[0001] 本发明属于土壤和地下水污染修复技术和生物工程技术领域，具体地，涉及一种膝形假单胞菌，包含该膝形假单胞菌的菌剂，所述膝形假单胞菌与菌剂在降解多环芳烃及修复多环芳烃污染土壤或多环芳烃污染地下水中的应用，以及一种降解多环芳烃的方法。

[0002] 多环芳烃是环境中广泛存在的有机污染物，具有致癌、致畸和致突变作用，容易在环境中累积，对生态环境和人身健康影响长远。目前，常用的多环芳烃污染修复方法主要有热脱附、化学氧化和生物降解。相较于物理和化学修复，生物修复具有成本低、操作简便、二次污染小等优点，是绿色、可持续的环境治理技术。

[0003] CN113755338B公开了一株多环芳烃降解菌Pyronema domesticum LJD‑1及其菌剂和应用。该菌株由某石油污染场地土壤样品中驯化和分离得到，能够利用菲作为碳源。在菲初始浓度为50mg/L的无机盐培养液中培养7天，菲降解率可达到79.1％；将其制成菌剂，菲降解率为61.0％。

[0004] CN104004684B公开了一株多环芳烃降解菌Bacillus sp.s8‑t8‑L9及其应用。该菌株能够利用萘、菲、芘等多环芳烃以及柴油作为唯一能源和碳源生长繁殖，20天可将无机盐培养基中的萘、菲、芘和柴油分别降解58.46％、52.14％、23.14％和47.54％。

[0005] CN106434470B公开了一株多环芳烃降解菌Rhodococcus sp.YE‑WL‑2及其应用。该菌株可在荧蒽浓度高达300mg/L的溶液中生长。当荧蒽初始浓度为50mg/L时，菌株可在7天内将培养基中荧蒽降解40％以上，培养14天对荧蒽的降解率达50％以上，培养21天对荧蒽的降解率达60％以上。

[0006] 现有技术中菌株对多环芳烃的降解率大多不足80％，修复效率不高成为微生物修复技术应用的瓶颈。因此，挖掘高效的多环芳烃降解菌，对于促进微生物修复的应用意义重大。

[0020] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0021] 本发明第一方面提供一种膝形假单胞菌(Pseudomonas geniculata)，所述膝形假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.22735。

[0022] 本发明的膝形假单胞菌筛选自天津地区受多环芳烃污染的土壤。

[0023] 所述筛选的方法包括：采集污染土壤，加入灭菌后的去离子水中，制成接种液；将接种液接种于以菲为唯一碳源的无机盐培养基中，传代3‑5次；将上述培养液进行浓度梯度稀释，连续划线培养至单菌落被分离；采用LB培养基对上述单菌落进行扩大化培养，离心得到菌体，即待鉴定菌株。将得到的菌体用灭菌后的生理盐水重悬得到菌悬液，将菌悬液以1:1的体积比例混合于70％甘油中，‑80℃冰箱内保存。

[0024] 所述待鉴定菌株在琼脂固体培养基平板上菌落形态规则，呈黄色圆珠状突起，单菌落较大，菌落表面光滑湿润，有光泽感，不透明，如图1所示。通过16S rDNA测序方法鉴别该菌株的种属，将该菌株确定为膝形假单胞菌，命名为NAP‑1。

[0025] 将膝形假单胞菌NAP‑1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号CGMCC No.22735，保藏日期为2021年06月21日。

[0026] 本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂含有如上所述的膝形假单胞菌。

[0027] 本发明的一些实施方式中，该菌剂为液体菌剂和/或固体菌剂。在本发明的所述菌剂中，所述膝形假单胞菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。本9
发明的一些实施方式中，所述液体菌剂中的活菌数为10 cfu/mL以上。本发明的一些实施方
9
式中，所述固体菌剂中的活菌数为10cfu/g以上。

[0028] 本发明的一些实施方式中，所述菌剂中还可以含有辅料。所述辅料可以为不会对膝形假单胞菌的活性造成影响的、本领域常用的辅料。

[0029] 另外，根据预定用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型。例如粉剂、膏剂、液体剂等。

