[0001] 本发明涉及中药技术领域，尤其涉及一种中药复方制剂及其制备方法和应用。

[0002] 动脉粥样硬化性血栓性脑梗死为脑梗死最常见的类型，是指在动脉粥样硬化所致血管壁病变的基础上出现管腔狭窄、闭塞或血栓形成，造成脑局部供血区血流中断，发生脑组织缺血、缺氧及软化坏死，引起相应的神经系统功能障碍。属于中医“中风”的范畴，由于中风起病急，变化多端而速疾，如“矢石之中的，若暴风之疾速”，故古代医家取名为“中风”，又因其发病突然，亦称之为“脑卒中”。是以猝然昏倒，不省人事，伴发口角歪斜、语言不利而出现半身不遂为主要症状的一类疾病。主要分为出血性脑卒中(脑出血或蛛网膜下腔出血)与缺血性脑卒中(脑梗死、脑血栓)两大类，其中，缺血性脑卒中(ischemic stroke)占全部脑卒中的86％。脑卒中是危害中老年人身体健康的主要疾病之一，是内科常见病、多发病。我国脑卒中每年发病率为0.219％，致残率为75.0％。

[0003] 专利申请号：200410064784.0，公开了一种治疗缺血性脑中风的中药组分物的制备方法，配方为黄芪10～20g、当归10～18g、玄参8～10g、金银花8～15g，石斛8～15g，甘草6～10g，试验表明，上述复方提取液上SP‑825型大孔吸附树脂，60％乙醇洗脱液干浸膏对大鼠缺血性中风有很好的治疗作用。

[0004] 然而，对于中药复方而言，原料大多来源于天然产物，如植物、动物、矿物等，由于每个药材的生长环境都不同，因此它们的品质也会受到许多因素的影响，例如土壤肥力、气候、水源等等。此外，采收时节，采摘技术等因素也会影响药材的品质。即使在药材原料均符合药典规定的前提下，不同产地、批次的药材原料仍会由于有效成分的差异导致不同批次制剂成分不稳定、质量一致性差,可见，仅有药材重量的处方无法满足现代中成药的生产要求，严重制约中医药临床疗效的稳定可控及现代研究结果的可重复、被认可。在确定中药复方配方时，需要仔细挑选和配比药材，并根据实际情况进行剂量调整，确保各个有效成分含量在合理的范围内。此外，在制备过程中也需要注意控制药材的处理方法和时间，以避免影响药材中有益成分的含量和活性。同时，中药复方复杂体系中有效成分不明确，哪些主要成分对疗效有明显的影响作用，其合理的优选含量范围是多少，需要对不同有效成分的范围进行合理控制，在保证中药制剂质量稳定的同时还要保证其疗效可靠，这是制约现代中药发展的一个关键问题。

[0054] 如前所述，本发明旨在提供一种中药组合物、制备方法、应用及质量控制方法。以下将结合实验例的内容进行具体描述。

[0055] 特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

[0056] 本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0057] 中药组合物中主成分的含量测定

[0058] 含量测定Ⅰ新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、断氧化马钱子苷、甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷参照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版一部附录VI D)测定。

[0059] 液相色谱条件与系统适用性试验Thermo acclaim TM 120C18色谱柱(4.6×250mm，5μm；柱温35℃；流速1mL/min；进样量：10μL；检测波长：238nm(甘草苷、断氧化马钱子苷)、
252nm(甘草酸)、280nm(哈巴俄苷)、327nm(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C)；流动相：0.2％磷酸水溶液‑乙腈，梯度洗脱，具体梯度见下表：

[0060]

[0061] 对照品溶液的制备分别精密称定新绿原酸10mg、绿原酸20mg，隐绿原酸10mg、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C10mg，甘草苷10mg、甘草酸30mg，断氧化马钱子苷10mg，置20mL量瓶中。精密称定哈巴俄苷10mg置10mL的量瓶中，50％甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，从中精密移取1mL置前述的20mL的量瓶中，50％甲醇定容至刻度，即得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、断氧化马钱子苷、甘草苷、甘草酸、哈巴俄苷混合对照品储备液。从混合对照品储备液中精密量取1mL分别置于20mL的量瓶中，50％甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

