液时，如向8mL已灭菌三蒸水中加入50μL200×JC‑1试剂，剧烈震荡，充分混匀后，加入2mL 5×JC‑1染色缓冲液，混匀后即得10mL JC‑1染色工作液，现用现配；药物刺激结束后，弃去旧培养基，用PBS淋洗3次，加入500μL完全培养基、500μL JC‑1染色工作液，转移至37℃、5％CO2培养箱中孵育
20min；配制1×JC‑1染色缓冲液。即向4mL已灭菌三蒸水中加入1mL 5×JC‑1试剂，冰浴备用，现用现配；细胞孵育结束后，弃去旧培养基，用预冷1×JC‑1染色缓冲液淋洗2次，加入
1mL完全培养基后于倒置荧光显微镜下拍照观察。拍照前将细胞培养板置于冰上，30min内尽快拍照。每组实验重复三次。

[0102] 2.4测定复方蛇舌草通过调控Wnt/β‑catenin信号通路活性发挥抗胃癌作用[0103] 采用WB实验对CHD抗胃癌的潜在的药理学分子机制进行初步的探索和验证，与“2.2.4”项下一致，选择QCT作为阳性药物。以5mg/mL CHD‑E、70μM QCT处理AGS细胞；以6.5mg/mL CHD‑E、90μM QCT处理HGC‑27细胞，药物刺激24h。

[0104] 3统计与分析

[0105] 采用SPSS25.0软件、GraphPadPrism 8.0软件完成数据处理、分析及作图。对于两组间差异比较，采用Student t检验；对于多组间差异比较，采用one‑way ANOVA单因素方差分析和Tukey事后多重比较确定统计学差异性；对于体内实验，采用重复测量的双向方差分析和Tukey事后多重比较确定统计学差异性。每个实验重复3次及以上。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。*p＜0.05即认为差异具有统计学意义。

[0106] 4实验结果

[0107] 4.1复方蛇舌草抑制胃癌细胞的生长活性及增殖能力

[0108] 复方蛇舌草对胃癌细胞活力的影响

[0109] 结果表明，24h给药时间下，CHD‑E对各细胞株的IC50值分别为：AGS细胞IC50＝8.91±0.73mg/mL；HGC27细胞IC50＝7.59±0.15mg/mL；MKN‑1细胞IC50＝5.30±0.10mg/mL；MKN‑28细胞IC50＝6.81±0.48mg/mL；GES‑1细胞IC50＝15.45±0.23mg/mL，CHD‑E对胃癌细胞株的毒性作用大于人胃黏膜上皮细胞，结果具有统计学差异(见图1)。此外，实验发现，在低浓度下，CHD‑E发挥出一定的促进细胞增殖作用，当药物浓度增加后，胃癌细胞的细胞活力显著降低，呈现明显的浓度依赖性。CHD‑E药物浓度的梯度设置不变，延长给药时间，发现CHD‑E在24h和36h均能很好的抑制4种胃癌细胞的生长活性(见图2)。

[0110] 结合细胞培养状态及对CHD‑E的药物敏感性，选取AGS和HGC‑27细胞作为本申请的研究对象进行后续实验。并按IC10、IC20、IC50值设置低剂量、中剂量、高剂量。

[0111] 复方蛇舌草对胃癌细胞平板克隆形成能力的影响

[0112] 结果表明，CHD‑E能够显著抑制胃癌细胞的克隆形成能力，胃癌细胞的克隆形成数目随药物浓度的增加而逐渐减少，结果具有统计学差异(见图3)。

[0113] Edu染色法检测复方蛇舌草对胃癌细胞增殖能力的影响

[0114] 与平板克隆实验结果一致，Edu阳性细胞百分比逐渐降低，表明CHD‑E能以浓度依赖性方式显著降低细胞的增殖能力(见图4)。

[0115] 4.2复方蛇舌草对胃癌细胞迁移、侵袭能力，下调胃癌转移相关蛋白表达的影响[0116] 划痕实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞迁移能力的影响结果见图5，发现“伤痕”愈合率随药物浓度增加而降低，表明CHD‑E能够显著抑制胃癌细胞水平迁移能力。

[0117] Transwell实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞迁移能力影响的结果见图6，发现进入下室的细胞数目随药物浓度增加而显著降低，表明CHD‑E能够显著抑制胃癌细胞垂直迁移能力。

[0118] Transwell实验检测复方蛇舌草对胃癌细胞侵袭能力影响的结果见图7，发现进入下室的细胞数目随药物浓度增加而显著降低，表明CHD‑E能够显著抑制胃癌细胞的侵袭能力。