[0030] 所述菌剂的制备方法可以为本领域常规的制备方法。优选的情况下，所述制备方法包括：将如上所述的膝形假单胞菌活化后在培养基中进行培养，得到菌液原液；将菌液原9
液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液并使菌悬液中的活菌数达到10 cfu/mL以上，得到菌剂。其中，所述培养基可以为本领域常规用于培养膝形假单胞菌的培养基，例如可以为LB培养基。发明人研究发现，本发明所述膝形假单胞菌可以在LB培养基中进行培养。优选的情况下，出于生产成本、操作便利性等方面的考虑，所述培养基为LB培养基。

[0031] 本发明中，所述培养的条件可以为本领域公知的常规的用于膝形假单胞菌培养的条件，本发明对此没有限定。

[0032] 本发明第三方面提供如上所述膝形假单胞菌或如上所述的菌剂在降解多环芳烃中的应用。

[0033] 本发明第四方面提供如上所述膝形假单胞菌或如上所述的菌剂在修复多环芳烃污染土壤或多环芳烃污染地下水中的应用。

[0034] 本发明第五方面提供一种降解多环芳烃的方法，该方法包括：将如上所述膝形假单胞菌或如上所述的菌剂与含多环芳烃的污染物接触。

[0035] 本发明中，所述多环芳烃指的是含有至少2个苯环的芳烃中的至少一种，既包括稠环型多环芳烃，也包括非稠环型多环芳烃。

[0036] 具体地，所述多环芳烃包括但不限于萘、蒽、菲、芘、 苯并芘、苯并蒽、苯并荧蒽、茚并芘、联苯(即联二苯)、联多苯和多苯代脂肪烃的中的至少一种。所述苯并芘包括如苯并[a]芘、苯并[e]芘。所述苯并蒽包括如苯并[a]蒽、二苯并[a,h]蒽。所述茚并芘包括如茚并[1,2,3‑cd]芘。所述联多苯可以为联三苯等，所述多苯代脂肪烃可以为二苯甲烷、二苯乙烷等。

[0037] 本发明的一些实施方式中，所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的土壤或含多环芳烃的地下水。

[0038] 本发明的一些实施方式中，当所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的土壤时，以多环芳烃计，所述多环芳烃的含量为2‑1000mg/kg土壤，例如可以为2mg/kg土壤、5mg/kg土壤、10mg/kg土壤、50mg/kg土壤、100mg/kg土壤、200mg/kg土壤、300mg/kg土壤、500mg/kg土壤、700mg/kg土壤、1000mg/kg土壤中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。其中，所述土壤重量以干基计。

[0039] 本发明中，所述膝形假单胞菌或所述菌剂的使用量可以在较宽的范围内进行选择。本发明的一些实施方式中，所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的土壤时，所述膝形6 8
假单胞菌或所述菌剂的用量使得所述含多环芳烃的土壤中活菌数为10 ‑10cfu/g。其中，所述土壤重量以干基计。

[0040] 本发明的一些实施方式中，所述接触的条件包括：温度为20‑40℃，pH值为5‑10。其中，所述温度可以为20℃、23℃、26℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。其中，所述pH可以为5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.6、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.3、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.8、10.0中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。优选的情况下，为了进一步提高多环芳烃降解率，所述接触的条件为：温度25‑38℃，pH5.8‑9.2。发明人发现，当所述接触条件在上述优选的范围内时，多环芳烃降解率能够进一步提高。

[0041] 本发明的一些实施方式中，当所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的地下水时，以多环芳烃计，所述多环芳烃的浓度为2‑1000mg/L地下水，例如可以为2mg/L地下水、5mg/L地下水、10mg/L地下水、50mg/L地下水、100mg/L地下水、200mg/L地下水、300mg/L地下水、500mg/L地下水、700mg/L地下水、1000mg/L地下水中任意一个值或上述任意两个值组成的范围内的数值。

[0042] 本发明的一些实施方式中，所述含多环芳烃的污染物为含多环芳烃的地下水时，6
所述膝形假单胞菌或所述菌剂的用量使得所述含多环芳烃的地下水中活菌数为10 ‑
8
10cfu/mL。

[0043] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，除特殊说明外，所用试剂和原料均可通过商购得到，所用方法均为本领域常规方法。

[0044] 以下实施例中：

[0045] LB培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，去离子水1L。

[0046] 无机盐培养基：NH4Cl 0.67g/L，NaNO3 1.06g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2 0.1g/L，K2HPO4·3H2O 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，FeCl3·6H2O 0.1g/L，去离子水1L。