[0062] 供试品溶液的制备取中药组合物约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25mL，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0063] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

[0064] 含量测定IIβ‑蜕皮甾酮照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版一部附录VI D)测定。液相色谱条件与系统适用性试验色谱柱选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Kromasil C18，3.5μm，4.6×150mm)；流动相：乙腈‑0.1％ H3PO4梯度洗脱；检测波长：250nm流速：0.8mL/min柱温：30℃；进样量：5μL。

[0065] 洗脱梯度见下表：

[0066]

[0067] 对照品溶液的制备取β‑蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每1mL含0.4mg的储备液。精密吸取储备液1mL加甲醇稀释，得对照品溶液。

[0068] 供试品溶液的制备取中药组合物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声40min，冷却，再称定重量，用甲醇补足失量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加10mL水使溶解，分别用水饱和正丁醇振摇提取5次，每次30mL，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤正丁醇液3次，每次20mL，再取5ml甲醇洗涤分液漏斗，合并，蒸干，转移至50mL小烧瓶中减压浓缩至干，甲醇溶解，并转移至5mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

[0069] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

[0070] 含量测定Ⅲ黄芪甲苷照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。液相色谱条件与系统适用性试验色谱柱选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈‑水(32:68)为流动相；蒸发光散射检测器；流速为1mL/min，柱温30℃；进样量20μL。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

[0071] 对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1mL含0.1mg和0.5mg的溶液，即得。

[0072] 供试品溶液的制备取中药组合物约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声60min，冷却，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，蒸干，残渣加25mL水分次溶解，分别用水饱和正丁醇振摇提取5次，每次
30mL，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤正丁醇液4次，每次30mL，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至2mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

[0073] 含量测定Ⅳ洋川芎内酯A、人参皂苷RO、党参炔苷超高效液相色谱‑电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱测定

[0074] 色谱条件：色谱柱：waters BEH C18(2.1ⅹ100mm，1.7μm)；柱温：35℃；进样量：2μL流速：0.4mL/min；流动相：梯度洗脱，具体梯度见下表：

[0075]

[0076] 后运行3min；

[0077] 质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正、负离子模式采集；质量扫描范围m/z 100～1500；毛细管电压3500V；干燥气氮气温度：350℃；干燥气流速：10L·min‑1；雾化器气氮气压力50psi；裂解电压135V；锥孔电压65V。

[0078] 对照品溶液的制备分别取洋川芎内酯A、党参炔苷、人参皂苷RO对照品适量，精密称定，加甲醇制成含各成分15～30mg·L‑1，的混合对照品溶液，14000r·min‑1离心10min，即得。

[0079] 供试品溶液的制备取中药组合物，研细，取约1g，精密称定，用25mL 50％甲醇超声提取45min。放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。以14000r·min‑1离心10min，即得。

[0080] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μL，注入超高效液相色谱‑电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱，测定，记录总离子流图，按外标法以峰面积计算，即得。

[0081] 内控标准的制定

[0082] 根据优选样品，通过回溯药材原料的成分含量特征，建立相关的药材指纹图谱作为内控标准，并完善制备工艺，保障了产品质量提升、均一稳定。

[0083] 1、建立黄芪药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0084] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱1，以不少于5个如对照指纹图谱图所标示的指纹峰为参照校正峰，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0085] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0086] Mark峰序号 保留时间[Min] 峰面积1 3.617 3.442
2 12.623 2.63
3 18.3 2.227
4 26.253 4.53
5 35.82 1.775

[0087] 色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：甲醇‑0.3％磷酸水溶液系统为流动相；洗脱程序为：

[0088]

[0089]

[0090] 流速为1ml/min；检测波长为254nm，柱温30℃。。

[0091] 参照物溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

[0092] 供试品溶液的制备：取黄芪药材，粉碎，取粉末约1.0g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加50％甲醇25ml，超声提取0.5小时，过滤，取续滤液，即得。

