两伐桑枝发酵饲料及其在养鸡中的应用 【技术领域】 [0001] 本发明涉及微生物饲料领域，主要包含两伐桑枝发酵饲料工艺的优化及其在养鸡中的应用。 【背景技术】 [0002] 桑园为了提高桑叶产量和质量，会在每年的夏季以及冬季对桑树进行伐枝与修剪处理。修剪下来的枝茎与叶片的总和，称为两伐桑枝，是蚕桑产业最大宗的副产物之一。 2 2022年广西桑园面积达18.94万hm ，是全国种桑养蚕第一大省区，桑园种桑养蚕占生物产量一半以上的桑枝没有得到效利用，按照每亩每年接近1吨的桑枝产量，广西地区的鲜桑枝条年产量可达300万吨，存量巨大。 [0003] 当前，两伐桑枝的开发利用手段并不多，少部分经过加工后制成菌菇生长棒，大部分丢弃在田间地头或者当做柴火焚烧，造成了资源浪费及环境污染是当前亟需解决的问题。一般来说，两伐桑枝含粗蛋白5.44％，纤维素51.88％，木质素18.18％，半纤维素 23.02％，灰分1.57％左右。其大体的营养成分不差，收集成本较低，且含有丰富的多糖、黄酮等活性化合物，对动物健康和肉质改善有很高的价值，这使得两伐桑枝具备作为畜禽等动物的优质粗饲料资源的潜力。广西当前大力调整畜牧业养殖结构，减少耗粮型畜牧业比例，提高节粮型优质畜牧业比重。两伐桑枝若能开发作为粗饲料来源，既可以更大程度上延长桑蚕产业的价值链，同时也能够在一定程度上缓解饲草资源短缺的问题，促进畜牧业生产可持续发展，因此其饲料化的开发利用研究具有深刻的现实需求与经济价值。 [0004] 鲜绿粗饲料资源最常见的利用方式包含鲜饲、烘干粉碎以及加工青贮等。桑树为多年生木本植物，含有柔韧的纤维外皮和坚硬的木质化成分，这使得两伐桑枝鲜饲或者烘干的利用方式大受制约。两伐桑枝产量大、收集成本低，营养成分不算高，其富含黄酮、多糖等多种具备抗氧化、增加免疫能力的有效成分，同时其纤维成分也是较好的膳食纤维来源，这使得两伐桑枝具有开发成具备一定功能的饲料的潜力，但两伐桑枝可溶性糖含量较低，其自然青贮的效果和效率均较差，极为容易导致营养损失与腐败，当前，两伐桑枝青贮化利用主要存在两个需要解决的问题：(1)采用常规粉碎技术，两伐桑枝粉碎程度不够，发酵程度有限，且粒径较大的木质化成分容易形成尖刺，影响加工和动物适口性。(2)由于两伐桑枝自身营养品质较低，可溶性碳水化合物(WSC)含量不足。且利用自身附着的微生物进行发酵会有一定局限性等问题而导致青贮不易成功。 【发明内容】 [0005] 本发明针对两伐桑枝青贮存在的问题，研究如何通过优化两伐桑枝的青贮条件，从而提升对废弃物两伐桑枝的应用范围，能最大程度的变废为宝，通过优化菌剂和辅剂以期可以针对性地提高两伐桑枝青贮的发酵效率和发酵程度，改善其营养价值与适口性，提升两伐桑枝青贮饲料的品质。 [0006] 青贮饲料的复合菌剂，所述复合菌剂包括米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XMS03，该菌株是课题组的发明人在广西壮族自治区畜牧研究所任职期间筛选而得，已公开在在先的专利申请：201910366868.6中； [0007] 其中，米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01保藏编号为CCTCC:M2018425，保藏于： 中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年7月2日；植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XMS03保藏编号为CCTCC:M2019003；保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年1月2日。 [0008] 进一步的，所述复合菌剂用于发酵两伐桑枝。 [0009] 本发明还包括包含所述复合菌剂的青贮饲料。 [0010] 进一步的，所述青贮饲料中还包含了糖蜜和纤维素酶。 [0011] 本发明还包括一种制备所述青贮饲料的方法，所述方法为：将两伐桑枝粉碎后加入益生菌和添加剂混合后青贮而得； [0012] 所述益生菌由米曲霉和植物乳杆菌组成；所述米曲霉为：米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，保藏编号为CCTCC:M2018425，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年7月2日；所述植物乳杆菌为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)XMS03，保藏编号为CCTCC:M2019003，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年1月2日，该菌株是课题组的发明人在广西壮族自治区畜牧研究所任职期间筛选而得，已公开在在先的专利申请： 201910366868.6中； [0013] 所述添加剂包括糖蜜和/或纤维素酶。 [0014] 进一步的，所述糖蜜的添加量为底物质量的4％和纤维素酶的酶活大于等于 5000U/g。 [0015] 进一步的，所述米曲霉的活菌数大于等于6.3×107CFU/g；所述植物乳酸菌的活菌 7 数大于等于3.1×10CFU/g。 [0016] 进一步的，所述青贮饲料青贮的时间为45d。 [0017] 本发明还包括所述青贮饲料或所述方法制备得到的青贮饲料在养鸡中的应用，所述应用为：将青贮饲料按照质量百分比为6％的添加量添加青贮饲料到基础料中对鸡进行饲喂。 [0018] 本发明还包括所述青贮饲料或所述方法制备得到的青贮饲料在降低鸡的腹脂含量上的应用。 [0019] 本发明具有以下有益效果： [0020] 1、非粮原料中添加米曲霉和乳酸菌等菌剂后进行青贮加工，可以有效改善其营养价值和发酵品质。米曲霉属于好氧益生菌，产纤维素酶、淀粉酶、糖化酶等复合酶，可以辅助纤维素等分解，降解饲料中复杂有机物，促进消化吸收，提高饲料利用率，且其前期的好氧发酵可以快速消耗残存的氧气，使得环境迅速进入无氧发酵阶段。植物乳杆菌属于同型发酵乳酸菌，能够有效加强青贮饲料乳酸菌主导作用，降低微贮饲料的pH，抑制有害菌的生长，能够维持肠道内菌群平衡，促进营养物质吸收。纤维素酶可以在青贮饲料中催化降解纤维素及其衍生物，释放胞内淀粉、蛋白质等易消化吸收的营养物质，提高肠道养分的利用率。糖蜜作为一种蔗糖产业的副产物，富含可溶性糖类，成本适中，非常适宜于作为微生物发酵的特别是乳酸菌发酵的能量来源与碳源。 [0021] 2、本申请根据两伐桑枝营养含量低，自然青贮不易成功的特性，通过优化青贮条件，先进行了菌株筛选，筛选出了能在桑枝底料中具有较高酶活的菌株：米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01，然后通过优化筛选发现植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)XMS03对米曲霉(Aspergillus oryzae)XMS01的漆酶和木质素过氧化物酶有促进作用，从而选定了菌株XMS03和菌株XMS01联合对两伐桑枝进行青贮，有效提升了桑枝的青贮效率，同时，进一步优化辅剂在青贮的过程中添加了纤维素酶和糖蜜提升了青贮饲料中桑枝的分解，两伐桑枝青贮的营养价值和发酵品质均有不同程度提升，通过微生物多样性的检测发现，并可增加厚壁菌门及乳酸菌属的相对丰度，同时降低变形菌门、克雷伯氏菌属、泛菌属、肠杆菌属的相对丰度，有效抑制了丁酸发酵，改善青贮发酵品质，两伐桑枝的适口性更好。通过养殖试验发现，本申请的桑枝青贮饲料能降低鸡的腹脂含量。 [0022] 3、两伐桑枝的营养组成以及物理结构均与常见的牧草等差异较大。因此，针对两伐桑枝青贮存在的问题，本研究团队从上述4个研究经验入手，通过加大粉碎粒度、添加米曲霉、植物乳杆菌、糖蜜、纤维素酶等方式，研究其对两伐桑枝青贮营养成分、发酵品质和微生物组成的影响，以期可以针对性地提高两伐桑枝青贮的发酵效率和发酵程度，改善其营养价值与适口性等关键性的技术问题。有效提高了对废弃物两伐桑枝的应用范围，能最大程度的变废为宝，同时，由于使用的原料是两伐桑枝，获取的方式更简单、成本更低廉，而且相对现有技术报道的全株桑枝来讲，发酵底物的营养成分更稳定，提升了两伐桑枝的应用范围。 【附图说明】 [0023] 图1为不同添加剂组合对两伐桑枝青贮门分类水平群落组成的影响图。 [0024] 图2为不同添加剂组合对两伐桑枝青贮属分类水平群落组成的影响图。 [0025] 图3为不同桑枝青贮饲料养殖后内脏脂肪含量情况示意图；图中A为对照组饲喂基础日粮，B为实验组的桑枝青贮饲料。 