[0119] 复方蛇舌草对胃癌细胞转移相关蛋白表达水平影响的结果见图8，药物刺激24h后，胃癌细胞中间充质细胞标志物N‑cadherin和Vimentin、转录因子Snail和ZEB1、黏附因子CD44和EpCAM表达均显著降低，表明CHD‑E可能是通过影响EMT进程，调控细胞黏附和迁移相关蛋白的表达，进而抑制胃癌细胞转移。

[0120] 4.3复方蛇舌草诱导胃癌细胞凋亡

[0121] 流式细胞术检测复方蛇舌草对胃癌细胞凋亡影响的结果见图9，发现CHD‑E能够促进胃癌细胞凋亡，对早期和晚期凋亡均有诱导效应。

[0122] 染色法检测复方蛇舌草对胃癌细胞线粒体膜电位影响的结果见图10，随着药物浓度增加，绿色荧光逐渐增多，表明线粒体膜电位逐渐降低，提示CHD‑E诱导的细胞凋亡可能与线粒体膜电位降低有关。

[0123] 4.4复方蛇舌草通过调控Wnt/β‑catenin信号通路活性发挥抗胃癌作用[0124] 结果见图11，药物刺激24h后，Akt、磷酸化的糖原合成酶激酶3β(p‑GSK3β)、β‑catenin和c‑myc蛋白水平显著下调，表明Akt磷酸化GSK3β的能力降低，更多的GSK3β发挥正常功能，即磷酸化β‑catenin，使之降解，不能进入细胞核与转录因子结合调控核内基因表达，从而发挥抑癌作用。此外，Dickkopf相关蛋白1(DDK1)高表达，表明DKK1能够和Wnt/β‑catenin通路上的复合物竞争性结合Wnt蛋白，协同促进Wnt/β‑catenin处于“Off”状态。上述结论提示CHD‑E具有治疗作用多靶点的优势特点，能够抑制肿瘤相关经典信号通路Wnt/β‑catenin的活性发挥抗胃癌作用。

[0125] 实施例13动物实验

[0126] 1实验材料

[0127] 1.1细胞株

[0128] 同实施例13。

[0129] 1.2动物

[0130] 本部分实验所用的SPF(specific pathogen free animal，无特定病原体动物)级BALB/c裸鼠由上海市第一人民医院实验动物中心提供，实验方案经上海市第一人民医院动物伦理委员会批准(IACUC号：2022AW001)。

[0131] 2实验方法

[0132] 2.1动物造模

[0133] 为了在体内模型中评价复方蛇舌草抗胃癌的疗效，本实验选用裸鼠构建CDX(cell line‑derived xenograft,细胞来源的异体移植肿瘤)模型。将人胃癌细胞AGS注射于每只裸鼠的右侧背部。注射前，在皮下划行一段距离后注射细胞，注射结束，停留一段时间后旋7
转缓慢拔针。注射体积为100μL/只，注射细胞数目为1×10个/只。每天观察成瘤效果，当注
3
射肿瘤细胞7‑10天后，皮下肿瘤生长至体积大约20‑50mm，视为造模成功。

[0134] 2.2分组与给药

[0135] 按照随机分组原则，将荷瘤小鼠分为对照组(饮用水，灌胃给药)、通关藤阳性药给药组(TGT，临床等效剂量1倍，3.90mL/kg裸鼠体重，灌胃给药)、CHD‑E低剂量给药组(临床等效剂量1倍，450.72mg/kg裸鼠体重，灌胃给药)、CHD‑E高剂量给药组(临床等效剂量2倍，901.44mg/kg裸鼠体重，灌胃给药)。连续给药14天，灌胃容积为0.1mL/10g裸鼠体重，即20g裸鼠最大灌胃体积为200μL。

[0136] 2.3测量指标

[0137] 自给药当天起，记录裸鼠体重、皮下肿瘤生长情况。皮下肿瘤体积计算公式为：体3 2 2
积(mm)＝长(mm)×宽 (mm)/2；第14天给药结束后，于第15天采用CO2窒息法处死裸鼠。完整取出肿瘤组织，记录肿瘤大小并拍照。