[0093] 测定法：精密吸取供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，测定。

[0094] 2、建立金银花药材内控标准：在药典标准基础上增加绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、断氧化马钱子苷提取量及药材液相指纹图谱。

[0095] (1)金银花药材中4个成分提取量：绿原酸应不得少于2.0％；新绿原酸应不得少于0.05％；隐绿原酸应不得少于0.05％；断氧化马钱子苷应不得少于0.2％。即，本实施例中，以绿原酸为例，每100g金银花经水提取得到的绿原酸不少于2g。

[0096] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇‑0.1％磷酸水溶液系统为流动相，按下表进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；绿原酸、新绿原酸和隐绿原酸的检测波长为324nm，栀子苷和断氧化马钱子苷的检测波长为237nm；理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于10000。

[0097]

[0098] 对照品溶液的制备：取绿原酸对照品和栀子苷对照品各适量，加50％甲醇制成每1ml约含绿原酸0.3mg、栀子苷0.5mg的溶液，摇匀，即得。

[0099] 供试品溶液的制备：量取水1800ml，置烧瓶中，煮沸，投入本品100g，使水液没过药材，回流提取1小时，滤过，药渣中再加入1800ml水，煮沸，回流提取1小时，趁热滤过，合并滤液，放冷，精密量取续滤液1～10ml，置50ml量瓶中，加50％甲醇至刻度。摇匀，即得。

[0100] 测定法：分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。以绿原酸对照品为对照，按外标法计算本品中绿原酸的含量；以本品中的绿原酸为内参物，根据相对校正因子计算本品中新绿原酸和隐绿原酸的含量；以对照溶液中的栀子苷为内参物，根据相对校正因子计算本品中断氧化马钱子苷的浓度；以相对保留时间确定各成分峰位。

[0101] 新绿原酸、隐绿原酸、断氧化马钱子苷的相对校正因子和相对保留时间见下表：

[0102]

[0103]

[0104] 注：相对保留时间为待测成分与其内参物的保留时间之比。

[0105] 技术参数(参考)：色谱柱phenomenex Luna C18(4.6×250mm，5μm)或Kromasil C18(4.6×250mm，5μm)。

[0106] 按下式进行计算：

[0107]

[0108] 式中：f平均——校正因子的平均值；

[0109] A样——供试品溶液中绿原酸的峰面积(2针平均值)；

[0110] ——供试品的稀释体积；

[0111] 10‑3——单位换算系数；

[0112] m样——供试品的取样量(g)

[0113] (2)液相指纹图谱：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的12个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.9。

[0114] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0115] 峰序号 保留时间[Min] 峰面积1 8.47 5.507
2 11.103 2.044
3 13.077 12.133
4 14.397 91.272
5 14.9 37.905
6 17.29 3.353
7 19.153 3.053
8 22.113 7.654
9 25.063 6.939
10 25.983 11.825
11 27.833 2.886
12 28.697 2.287
13 30.447 2.879
14 30.647 50.522
15 31.637 9.526

[0116] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：phenomenex luna C18，4.6×250mm，5μm)；乙腈－0.2％磷酸水溶液系统为流动相；检测波长为254nm，柱温30℃。理论塔板数按参照物(绿原酸)峰计算为应不低于6000。洗脱程序为：

[0117]

[0118] 参照物溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。

[0119] 供试品溶液的制备：取绿原酸提取量项下的溶液，过滤，取续滤液，即得。

[0120] 测定法分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。

[0121] 3、建立石斛药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0122] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的9个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0123] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0124] 峰序号 保留时间[Min] 峰面积1 3.723 3.444
2 12.313 0.65
3 14.85 0.623
4 15.58 1.535
5 18.663 0.644
6 36.697 0.988
7 37.387 1.093
8 38.003 0.69
9 38.697 1.157

[0125] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent C18，4.6×250mm，5μm)；甲醇－0.2％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0126]