[0047] 菲购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0048] 萘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0049] 购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0050] 苯并[a]蒽购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0051] 苯并[b]荧蒽购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0052] 苯并[a]芘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0053] 二苯并[a,h]蒽购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0054] 茚并[1,2,3‑cd]芘购自北京伊诺凯科技有限公司。

[0055] 菌种Pyronema domesticum LJD‑1购自广东省微生物菌种保藏中心。

[0056] 菌种Bacillus sp.s8‑t8‑L9购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0057] 膝形假单胞菌(Pseudomonas geniculata)NAP‑1，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号CGMCC No.22735。

[0058] 污染土壤中的多环芳烃含量的检测方法参照《土壤和沉积物半挥发性有机物的测定气相色谱‑质谱法》HJ 834‑2017进行检测。其中，使用二氯甲烷‑丙酮混合溶液对多环芳烃进行加压流体萃取。当定容体积为1.0mL，进样体积为1.0μL时，测定多环芳烃的方法检出限为0.06‑0.3mg/kg，测定下限为0.24‑1.20mg/kg。

[0059] 无机盐培养基中的多环芳烃浓度的检测方法参照《水质多环芳烃的测定液液萃取和固相萃取高效液相色谱法》HJ 478‑2009进行检测。

[0060] 无机盐培养基中的多环芳烃降解率(％)＝(初始多环芳烃浓度－剩余多环芳烃浓度)/初始多环芳烃浓度。其中，所述初始多环芳烃浓度指的是未接种菌悬液的无机盐培养基中的多环芳烃浓度。

[0061] 污染土壤中的多环芳烃降解率(％)＝(初始多环芳烃含量－剩余多环芳烃含量)/初始多环芳烃含量。其中，所述初始多环芳烃含量指的是未接种菌悬液的污染土壤中多环芳烃含量。

[0062] 实施例1

[0063] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对菲的降解效果。

[0064] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制菲溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得菲浓度为100mg/L，得到菲浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0065] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0066] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述菲浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑
1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下3天和5天的菲降解效果见表1。

[0067] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的菲溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得菲含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到菲含量为100mg/kg的污染土壤。

[0068] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述菲含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下14天和20天的菲降解效果见表1。

[0069] 实施例2

[0070] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对萘的降解效果。

[0071] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制萘溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得萘浓度为100mg/L，得到萘浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0072] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0073] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述萘浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余萘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的萘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑
1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下3天和5天的萘降解效果见表1。

[0074] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的萘溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得萘含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到萘含量为100mg/kg的污染土壤。

[0075] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述萘含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余萘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中萘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下14天和20天的萘降解效果见表1。

[0076] 实施例3

[0077] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对 的降解效果。

[0078] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制 溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得 浓度为100mg/L，得到浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0079] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0080] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述 浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余 含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的 的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度
30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的 降解效果见表1。

[0081] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的 溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得 含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到 含量为100mg/kg的污染土壤。9

[0082] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(10 cfu)接种于上述 含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余 含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中 的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的 降解效果见表1。

[0083] 实施例4

[0084] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对苯并[a]蒽的降解效果。

[0085] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制苯并[a]蒽溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得苯并[a]蒽浓度为100mg/L，得到苯并[a]蒽浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0086] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0087] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]蒽浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[a]蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的苯并[a]蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的苯并[a]蒽降解效果见表1。

[0088] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的苯并[a]蒽溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得苯并[a]蒽含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到苯并[a]蒽含量为100mg/kg的污染土壤。

[0089] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]蒽含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[a]蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中苯并[a]蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的苯并[a]蒽降解效果见表1。

[0090] 实施例5

[0091] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对苯并[b]荧蒽的降解效果。

[0092] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制苯并[b]荧蒽溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得苯并[b]荧蒽浓度为70mg/L，得到苯并[b]荧蒽浓度为70mg/L的无机盐培养基。

[0093] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0094] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[b]荧蒽浓度为70mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[b]荧蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的苯并[b]荧蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的苯并[b]荧蒽降解效果见表1。

[0095] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的苯并[b]荧蒽溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得苯并[b]荧蒽含量为70mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到苯并[b]荧蒽含量为70mg/kg的污染土壤。