[0138] 3统计与分析

[0139] 同实施例13。

[0140] 4结果

[0141] 给药期间，各组别裸鼠生长状态良好，未出现弓背、惊厥、竖毛等异常表现。CDX实验结果如图12A‑C所示，与对照组相比，阳性药物通关藤口服液(TGT)和CHD‑E给药均能显著抑制异种移植瘤的生长，表明CHD‑E在体内实验中亦表现出良好的抑癌活性，具有显著的抗胃癌作用。此外，如图12D所示，所有组别的裸鼠在给药期间体重变化不明显，表明药物干预对机体而言未产生明显的毒性或不良反应。

[0142] 实施例14复方蛇舌草颗粒的制剂工艺优化

[0143] 1实验材料

[0144] 1.1实验试剂

[0145] 复方蛇舌草水提取物(上海练塘药业，中国)；糊精、可溶性淀粉、甘露醇、氯化钠(国药集团，中国)。

[0146] 1.2实验耗材

[0147] 玻璃真空干燥器、称量纸、称量瓶、漏斗(比克曼生物，中国)；标准筛(16目)(绍兴圣超仪器，中国)；国家标准药典筛(1号筛、5号筛)(东迈科技仪器，中国)；500mL、1000mL烧杯、玻璃棒、100mL、500mL、1000mL量筒(四川蜀玻集团，中国)。

[0148] 1.3实验仪器

[0149] 冰箱(4℃、‑20℃、‑80℃)(海尔，中国)；电热鼓风干燥箱(上海精宏实验设备，中国)；AL04电子分析天平(Mettler Toledo，美国)；纯水仪(Millipore，美国)；(水浴锅群安实验仪器，中国)。

[0150] 2实验方法

[0151] 2.1颗粒的制备

[0152] 同实施例12。

[0153] 2.2制剂工艺的优化

[0154] 2.2.1辅料种类选择

[0155] 选用可溶性淀粉、糊精、甘露醇作为辅料候选，进行后续辅料单因素考察和混合辅料筛选，确定最优辅料种类及用量，视最终颗粒剂甜度决定是否额外增加甜菊糖苷作为甜味剂。

[0156] 2.2.2辅料单因素考察

[0157] 遵循辅料最少原则，设置提取物：辅料＝1：1、提取物：辅料＝1：2、提取物：辅料＝1：3、提取物：辅料＝1：4共四组，采用前述方法制备颗粒，考察单一辅料对于软材及颗粒成型性的影响。

[0158] 结果如表2所示，糊精和可溶性淀粉用做单一辅料时，提取物：辅料＝1：2即可成功制软材、制颗粒，而且制成的颗粒大小均一、成型性好。继续增加辅料用量，软材过筛后小颗粒及细粉过多。甘露醇用做单一辅料时，提取物：甘露醇＝1：4仍不能制得颗粒，表明其单独用做CHD颗粒剂的辅料时，性能较差。

[0159] 表2辅料单因素考察实验结果

[0160]

[0161]

[0162] 2.2.3混合辅料筛选及颗粒剂考察

[0163] 参考上述单一辅料筛选结果，按照表3设置不同组别制备颗粒，对所得颗粒进行成型率、休止角、堆密度、溶化率、吸湿性、含水量评价，以此筛选最佳混合辅料种类及配比。

[0164] 表3混合辅料筛选的处方

[0165]

[0166] 成型率

[0167] 参照《中华人民共和国药典：四部》(2020版)(以下简称：药典)粒度测定法，采用手动双筛分法。精密称定颗粒5g，1号筛在上、5号筛在下，先过1号筛，再过5号筛，保持孔筛上下水平。将颗粒放置于1号筛，轻拍3min。能通过1号筛、但不能通过5号筛的颗粒为合格颗粒，称重后计算成型率。

[0168] 成型率＝(过筛后颗粒质量/过筛前颗粒质量)×100％。

[0169] 结果见表4，处方2成型率最好，处方14和处方17成型率较低，能通过5号筛的小颗粒或细粉太多，成型性略差。

[0170] 表4成型率测定结果

[0171]

[0172] 休止角

[0173] 采用固定漏斗法测定休止角。将漏斗固定于距桌面高度为H(cm)处，将颗粒缓慢沿漏斗壁倒入，直到桌面形成的颗粒圆锥体尖端接触到漏斗口为止，测定颗粒圆锥体底部半径，记为R(cm)，圆锥和桌面所形成的角度即为休止角α。tgα＝H/R。

[0174] 结果见表5，各处方休止角均＜30°，表明所得颗粒流动性均较好。其中，处方14的休止角最小，其颗粒流动性最佳。

[0175] 表5休止角测定结果

[0176]

[0177]