[0127] 流速为1ml/min；检测波长为254nm；柱温25℃。

[0128] 供试品溶液的制备：取石斛药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，超声45分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0129] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0130] 4、建立党参药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0131] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的5个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.8。

[0132] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0133]峰序号 保留时间[Min] 峰面积
1 3.723 3.444
2 12.313 0.65
3 14.85 0.623
4 15.58 1.535
5 18.663 0.644

[0134] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent extend C18，4.6×250mm，5μm)；甲醇－0.2％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0135]

[0136] 流速为1ml/min；检测波长为254nm；柱温35℃。

[0137] 供试品溶液的制备：取党参药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，回流提取30分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0138] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0139] 5、建立玄参药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0140] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的7个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0141] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0142]峰序号 保留时间[Min] 峰面积
1 6.337 5.141
2 10.83 3.962
3 25.91 3.451
4 26.717 2.01
5 29.42 9.002
6 36.813 6.028
7 38.9 8.159

[0143] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent extend C18，4.6×250mm，5μm)；乙腈－0.2％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0144]

[0145]

[0146] 流速为1ml/min；检测波长为238nm；柱温35℃。

[0147] 参照物溶液的制备：取哈巴俄苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含30μg的溶液，即得。

[0148] 供试品溶液的制备：取玄参药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取45分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0149] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0150] 6、建立牛膝药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0151] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的7个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0152] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0153]峰序号 保留时间[Min] 峰面积
1 6.337 5.141
2 10.83 3.962
3 25.91 3.451
4 26.717 2.01

[0154] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent extend C18，4.6×250mm，5μm)；乙腈－0.2％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0155]

[0156] 流速为1ml/min；检测波长为254nm；柱温30℃。

[0157] 供试品溶液的制备：取牛膝药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取45分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0158] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0159] 7、建立当归药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0160] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的8个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0161] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0162]

[0163]

[0164] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent extendC18，4.6×250mm，5μm)；乙腈－0.3％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0165]

[0166] 流速为1ml/min；检测波长为238nm；柱温30℃。

[0167] 供试品溶液的制备：取当归药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取45分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0168] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0169] 8、建立甘草药材内控标准：在药典基础上增加液相指纹图谱控制项

[0170] 液相指纹图谱检测方法：供试品指纹图谱与对照指纹图谱应相似，所标出的15个色谱峰应显示，经计算软件计算，相似度应大于0.7。

[0171] 本实施例中对照指纹图谱峰面积及其保留时间如下：

[0172] 峰序号 保留时间[Min] 峰面积1 15.52 5.776
2 15.987 7.782
3 21.25 2.021
4 23.11 2.29
5 26.31 3.405
6 28.35 2.119
7 30.613 3.196
8 33.617 4.638
9 35.877 33.337
10 38.093 6.082
11 43.817 2.346
12 45.06 2.85
13 47.027 5.108

[0173] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Agilent extend C18，4.6×250mm，5μm)；乙腈－0.3％磷酸水溶液系统为流动相，洗脱程序为：

[0174]

[0175] 流速为1ml/min；检测波长为252nm；柱温35℃。

[0176] 参照物溶液的制备：取甘草酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml含100μg的溶液，即得。

[0177] 供试品溶液的制备：取甘草药材，粉碎，取粉末约1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，超声提取45分钟，过滤，取续滤液，即得。

[0178] 测定法：分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定。

[0179] 制备例1：中药组合物的制备

[0180] 分别称取黄芪、当归、党参、玄参、金银花、石斛、牛膝、甘草八味药材各240g；加水煎煮两次，第一次1.5小时，第二次1小时，加水量分别为5倍量、3倍量，滤过，合并煎煮液浓缩至无醇味，相对密度1.15‑1.25(45‑55℃)的浸膏，加乙醇使含醇量达60％，搅匀，静置24h，回收乙醇并浓缩至稠膏，相对密度1.3‑1.35(50‑60℃)，减压干燥，粉碎，得提取物干膏。干膏粉缓缓加入适量乙醇，混合，先加入2.3％的淀粉、然后加入1％二氧化硅、1％滑石粉、0.2％硬脂酸镁，共加入2.5％乙醇，制粒，总混，压片制成500片，包衣，即得0.35g/片。