[0096] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[b]荧蒽含量为70mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[b]荧蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中苯并[b]荧蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的苯并[b]荧蒽降解效果见表1。

[0097] 实施例6

[0098] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对苯并[a]芘的降解效果。

[0099] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制苯并[a]芘溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得苯并[a]芘浓度为30mg/L，得到苯并[a]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基。

[0100] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0101] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[a]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的苯并[a]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的苯并[a]芘降解效果见表1。

[0102] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的苯并[a]芘溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得苯并[a]芘含量为30mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到苯并[a]芘含量为30mg/kg的污染土壤。

[0103] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]芘含量为30mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余苯并[a]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中苯并[a]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的苯并[a]芘降解效果见表1。

[0104] 实施例7

[0105] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对二苯并[a,h]蒽的降解效果。

[0106] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制二苯并[a,h]蒽溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得二苯并[a,h]蒽浓度为30mg/L，得到二苯并[a,h]蒽浓度为30mg/L的无机盐培养基。

[0107] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0108] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述二苯并[a,h]蒽浓度为30mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余二苯并[a,h]蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的二苯并[a,h]蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的二苯并[a,h]蒽降解效果见表1。

[0109] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的二苯并[a,h]蒽溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得二苯并[a,h]蒽含量为30mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到二苯并[a,h]蒽含量为30mg/kg的污染土壤。

[0110] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述二苯并[a,h]蒽含量为30mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余二苯并[a,h]蒽含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中二苯并[a,h]蒽的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的二苯并[a,h]蒽降解效果见表1。

[0111] 实施例8

[0112] 本实施例用于说明膝形假单胞菌NAP‑1对茚并[1,2,3‑cd]芘的降解效果。

[0113] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制茚并[1,2,3‑cd]芘溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得茚并[1,2,3‑cd]芘浓度为30mg/L，得到茚并[1,2,3‑cd]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基。

[0114] 将保藏的膝形假单胞菌NAP‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌9
液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0115] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述茚并[1,2,3‑cd]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余茚并[1,2,3‑cd]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对无机盐培养基中的茚并[1,2,3‑cd]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下5天的茚并[1,
2,3‑cd]芘降解效果见表1。

[0116] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的茚并[1,2,3‑cd]芘溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得茚并[1,2,3‑cd]芘含量为30mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到茚并[1,2,3‑cd]芘含量为30mg/kg的污染土壤。

[0117] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述茚并[1,2,3‑cd]芘含量为30mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种膝形假单胞菌NAP‑1)，定期检测剩余茚并[1,2,3‑cd]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定膝形假单胞菌NAP‑1对污染土壤中茚并[1,2,3‑cd]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，膝形假单胞菌NAP‑1的最佳降解条件为30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2。膝形假单胞菌NAP‑1在最佳条件(温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2)下20天的茚并[1,2,3‑cd]芘降解效果见表1。

[0118] 对比例1

[0119] 本对比例用于对比Pyronema domesticum LJD‑1(GDMCC No.61797)对菲的降解效果。

[0120] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制菲溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得菲浓度为100mg/L，得到菲浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0121] 将Pyronema domesticum LJD‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将9
菌液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0122] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述菲浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Pyronema domesticum LJD‑1)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定Pyronema domesticum LJD‑1对无机盐培养基中的菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，Pyronema domesticum LJD‑1的最佳降解条件为28.0±2.0℃、pH 6.0±
0.2。Pyronema domesticum LJD‑1在最佳条件(温度28.0±2.0℃、pH 6.0±0.2)下3天和5天的菲降解效果见表1。

[0123] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的菲溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得菲含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到菲含量为100mg/kg的污染土壤。

[0124] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述菲含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Pyronema domesticum LJD‑1)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定Pyronema domesticum LJD‑1对污染土壤中菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，Pyronema domesticum LJD‑1的最佳降解条件为28.0±2.0℃、pH 6.0±0.2。Pyronema domesticum LJD‑1在最佳条件(温度28.0±2.0℃、pH 6.0±0.2)下14天和20天的菲降解效果见表1。

[0125] 对比例2

[0126] 本对比例用于对比Pyronema domesticum LJD‑1(GDMCC No.61797)对苯并[a]芘的降解效果。

[0127] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制苯并[a]芘溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得苯并[a]芘浓度为30mg/L，得到苯并[a]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基。