[0178] 堆密度

[0179] 参照药典，精密称定一定量颗粒，放置于干燥量筒中，颗粒质量作为M(g)，轻轻振动后读出表面颗粒近刻度处数值并记录为V(mL)，两者比值即为堆密度。堆密度/(g/mL)＝M/V。

[0180] 各处方堆密度测定结果如表6所示。结果表明，处方13的堆密度值最大。

[0181] 表6堆密度测定结果

[0182]

[0183] 溶化性

[0184] 精密称取0.5g颗粒置于烧杯中，加入10mL沸水，搅拌5min后转移至50mL离心管内，3000rpm离心10min，弃去上清液，将残渣在80℃的烘箱中烘干至恒重，称量后计算溶化率。

[0185] 溶化率值＝(溶化后残渣质量‑溶化前颗粒质量)/溶化前颗粒质量×100％。

[0186] 本实验中，搅拌后多数处方可溶性颗粒全部溶化，处方13和处方15出现较轻微浑浊，处方2和处方14出现明显浑浊。随后，离心、干燥至恒重，称定残渣之后计算的各处方溶化性测定结果如表7所示，与观察结果一致，处方2、处方14和处方13溶化率较低，处方17溶化率最高，表明其颗粒溶化性最好。

[0187] 表7溶化性测定结果

[0188]

[0189] 吸湿性

[0190] 向玻璃干燥器底部加入氯化钠过饱和溶液，将干燥器放置于25℃恒温培养箱内24h，使干燥器内相对湿度为75％。精密称定一定量颗粒和干燥至恒重的玻璃称量瓶，将颗粒平铺于玻璃称量瓶底部，保持称量瓶开盖，放置于玻璃干燥器内，于25℃恒温箱中静置
72h，称重后计算吸湿率。

[0191] 吸湿率＝(吸湿后颗粒质量‑吸湿前颗粒质量)/吸湿前颗粒质量×100％。

[0192] 各处方吸湿性测定结果如表8所示。结果表明，各处方吸湿性均＜1％，其中处方15吸湿性最弱，评分最高。

[0193] 表8吸湿性测定结果

[0194]

[0195] 含水量

[0196] 参照药典水分测定法，采用烘干法测定颗粒含水量。精密称定颗粒2‑5g，重量记为W1(g)，将颗粒平铺于干燥至恒重的玻璃称量瓶中，称量瓶重量记为W2(g)，厚度不超过5mm。保持称量瓶开盖，于100‑105℃恒温箱内干燥5h。干燥后，盖好称量瓶瓶盖，移置底部装有氯化钠过饱和溶液的干燥器中，放冷30min后精密称定。再在上述条件下干燥1h，放冷、称重，直至连续两次称重差异不超过5mg为止，此时玻璃称量瓶和颗粒重量之和记为W3(g)。根据减失重量，计算颗粒含水量。

[0197] 含水量＝(W1+W2‑W3)/W1×100％。

[0198] 各处方含水量测定结果如表9所示。结果表明，各处方含水量均＜5％，符合药典规定。其中，处方18的含水量最低，得分最高。

[0199] 表9含水量测定结果

[0200]

[0201] 2.3颗粒成型工艺评价

[0202] 从颗粒剂的均一性、稳定性、溶解性综合评价优化后的成型工艺，将上述测定的成型率、休止角、堆密度、溶化性、吸湿性、含水量作为考察指标，按照综合评分结果确定复方蛇舌草颗粒的最佳制备工艺。各考察指标的权重系数分别为15％、15％、15％、15％、20％、20％，综合评分为各项数值乘以权重系数，即综合评分Y＝成型率/最大成型率×15+最小休止角值/休止角值×15+堆密度值/最大堆密度值×15+溶化率/最大溶化率×15+最小吸湿率值/吸湿率值×20+最小含水量值/含水量×20。

[0203] 对各处方所得颗粒见图13，成型工艺综合评分结果如表10所示，处方18制得颗粒为黄棕色，成型率良好；颗粒堆密度小、颗粒间空隙小，流动性好，易于分装，能降低装量差异；颗粒溶化性良好；颗粒吸湿性弱、含水量低，能尽可能确保药品稳定、不易变质。经志愿者试服，制得颗粒气香、味甘、微苦，无需额外添加甜味剂。因此，处方18，即提取物：可溶性淀粉：糊精：甘露醇＝1：1：1：1为复方蛇舌草颗粒最优成型工艺。

[0204] 表10颗粒成型工艺的综合评分结果

[0205]

[0206] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。