[0181] 选用符合药典规定的不同产地、批次的药材组合，共制备15批次中药组合物按前述的方法测定了各组合物供试品的含量。

[0182]

[0183] 实验例1：15批中药组合物对大鼠脑缺血再灌注损伤(Middle Cerebral

[0184] Artery Occlusion，MCAO)的实验研究

[0185] 1、实验材料

[0186] 1.1药物及试剂

[0187] 本发明中药组合物A‑O共计15个批次由江苏康缘药业股份有限公司自制；舒泰50，法国维克有限公司(VIRBAC)，规格：250mg/5mL，批号：889EA；拜特速眠新(盐酸赛拉嗪注射液)，长沙拜特生物科技研究所公司，规格：2mL：0.2g，批号：20210102；羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)，国药集团化学试剂有限公司，规格：500g，批号：20220104；氯化钠注射液，河南科伦药业有限公司，规格：500mL：4.5g，批号：A21022302B；白介素‑1β(IL‑1β)测试盒，南京建成生物工程研究所有限公司，货号：H002‑1‑2，规格：96T；肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)测试盒，南京建成生物工程研究所有限公司，货号：H052‑1‑2，规格：96T。

[0188] 1.2主要仪器及耗材

[0189] 电子天平(d＝0.1g)，常州市幸运电子设备有限公司，型号：XY1000‑1B；电子天平(d＝0.0001g)，梅特勒‑托利多仪器(上海)有限公司，型号：AL204；PE酶标仪，PerkinElmer公司，型号：EnSpire；酶标仪，MD公司，型号：M2e；低温孵育箱，I‑CVBE，型号：FCI‑280；冷冻研磨仪，上海净信实业发展有限公司，型号：TISSUELYSER‑24L；冷冻离心机，北京白洋医药器械有限公司，型号：BY‑R20；MCAO线栓：长沙迈越生物科技有限公司，型号：250‑280g。

[0190] 1.3实验动物

[0191] SD大鼠102只，雄性，体重170‑190g，购于南通大学，许可证号：SCXK(苏)2019‑0001。饲养在江苏康缘药业股份有限公司屏障环境下：室温22±2℃，湿度50‑60％。试验动物使用许可证号：SYXK(苏)2018‑0026。大鼠分笼饲养，2只/笼。

[0192] 2、方法

[0193] 2.1动物分组及给药情况

[0194] 将102只大鼠分为17组(假手术对照组：6只；MCAO模型组：6只；给药组：本发明中药组合物A‑O，共计15组，90只)。本发明中药组合物的给药剂量为生药量31.74g/kg，给药组大鼠均于造模前14天开始灌胃给药10mL/kg(用0.5％CMC‑Na稀释)，每天1次，连续给药14天，MCAO模型组及假手术对照组给予0.5％CMC‑Na。

[0195] 2.2模型制备

[0196] 大鼠禁食12h后麻醉后，仰位固定于手术台，颈部正中切口，分离出颈总动脉，继续向下分离并结扎颈外动脉及颈外动脉各分支，轻轻剥离迷走神经，分离出颈内动脉，颈外动脉近心端备线，用动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉，在颈外动脉距颈内动脉2mm处剪一小口，将线栓插入颈外动脉并进入颈总动脉，轻扎备线，防止出血，剪断颈外动脉，松开颈内动脉的动脉夹，轻轻回抽线栓，使其进入颈内动脉，继续向下推进，直至有轻微阻力。此时可见颈内动脉伸展，线栓插入深度约为18mm，表明线栓已经穿过大脑中动脉起始段，到达大脑前动脉近端，阻断大脑中动脉及大脑后动脉的血液供应。松开颈总动脉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。2h后，将线栓栓头拔出至颈内动脉和颈外动脉的分叉处，造成血流再灌注。假手术组手术方法同前，分离出颈总动脉及颈内、外动脉，但不结扎及插线，恢复血流24h后，进行生物样本采集。