[0128] 将Pyronema domesticum LJD‑1菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将9
菌液原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0129] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]芘浓度为30mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Pyronema domesticum LJD‑1)，定期检测剩余苯并[a]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定Pyronema domesticum LJD‑1对无机盐培养基中的苯并[a]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，Pyronema domesticum LJD‑1的最佳降解条件为28.0±2.0℃、pH6.0±0.2。Pyronema domesticum LJD‑1在最佳条件(温度28.0±2.0℃、pH6.0±0.2)下5天的苯并[a]芘降解效果见表1。

[0130] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的苯并[a]芘溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得苯并[a]芘含量为30mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到苯并[a]芘含量为30mg/kg的污染土壤。

[0131] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述苯并[a]芘含量为30mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Pyronema domesticum LJD‑1)，定期检测剩余苯并[a]芘含量，计算多环芳烃降解率，测定Pyronema domesticum LJD‑1对污染土壤中苯并[a]芘的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，Pyronema domesticum LJD‑1的最佳降解条件为28.0±2.0℃、pH 6.0±0.2。Pyronema domesticum LJD‑1在最佳条件(温度28.0±2.0℃、pH 6.0±0.2)下20天的苯并[a]芘降解效果见表1。

[0132] 对比例3

[0133] 本对比例用于对比Bacillus sp.s8‑t8‑L9(CGMCC No.9032)对菲的降解效果。

[0134] 模拟多环芳烃污染地下水的制备：用正己烷配制菲溶液，无菌滤膜过滤，加入灭菌锥形瓶中，待正己烷完全挥发添加至灭菌的无机盐培养基中使得菲浓度为100mg/L，得到菲浓度为100mg/L的无机盐培养基。

[0135] 将Bacillus sp.s8‑t8‑L9菌体活化后，在LB培养基中培养得到菌液原液；将菌液9
原液离心后得到的菌体以无菌水制备成菌悬液，其活菌含量约为10cfu/mL。

[0136] 将菌悬液按1vol.％的接种量(109cfu)接种于上述菲浓度为100mg/L的无机盐培养基中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Bacillus sp.s8‑t8‑L9)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定Bacillus sp.s8‑t8‑L9对无机盐培养基中的菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下5天降解效果。结果发现，Bacillus sp.s8‑t8‑L9的最佳降解条件为25.0±2.0℃、pH 7.5±0.2。Bacillus sp.s8‑t8‑L9在最佳条件(温度25.0±2.0℃、pH 7.5±0.2)下3天和5天的菲降解效果见表1。

[0137] 模拟多环芳烃污染土壤的制备：取未被多环芳烃污染的土壤，经过预处理过筛去除土壤中的小石块、草根等杂质并自然风干，称取一定量的菲溶于正己烷溶液中，均匀喷洒到上述土样中使得菲含量为100mg/kg(其中，土壤的重量以干基计)，待正己烷完全挥发得到菲含量为100mg/kg的污染土壤。

[0138] 将菌悬液按1(v/w)％的接种量(109cfu)接种于上述菲含量为100mg/kg的污染土壤中，以温度和pH为影响因素，设置实验组和对照组(对照组不接种Bacillus sp.s8‑t8‑L9)，定期检测剩余菲含量，计算多环芳烃降解率，测定Bacillus sp.s8‑t8‑L9对污染土壤中菲的最佳降解条件以及在最佳降解条件下20天降解效果。结果发现，Bacillus sp.s8‑t8‑L9的最佳降解条件为25.0±2.0℃、pH 7.5±0.2。Bacillus sp.s8‑t8‑L9在最佳条件(温度25.0±2.0℃、pH 7.5±0.2)下14天和20天的菲降解效果见表1。

[0139] 表1膝形假单胞菌NAP‑1的多环芳烃降解效果

[0140]

[0141] 由表1数据可以看出，本发明的膝形假单胞菌NAP‑1对于土壤或地下水中的多种多环芳烃均具有良好的降解作用，在菲含量为100mg/L的无机盐液体培养基中，温度30.0±2.0℃、pH 7.0±0.2条件下，经5天菲降解率达到95％以上。在菲含量为100mg/kg的污染土壤中，温度30.0±2.0℃、pH7.0±0.2条件下，经20天菲降解率达到95％以上；降解率明显优于对照菌株。

[0142] 以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

[0143] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。