【具体实施方式】 [0026] 下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。 [0027] 本实施例采用了3株自行筛选的微生物进行实验，该菌株是课题组的发明人在广西壮族自治区畜牧研究所任职期间筛选而得，已公开在在先的专利申请：201910366868.6中，具体为：米曲霉Aspergillus oryzae XMS01(以下简称XMS01)，保藏编号为CCTCC: M2018425，保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年7月2日；植物乳杆菌Lactobacillusplantarum XMS02(以下简称XMS02)，保藏编号为CCTCC:M2019002；保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年1月2日；植物乳杆菌Lactobacillusplantarum XMS03(以下简称XMS03)，保藏编号为CCTCC:M2019003；保藏于：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年1月2日。 [0028] 本实施例中采用的所有材料与试剂为：两伐桑枝于2023年12月中旬，在广西壮族自治区河池市宜州区农户桑园采集，桑园为了提高桑叶产量和质量，每年的夏季以及冬季，对整株桑树地面30～50cm以上部分进行伐枝与修剪处理，第一次、第二次修剪下来的废弃桑枝称为两伐桑枝，新鲜的两伐桑枝刈割后使用具有揉搓粉功能粉碎机将其粉碎至1～ 7 7 0.5cm和0.3cm以下备用。米曲霉培养物(6.3×10CFU/g)和植物乳酸菌液(3.1×10CFU/g)为广西农业职业技术大学畜牧研究院动物营养实验室保存提供，饲用复合微生物制剂为市 7 7 售商品菌(含有:乳酸片球菌≥5×10CFU/g，酿酒酵母≥25×10CFU/g，纤维素酶≥200U/g、木聚糖酶≥100U/g)购自某生物科技有限公司(按照使用方法制作青贮)，糖蜜和纤维素酶(≥5000U/g)购自某化学试剂有限公司。 [0029] 实施例1： [0030] 1、试验设计： [0031] (1)两伐桑枝原料特性 [0032] 原料营养成分如表1所示，两伐桑枝原料的DM含量较高，为51.1％；CP含量为 5.12％；ADL、ADF、NDF含量较高，分别为14.45％，53.58％、64.65％，CT含量为3.91mg/g，多糖含量为20.11mg/g，总黄酮含量为0.87mg/g，WSC含量较低，为5.32％。 [0033] 表1两伐桑枝原料营养成分(干物质基础) [0034] [0035] 从上表我们可以发现，虽然两伐桑枝是一种常见可容易获得的有机废料，但是相比于玉米秸秆、桑叶等牧草、叶片类废料，两伐桑枝自身营养品质较低，可溶性碳水化合物(WSC)含量不足，利用自身附着的微生物进行发酵会有一定局限性等问题而导致青贮不易成功。而且即使在某些现有技术中报道具有良好青贮功能的微生物在青贮发酵桑枝时也不一定能获得成功，为此，针对两发桑枝的营养特性我们需要针对性的进行微生物的筛选。 [0036] (2)菌株的筛选： [0037] 在长期的研究中我们发现，部分霉菌发酵时能够产生漆酶，从而加速木质素的分解，然而现有技术中并没有发现乳酸菌能够产生漆酶的报道，为此，我们对本实验室筛选的益生菌都进行了相关实验，最终发现：申请人自行筛选的米曲霉XMS01能够产生漆酶、木质素过氧化物酶，而植物乳杆菌XMS03的复合使用，能进一步增强漆酶的分泌，具体试验如下： [0038] ①培养基初筛： [0039] 将实验室保存的20株细菌放入初筛培养基上培养，从初筛培养基上筛选出了3株霉菌同时在复筛培养基(选择愈创木酚‑PDA培养基和苯胺蓝‑PDA培养基)中出现褪色圈或/和显色圈。且褪色圈或显色圈出现时间较快且直径圈较大，表明其产漆酶和过氧化物酶能力较强。 [0040] ②桑枝复筛： [0041] 为了能筛选出针对桑枝具有有效分解作用的培养菌，将筛选出来的3株霉菌再进行复筛，具体为，将3株菌，再分别接入以桑叶为唯一碳源或桑枝为唯一碳源的初始固态产酶培养基中，以筛选出高效降解桑枝的菌株，结果发现3株菌株中，仅有XMS01对桑枝培养基具有降解活性，具体的木质素酶活见表2。 [0042] 表2木质素降解菌的木质素酶活 [0043] [0044] 注：同列数据肩标相同小写字母或不标字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 [0045] 由表1可知，筛选出的XMS01、XMS61、XMS83在桑叶碳源培养基中都能分泌出漆酶和木质素过氧化物酶，分泌量XMS01>XMS61>XMS83，且差异显著(P<0.05)，但是更换为桑枝碳源培养基后，由于碳源的改变，XMS01分泌漆酶和木质素过氧化物酶的量有减少，且与桑叶碳源相比差异显著(P<0.05)，XMS61和XMS83并不能分泌出漆酶和木质素过氧化物酶，说明，桑枝的营养品质较低，部分微生物并不适合发酵桑枝。 [0046] 此外，对植物乳杆菌XMS02和植物乳杆菌XMS03的鉴定发现，这两株乳酸菌并不能产生木质素降解的相关漆酶或木质素过氧化物酶。 [0047] 在实际应用时，为了提高微生物的多样性，提升对桑枝的发酵能力和饲料适口性、保健功能，发明人考虑将霉菌和乳酸菌联合使用，因此，发明人将乳酸菌和米曲霉XMS01复合使用，制备成复合菌剂研究乳酸菌对木质素相关酶活的影响，具体如下： [0048] 组1：将植物乳杆菌XMS02与米曲霉XMS01按照质量比为1:1混合制备得到复合益生菌，然后按照质量百分数为5％的添加量添加到以桑枝为唯一碳源的初始固态产酶培养基中，测定酶活。 [0049] 组2：将植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01按照质量比为1:1混合制备得到复合益生菌，然后按照质量百分数为1％的添加量添加到以桑枝为唯一碳源的初始固态产酶培养基中，测定酶活。 [0050] 对照组：将米曲霉XMS01按照质量百分数为1％的添加量添加到以桑枝为唯一碳源的初始固态产酶培养基中，测定酶活。得到的结果如表3所示。 [0051] 表3不同菌剂对桑枝培养基的木质素酶活 [0052] [0053] 由表3可知，组1分泌的漆酶和木质素过氧化物酶酶活与对照组相比，差异不显著(P>0.05)，而组2分泌的漆酶和木质素过氧化物酶酶活与对照组相比，显著提升(P<0.05)，提升率分别为：68.47％和15.67％，由此说明，使用植物乳杆菌XMS03和米曲霉XMS01混合制备得到复合菌剂能提升漆酶和木质素过氧化物酶的酶活，然而我们在前期研究发现，单独使用植物乳杆菌XMS03并没有产生漆酶和木质素过氧化物酶，植物乳杆菌XMS03和米曲霉XMS01联合使用后漆酶和木质素过氧化物酶的活性增强了，这大概率是因为植物乳杆菌XMS03在发酵时产生了某些物质促进了米曲霉XMS01产酶，而植物乳杆菌XMS02并无该功效。 [0054] 为此，我们选择植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01做为复合菌剂进行后续的桑枝发酵实验。 [0055] 实施例2： [0056] 本实施例T1‑T3使用的米曲霉和植物乳杆菌分别为：米曲霉XMS01和植物乳杆菌XMS03，T4的复合菌剂为市购。 [0057] 1、采用单因子试验设计，以桑枝鲜重计算各添加剂的添加量。 [0058] 添加纯水为对照组CK，其余4组为试验组T1、T2、T3、T4，每个处理设3个重复，具体试验设计见表4。青贮原料与添加菌剂充分混匀，装入带有单向排气阀青贮袋，用手压式封口机封口，每袋装样品3kg，室温青贮45d拆封，每袋青贮混合均匀，取样分析。 [0059] 表4试验设计 [0060] [0061] (1)营养成分测定：取青贮样品200g左右放置瓷盘摊平置于鼓风干燥箱中，调节温度65℃，烘干48小时取出，用于营养成分测定，干物质DM、粗蛋白CP、酸性洗涤木质素ADL、酸性洗涤纤维ADF和中性洗涤纤维NDF,参照《饲料分析及资料质量检测技术》进行测定。氨态氮(NH3‑N)测定方法：苯酚‑次氯酸钠比色法。用蒽酮比色法测定可溶性碳水化合物(WSC)含量。单宁含量参照：GB/T 27985‑2011饲料中单宁的测定‑‑分光光度法。总黄酮参照SN/T4592‑2016出口食品中总黄酮的测定。多糖含量参照GB/T 40632‑2021竹叶中多糖的检测方法。 [0062] (2)pH及发酵品质测定：取青贮样品20g，加入180mL蒸馏水，搅拌均匀，用榨汁机榨汁1min，4层纱布过滤后再用中速定性滤纸过滤，得到浸提液，采用pH计测量。 [0063] 有机酸参测定方法：采用Dionex Ultimate 3000液相色谱仪，LPG－3400型泵，VWD－3400紫外检测器，Thermo Hypersil BDS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)测定乳酸(LA)，乙酸(AA)丙酸(PA)和丁酸(BA)的浓度。 [0064] (3)微生物多样性测定：青贮结束，将每袋青贮混合均匀，用无菌钳采样并迅速放入经过灭菌的离心管内，液氮速冻，‑80℃冰箱保存。测序与生物信息学分析委托广西南宁奥美克生物科技有限公司完成。 [0065] (4)统计分析 [0066] 利用Excel软件进行记录整理，采用SPSS17.0对数据进行单因素方差分析(One‑way ANOVA)，各处理数据间用Duncan法进行多重比较。 [0067] 2、得到的结果如下： [0068] (1)不同添加剂组合对两伐桑枝青贮营养成分的影响： [0069] 表5不同添加剂组合对两伐桑枝青贮营养成分的影响(干物质基础) [0070] [0071] 注：1.同行数据肩标相同小写字母或不标字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 [0072] 从表5可知，与CK组对比，在添加米曲霉与植物乳杆菌T1组基础上添加糖蜜+纤维素酶(T3)，CP和WSC含量显著提高。这表明，添加米曲霉与植物乳杆菌基础上添加糖蜜和纤维素酶混合发酵效果更佳。这可能是米曲霉等好氧微生物繁殖生长，并分泌积累非淀粉多糖酶及一些结构较为复杂的蛋白质，快速消耗完原料青贮空间氧气，为乳酸菌快速提供厌氧生长环境。添加糖蜜可以提高两伐桑枝的WSC含量，纤维素酶也通过作用于B‑1,4‑葡萄糖苷键将植物细胞壁纤维素降解为单糖或双糖，也增加WSC含量，WSC含量的提高促进乳酸菌的数量逐渐增加，缩短了青贮发酵进入稳定阶段，使蛋白质和其他杂菌对发酵底物的消耗量减少，从而使青贮饲料中NDF和ADF含量减少，CP含量相对增加。T1、T2、及T3组ADL、ADF及NDF含量显著低于CK和T4组(P＜0.05)，说明添加米曲霉与植物乳杆菌为基础T1、T2及T3组均具有降低两伐桑枝ADL、ADF及NDF含量的效果。米曲霉对原料中纤维素类等大分子物质进行降解成小分子单糖，纤维降解提高原料发酵品质。现有技术的研究发现甘蔗尾添加植物乳杆菌青贮显著降低了ADF和NDF含量。本试验发现其中以T3组ADL、ADF及NDF含量显著低于T1和T2组，说明添加在T2基础上添加纤维素酶，菌剂间互作效应降低ADL、ADL及ADF，以T3组降解纤维效果最好，提高了青贮桑枝适口性及营养价值，进而提高动物采食量和消化率。与CK组对比，各试验组单宁含量显著下降(P＜0.05)，其中T3的单宁含量显著低于其它组(P＜ 0.05)，说明菌株植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01都有不同程度的分解桑枝单宁的作用，联合使用效果更好。T3组多糖含量高于CK组，这表明两伐桑枝添加米曲霉+植物乳杆菌+糖蜜+纤维素酶青贮后提高了发酵产物多糖含量，可能是两伐桑枝通过超细粉碎后硬度降低，表面积进一步增加，与所选的菌剂米曲霉、乳酸菌、纤维素酶和糖蜜相互之间存在较好的协同发酵作用，保留了药用成分,可以促进动物的机体生长和发育。各试验组黄酮含量显著提升(P＜0.05)，其中T1、T2和T3组的黄酮含量显著高于CK组和T4组(P＜0.05)，说明菌株植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01都有不同程度的提升桑枝黄酮析出的作用，联合使用效果更好，这也说明了植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01针对桑枝原料有更好的发酵青贮效果。 [0073] 此外，T1组‑T4组的饲料粉碎程度低于CK组，由此说明，青绿饲料粉碎程度越细，其结构破损程度越高，营养成分的释放越多，底物与微生物接触的比表面积也越大，这使得青贮发酵的效率和效果可以得到较大的提升。 [0074] (2)不同添加剂组合对两伐桑枝青贮品质的影响 [0075] 表6不同添加剂组合对两伐桑枝青贮品质的影响 [0076] [0077] ND：未检测到 [0078] 从表6可知，T1、T2及T3组pH显著低于CK及T4组(P＜0.05),3个组间差异不显著(P> 0.05)，一般优良青贮饲料的pH为3.8‑4.2。本试验中CK和T4组pH为4.30和4.22，T1、T2及T3组pH较CK和T4组均有不同程度降低，pH范围为3.8‑3.95，三组均达到优质级，推测主要由于T1、T2及T3中添加乳酸菌，随着青贮的持续发酵，乳酸菌含量积累且成主导地位，使得pH值降低；所有试验组NH3.N含量均低于CK组，其中T3显著低于对照组(P＜0.05)，主要是由于自然青贮CK组pH降低速度较慢，有害微生物为营养增殖消耗蛋白质，而产生较多的NH3.N。而添加米曲霉+植物乳杆菌+糖蜜+纤维素酶(T3组)加强了青贮饲料乳酸菌主导作用，快速形成的较低pH环境抑制了植物蛋白酶的活性和有害微生物生长,减少CP、WSC的降解，产生的 3 NH .N较少，提高了两伐桑枝青贮饲料发酵品质。T1、T2及T3组的LA含量显著高于CK和T4(P＜0.05)，其中T3组显著高于T1、T2，T3额外添加糖蜜和纤维素酶，为乳酸菌提供更多发酵底物WSC，产生更多有机酸，因此发酵产生大量LA，进而限制蛋白质水解活性和不良微生物的生长，降低不良微生物丰度，同时氨态氮含量也降低。T1、T2及T3均未检测到AA和BA。CK和T4组均含有少量丁酸，说明T1、T2及T3三组青贮饲料未发生梭菌和丁酸发酵，推测由于三组两伐伐桑枝通过超细粉碎后增加有效成分的溶出度，与添加的菌剂形成的较低pH，快速酸化抑制有害微生物的增殖，进而提高青贮发酵品质，同时也可能与两伐本身具有多糖、黄酮、生物碱类等活性物质，而多糖、黄酮类活性物质抑菌作用有关。 [0079] (3)不同添加剂组合对两伐桑枝青贮微生物多样性的影响 [0080] ①不同添加剂组合对两伐桑枝青贮微生物Alpha多样性的影响：observed_otus及chao1指数表征物种丰富度，Shannon及simpson指数表征细菌菌群的多样性。具体见表7。 [0081] 表7不同添加剂组合对两伐桑枝青贮微生物Alpha多样性的分析 [0082] [0083] observed_otus及chao1指数表征数量的高低，其值越高，表明物种越丰富，Shannon及simpson指数表征细菌菌群的多样性，其值越高，表明多样性越高。通常将微生物多样性降低作为青贮发酵成功的标志，由表7可知，chao1和observed_otus指数以CK、T1、T2及T3组显著低于T4组(P<0.05)；Shannon指数和Simpson指数均以CK和T4显著性高于T1、T2及T3(P<0.05)。说明observed_otus、chao1、Shannon的指数均以饲用复合微生物制剂(T4)物种数量最丰富，多样性水平高，T1、T2及T3组的Shannon和Simpson指数明显低于T4组和CK组，菌群多样性降低。这表明不同菌剂组合对两伐桑枝青贮微生物菌群Alpha多样性有显著影响。说明添加米曲霉与植物乳杆菌为基础的组合菌剂有益于两伐桑枝青贮乳酸杆菌能够快速主导整个发酵过程，成为优势菌群，呈微生物多样性下降状态。CK和T4组物种丰富度和多样性较高，推测自然青贮或添加菌剂中酸化条件的缺失，导致原料酸化进程的速度与程度的降解慢，乳酸杆菌没有成为主导优势，促进有害菌的增值，导致微生物丰富度高和多样性上升状态。5个组的覆盖率指数都是1，说明样本测序全面覆盖微生物核心组成。 [0084] ②不同添加剂组合对两伐桑枝青贮门水平微生物群落组成的影响： [0085] 如图1和表8所示。 [0086] 表8不同添加剂组合对两伐桑枝青贮门分类水平相对丰度(top10)的影响[0087] [0088] 从表8和图1可见，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)两者的相对丰度之和均大于95％，为各组优势菌门。厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度以T1、T2和T3显著高于CK和T4(P<0.05)，T3组显著高于T1、T2组(P<0.05)，T3组的厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度最高(93.27％)，CK组的相对丰度最低(11.81％)，说明两伐桑枝分别添加米曲霉+植物乳杆菌(T1)、米曲霉+植物乳杆菌+糖蜜(T2)、米曲霉+植物乳杆菌+糖蜜+纤维素酶(T3)青贮均能提高青贮饲料中厚壁菌门所占比例，降低变形菌门所占比例。厚壁菌门主要包括支原体、非产芽孢和产芽孢菌群，可降解如蛋白质、淀粉、纤维素等大分子物质。由于大部分的乳酸菌属于厚壁菌门，说明T1、T2和T3三组含有益生物含量高，且以T3组益生物含量最高，从而更好的抑制青贮发酵过程中有害微生物的繁殖，进而降低致病菌对采食青贮的动物健康存在的潜在风险。同时降低变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度，其中以T1、T2及T3的变形菌门(Proteobacteria)均显著低于CK及T4(P<0.05),CK组的变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高(87.04％)，T3组的相对丰度最低(4.17％)，变形菌门包括如大肠杆菌、沙门氏菌等大部分的病原菌，说明自然青贮CK和T4组的病原等微生物增值，与乳酸菌竞争底物，且会导致氨态氮含量的升高和CP含量下降，pH升高，产生少量丁酸，降低青贮发酵品质，这解析了CK和T4组氨态氮含量、pH的升高，CP含量下降及产生丁酸原因。 [0089] ③不同添加剂组合对两伐桑枝青贮属水平微生物群落组成的影响： [0090] 如图2和表9所示。 [0091] 表9不同添加剂组合对两伐桑枝青贮属分类水平相对丰度(top10)的影响[0092] [0093] 由表9和图2可知，CK组主要由非乳酸菌属组成，包括泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、小球菌属(Pediococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)，相对丰度分别为 50 .58％、26 .56％、7.98％、5.88％，总和丰度达到91％，而植物乳杆菌(Lactiplantibacillus)相对丰度极低，仅为于0.85％，说明两伐桑枝自然青贮不易成功，其他菌属为非乳酸菌包括泛菌属、克雷伯氏菌属，小球菌属、肠杆菌属等占绝对优势，腐败菌未得到抑制。T1、T2、T3组以植物乳杆菌(Lactiplantibacillus)为主，相对丰度依次为 88.19％，87.67％，90.52％。与CK和T4组植物乳杆菌(Lactiplantibacillus)相比，T1、T2、T3组相对丰度显著增加(P＜0.05)，其中T3组显著高于T1、T2组(P<0.05)，说明两伐青贮中添加米曲霉与植物乳杆菌为基础组合菌剂后，产乳酸能力进一步加强，青贮pH逐渐降低，植物乳杆菌相对丰度明显提高，并使有害菌克雷伯氏菌属、肠杆菌属等非乳酸菌属相对丰度明显下降，抑制有害微生物的繁殖，进而提高了T1、T2、T3组发酵品质与营养成分。以T3组添加入纤维素酶后植物乳杆菌相对丰度明显提高，这与任海伟等秸秆与白菜混合添加纤维素酶后乳酸菌属的相对丰度显著提高，并使有害菌肠杆菌属(Enterobacter)丰度明显降低结果一致。T4组肠杆菌属(Enterobacter)相对丰度最高(8.68％)，其次为CK组(5.88％)，非乳酸菌包括泛菌属、克雷伯氏菌属，小球菌属、肠杆菌属等腐败菌群未得到抑制，阻止乳酸菌生长，导致两伐青贮品质、营养类似降低趋势。推测可能是原料自身营养品质低及添加菌剂一起达不到协同作用而使得发酵底物不足，WSC含量的不足降低乳酸菌的增值，而饲用复合微生物制剂虽然含有乳酸片球菌、酿酒酵母、纤维素酶和木聚糖酶等菌剂，广泛应用于各类秸秆原料，但并不是万能青贮复合菌剂，可能与原料自身物理营养特性差异有关，复合微生物之间并没有起到协同作用，青贮效果亦不同，具体原因有待进一步研究。 [0094] 上述结论说明，两伐桑枝自然青贮不易成功，乳酸菌属相对丰度极低，腐败菌未得到抑制。在添加米曲霉+植物乳杆菌的基础上添加糖蜜或糖蜜+纤维素酶对两伐桑枝青贮的营养价值和发酵品质均有不同程度提升，并可增加厚壁菌门及乳酸菌属的相对丰度，同时降低变形菌门、克雷伯氏菌属、泛菌属、肠杆菌属的相对丰度，有效抑制了丁酸发酵，改善青贮发酵品质，两伐桑枝的适口性更好。