[0197] 3、检测指标

[0198] 3.1大鼠行为学评分

[0199] 根据mNSS评分法，进行大鼠神经功能缺损评分，包括提尾实验、行走实验、感觉实验、平衡木实验、反射和异常活动。评判标准：1‑6分认为轻型受损；7‑12分认为中型受损；13‑18分认为重型受损。

[0200]

[0201] 3.2大鼠脑组织中TNF‑α和IL‑1β含量测定

[0202] 取缺血侧大脑组织，置于预冷的生理盐水中匀浆制备成脑匀浆液，离心后，吸取上清液，按照试剂盒说明书中的Elisa法，测定样品中炎症因子IL‑1β和TNF‑α的含量。

[0203] 3.3统计分析

[0204] 数据以均数±标准差 表示，采用GraphPad prism 7统计软件，选择单因素方差分析(One‑way ANOVA)检验联合Dunnett的多重比较测试方法进行数据统计分析，P<0.05代表数据具有统计意义。

[0205] 4、实验结果

[0206] 4.1对MCAO模型大鼠行为学评分的影响

[0207] 各组大鼠mNSS评分结果显示，MCAO模型组大鼠mNSS评分显著高于假手术组大鼠的mNSS评分(P<0.001)，而B、C、E、F、I、J、K、L和N组较MCAO模型组均有明显改善(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，见表2。

[0208] 表2各组大鼠mNSS评分比较( n＝6)

[0209]

[0210]

[0211] 注：与假手术对照组相比，###P<0.001；与MCAO模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0212] 4.2对MCAO模型大鼠脑组织中TNF‑α和IL‑1β含量的影响

[0213] 与假手术对照组比较，MCAO模型组大鼠脑组织匀浆中TNF‑α和IL‑1β含量都有所升高(P<0.001)，而B、C、E、F、I、J、K、L和N组整体上较MCAO模型组均有明显降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，见表3。

[0214] 表3各组大鼠脑组织中TNF‑α和IL‑1β含量测定比较( n＝6)

[0215]

[0216] 注：与假手术对照组相比，###P<0.001；与MCAO模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。实验例2：15批中药组合物对ISO诱导大鼠心肌缺血的实验作用研究

[0217] 1、实验材料

[0218] 1.1药物及试剂

[0219] 舒泰50，法国维克有限公司(VIRBAC)，规格：250mg/5mL，批号：889EA；拜特速眠新(盐酸赛拉嗪注射液)，长沙拜特生物科技研究所公司，规格：2mL：0.2g，批号：20210102；盐酸异丙肾上腺素(Isoprenaline HCl)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，规格：25g，Lot#H2124300；氯化钠注射液，河南科伦药业有限公司，规格：500mL：4.5g，批号：A21022302B；羧甲基纤维素钠(CMC‑Na)，国药集团化学试剂有限公司，规格：500g，批号：20220104；AST试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号：C010‑2‑1批号：20220509，规格96T；LDH乳酸脱氢酶试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号：A020‑2‑2批号：20220621规格：96T。

[0220] 1.2主要仪器及耗材

[0221] 电子天平(d＝0.1g)，常州市幸运电子设备有限公司，型号：XY1000‑1B；电子天平(d＝0.0001g)，梅特勒‑托利多仪器(上海)有限公司，型号：AL204；PE酶标仪，Perkin Elmer公司，型号：EnSpire；低温孵育箱，I‑CVBE，型号：FCI‑280；冷冻离心机，北京白洋医药器械有限公司，型号：BY‑R20；一次性使用静脉输液针，山东奥赛特医疗器械有限公司，批号：20200623；一次性真空采血管，山东省成武县华博医疗器械有限公司，批号：20201103。

[0222] 1.3实验动物

[0223] Wistar大鼠102只，雄性，体重180‑220g，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019‑0010。饲养在江苏康缘药业股份有限公司屏障环境下：室温22±2℃，湿度50‑60％。试验动物使用许可证号：SYXK(苏)2018‑0026。大鼠分笼饲养，2只/笼。

[0224] 2、方法

[0225] 2.1动物分组

[0226] 将102只大鼠分为17组(空白对照组：6只；ISO模型组：6只；给药组：本发明中药组合物A‑O，共计15组，90只)。

[0227] 2.2给药及造模情况

[0228] 本发明中药组合物的给药剂量为生药量31.74g/kg，给药组大鼠均于造模前14天开始灌胃给药10mL/kg(用0.5％CMC‑Na稀释)，每天1次，连续给药14天，ISO模型组及空白对照组给予0.5％CMC‑Na。于第13天和14天灌胃给药1小时后，除正常对照组外，其余各组分别皮下注射异丙肾上腺素(150mg/kg)，皮下注射体积为2mL/kg。

[0229] 3、检测指标

[0230] 大鼠第一次皮下注射异丙肾上腺素48小时后，麻醉后，仰位固定大鼠，剪开腹部皮肤，分离腹主动脉，进行采血后，置于4℃冰箱过夜。第二天进行离心，3000rpm，15分钟。获取血清后，将血清分装后，储存于‑80℃冰箱保存，待后续进行试剂盒检测。采血后打开胸腔，迅速取出心脏，用生理盐水洗涤，用吸水纸吸去心脏表面残留的液体，称重。

[0231] 3.1心脏指数

[0232] 按下列公式计算心脏指数，比较各组间差异。

[0233]

[0234] 3.2血清中AST和LDH检测

[0235] 方法参照试剂盒说明书。

[0236] 3.3统计分析

[0237] 数据以均数±标准差 表示，采用GraphPad prism 7统计软件，选择单因素方差分析(One‑way ANOVA)检验联合Dunnett的多重比较测试方法进行数据统计分析，P<0.05代表数据具有统计意义。

[0238] 4、实验结果

[0239] 4.1对大鼠心脏指数的影响

[0240] 各组大鼠心脏指数的结果显示，模型对照组大鼠心脏指数显著高于空白对照组大鼠的心脏指数(P<0.001)，而B、C、E、F、I、J、K、L和N组较模型对照组均有明显改善(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，见表4。

[0241] 表4各组大鼠心脏指数比较( n＝6)

[0242]

[0243] 注：与空白对照组相比，###P<0.001；与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0244] 4.2对大鼠血清中AST和LDH的影响

[0245] 与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中AST和LDH有所升高(P<0.001)，而B、C、E、F、I、J、K、和L和N组较模型对照组均有明显降低(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，见表5。

[0246] 表5各组大鼠血清中AST和LDH测定比较( n＝6)

[0247]

[0248]

[0249] 注：与空白对照组相比，###P<0.001；与模型对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0250] 上述活性成分的优选含量为：新绿原酸0.81‑2.01‰，绿原酸1.89‑3.01‰，隐绿原酸1.05‑1.33‰，异绿原酸A0.50‑0.79‰，异绿原酸B0.63‑0.88‰，异绿原酸C 0.84‑1.25‰，断氧化马钱子苷1.18‑1.45‰，甘草酸3.68‑5.74‰，甘草苷1.35‑2.2‰，哈巴俄苷
0.25‑0.37‰，β‑蜕皮甾酮0.17‑0.29‰，黄芪甲苷0.81‑1.27‰，人参皂苷RO 0.14‑0.28‰，洋川芎内酯A0.10‑0.19‰，党参炔苷0.10‑0.18‰。上述活性成分的比例关系为：新绿原酸
0.81‑2.01，绿原酸1.89‑3.01，隐绿原酸1.05‑1.33，异绿原酸A0.50‑0.79，异绿原酸B0.63‑
0.88，异绿原酸C0.84‑1.25，断氧化马钱子苷1.18‑1.45，甘草酸3.68‑5.74，甘草苷1.35‑
2.2，哈巴俄苷0.25‑0.37，β‑蜕皮甾酮0.17‑0.29，黄芪甲苷0.81‑1.27，人参皂苷RO 0.14‑
0.28，洋川芎内酯A 0.10‑0.19，党参炔苷0.10‑0.18。根据动物试验可知，具备上述活性成分含量特征的中药组合物具有稳定、优异的治疗效果，是优选的中药组合物；上述活性成分含量特征并可用于该中药组合物的质量控制。