添加饲用复合微生物制剂青贮，其物种数量最丰富，菌群多样性高，腐败菌未得到抑制。综合考虑，以两伐桑枝添加米曲霉+植物乳杆菌+糖蜜+纤维素酶青贮效果最佳。可在两伐桑枝青贮中应用。 [0095] 实施例3： [0096] 利用青贮饲料对富凤麻鸡进行养殖，具体如下： [0097] 选择80日龄的富凤麻鸡进行养殖，养殖以散养为主，按照常规的管理方法对富凤鸡进行喂养，喂养时，基础料由如下质量百分比的成分组成：玉米65％，豆粕16％，次粉7％，玉米DDGS5％，膨化大豆4％，豆油1％，预混料2％；对照组为饲喂基础日粮,,然后向基础料中分别添加0％、3％、6％和9％的实施例2T3组或T4组制备得到的两伐桑枝青贮饲料进行饲喂，每组3个平行，每个平行50羽。喂养80d后结束实验，饲养试验结束，从每组中抽取体质量相近的10羽试验鸡，空腹称重后进行屠宰试验，测定屠宰率和腹脂率、在喂养过程中记录鸡的成活情况，记录成活率和喂养结束后根据饲料损耗和增重计算料重比，其中，料重比为平均日采食量与平均日增重量的比值。 [0098] 表10不同饲料对鸡屠宰性能、成活率及料重比的影响 [0099] [0100] 注：1.同列数据肩标相同小写字母或不标字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 [0101] 由表10可知，从屠宰率来看，(6％、9％)T3两伐桑枝饲料的2个实验组屠宰率显著高于其他实验组和CK组(P<0.05)。 [0102] 从腹脂率来看，(6％、9％)T3两伐桑枝饲料的2个实验组腹脂率显著低于其他实验组和CK组(P<0.05)，两组相比，(9％)T3两伐桑枝饲料实验组的腹脂率显著低于(6％)T3两伐桑枝饲料实验组(P<0.05)，然而腹脂率太低，鸡的口感并不好，综合来看(6％)T3两伐桑枝饲料实验组的喂养效果更符合商业价值。 [0103] 从成活率来看，(3％、6％、9％)T3两伐桑枝饲料的3个实验组成活率显著高于其他实验组和CK组(P<0.05)。 [0104] 从料重比来看，(6％)T3两伐桑枝饲料的实验组料重比显著低于其他实验组和CK组(P<0.05)。 [0105] 综合上述实验结果我们可以看出两伐桑枝经过自行筛选的菌株植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01发酵后制备的饲料，其养殖效果要显著优于添加市售菌株的发酵制备得到的饲料(T4)，其产肉性能得到提升，脂肪含量显著降低，成活率显著提升，结合表5的营养成分分析，我们认为使用自行筛选的菌株植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01发酵两伐桑枝析出了更多的桑枝黄酮、多糖等活性成分，能显著提升鸡的免疫力，提高鸡的成活率。此外，T3饲料组的料重比小于对照组，结合表5的营养成分分析，我们认为桑枝经过植物乳杆菌XMS03与米曲霉XMS01发酵之后桑枝饲料中的单宁含量显著降低，适口性显著提升，营养价值提升，鸡更容易采食，鸡的生产饲养性能提高。然而T3两伐发酵桑枝饲料的添加并非越多越好，综合口感、商业价值等因素我们认为质量百分比在6％是最适合的添加量。 [0106] 此外，两伐桑枝饲料的添加还能显著降低富凤麻鸡的内脏脂肪含量，满足消费者对鸡肉含脂率购买需求，具体可参见图3所示，图3B图为(6％)T3两伐桑枝添加量实验组的鸡内脏，A图为对照组(CK)的鸡内脏，可见，对照组鸡内脏脂肪明显比实验组更多更厚。 [0107] 综上所述，本申请根据两伐桑枝自然青贮不易成功的特性，通过优化青贮条件，先进行了菌株筛选，筛选出了适合桑枝青贮的菌株，之后通过进一步优化辅剂：糖蜜和纤维素酶的使用，进一步提升了青贮饲料中桑枝的分解，两伐桑枝青贮的营养价值和发酵品质均有不同程度提升，通过微生物多样性的检测发现：可增加厚壁菌门及乳酸菌属的相对丰度，同时降低变形菌门、克雷伯氏菌属、泛菌属、肠杆菌属的相对丰度，有效抑制了丁酸发酵，改善青贮发酵品质，两伐桑枝的适口性更好。养殖后能降低鸡的腹脂率，使鸡肉口感相对清爽、鲜嫩，对提高鸡肉品质有积极的作用。 [0108] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。