[0251] 本发明组合物的指纹图谱检测

[0252] 1.指纹图谱色谱条件Waters Xbridge BEH C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)；流动相0.1％磷酸水溶液(A)‑乙腈(B)，梯度洗脱，(0～20min，1～12％ B；20～60min，12％～35％ ‑1
B；60～70min，47％～50％ B；流速1.0mL·min ；柱温35℃；波长270nm；进样量10μL。

[0253] 2.供试品溶液的制备取内控后的中药组合物约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50％的甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，用50％甲醇溶液补足失重，14000r·‑1min 离心10min，取上清液，即得。

[0254] 3.对照品溶液的制备分别精密称定新绿原酸10mg，绿原酸25mg，隐绿原酸10mg，甘草苷10mg，异绿原酸A 10mg，异绿原酸B 100mg，异绿原酸C 10mg，哈巴俄苷4mg甘草酸25mg置50mL量瓶中，加入50％甲醇超声溶解，放冷后，定容至刻度，摇匀，即得。

[0255] 4.HPLC指纹图谱的建立

[0256] 4.1精密度试验取适量，按“2”项下方法制备供试品溶液，按“1”项下色谱条件连续进样测定6次，以7号峰(甘草苷)为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间RSD在0.01％～0.78％，相对峰面积RSD在0.59％～1.86％。

[0257] 4.2重复性试验取Q批次中药组合物适量，按供试品溶液制备方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以9号峰(甘草苷)为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间RSD在0.01％～1.59％，相对峰面积RSD在0.67％～2.91％。

[0258] 4.3稳定性试验取同一份供试品溶液，按色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24h进样测定。以9号峰(甘草苷)为参照峰，测得其余16个共有峰相对保留时间RSD在0.06％～0.34％，相对峰面积RSD在0.35％～2.68％。表明供试品溶液24h内稳定性良好。

[0259] 4.4指纹图谱的建立及相似度分析取25批次中药提取物，分别制备供试品溶液，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)”进行分析，通过多点校正法、全谱峰匹配，得25批次指纹图谱，色谱图见图1。共标示出17个共有峰，其中9号峰(甘草苷)稳定性好，色谱响应值较高，保留时间适中，故选择其作为参照峰(S)。相应地，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，应在规定值的±5％之内，相对保留时间规定值为：0.26(峰1)、0.33(峰2)、0.36(峰3)、0.48(峰4)、0.62(峰5)、0.67(峰6)、0.96(峰7)、0.98(峰8)、1(峰9、
1.11(峰10)、1.14(峰11)、1.21(峰12)、1.26(峰13)、1.35(峰14)、1.38(峰15)、1.50(峰16)、
1.95(峰17)

[0260] 25批次中药提取物指纹图谱之间的相似度在0854～0.996，结果见图1和表1，说明内控后的方法所得到的中药提取物各批次间相似度良好、批间差异小、质量较稳定，因而同样具有更好的稳定、优异的治疗效果。经过与对照品PDA光谱图及保留时间对比指认出9个色谱峰，分别为4号峰为新绿原酸、5号峰绿原酸、6号峰隐绿原酸、9号峰甘草苷、10号峰异绿原酸B、11号峰异绿原酸A、12号峰异绿原酸C、16号峰哈巴俄苷和17号峰甘草酸。

[0261] 表6 25批中药提取物相似度值

[0262]

[0263] 以上仅是本发明的实施方式示范性说明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。