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一种石斛提取物及其制备方法和应用实质审查 发明

技术领域

[0001] 本发明涉及一种石斛提取,尤其涉及了一种石斛提取物及其制备方法和应用。

相关背景技术

[0002] 石斛不仅含有多糖、黄酮类等活性因子,还富含氨基酸、维生素、蛋白质等多种营养成分。现有石斛药理研究表明其具有抗肿瘤作用,但药效物质基础尚不明确,因而导致石斛为抗肿瘤药物研究提供支撑仍然存在较大困难,因而亟待提供一种药效物质基础明确的石斛提取方法。

具体实施方式

[0031] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
[0032] 实施例1
[0033] 本实施例提供了一种石斛提取物的制备方法,具体的本实施例中选用的石斛为霍山石斛(D.huoshanense),又名米斛,属于兰科多年生草本植物,其主要产于安徽省霍山县大别山一带。
[0034] 石斛提取物的制备方法具体包括以下步骤:
[0035] 步骤S1、将石斛去根、叶,在60‑70℃条件下烘干至恒重,得到石斛干条;
[0036] 步骤S2、将步骤S1得到的石斛干条采用水提法进行多次提取,得到提取液;
[0037] 步骤S3、将提取液在冷冻干燥机中冻干得到冻干粉,然后将冻干粉保存于‑20℃冰箱中得到石斛提取物冻干粉,备用。
[0038] 其中,步骤S2中具体包括以下步骤:
[0039] 步骤S21、对石斛干条进行水提法进行提取,具体为将石斛干条置入温度为70‑90℃的超纯水中溶出提取物,料液比为1:40(w:v),即石斛干条的质量与超纯水的体积之比为1:40,提取的时间为2‑4h;
[0040] 步骤S22、过滤后得到一次滤液和一次滤渣;
[0041] 步骤S23、将步骤S22中的一次滤渣采用步骤S21中同样的水提法进行提取,即将一次滤渣置入温度为70‑90℃超纯水中进行再次过滤,一次滤渣与超纯水的料液比为1:40,提取的时间为2‑4h,
[0042] 过滤后得到二次滤液和二次滤渣;
[0043] 步骤S24、重复步骤S23,得到三次滤液和三次滤渣;
[0044] 本实施例中步骤S22‑S24均具体为在温度80℃的恒温磁力搅拌器中进行提取2h。
[0045] 步骤S25、将步骤S22‑S24中得到滤液进行合并,然后减压浓缩,得到提取液。
[0046] 步骤S25中的减压浓缩具体为通过旋转蒸发仪,以转速100rpm/min,水浴温度60℃条件下,减压浓缩至原体积的10%‑15%。
[0047] 实施例2
[0048] 本实施例中提供了一种石斛提取物,其采用实施例1中的一种石斛提取物的制备方法制备得到。
[0049] 对比例1
[0050] 同实施例1,所不同的是本实施例中石斛提取物的制备方法具体包括以下步骤:
[0051] 步骤S1、将石斛去根、叶,在60‑70℃条件下烘干至恒重,得到石斛干条,然后将石斛干条进行粉碎、过筛得到粉碎后的石斛;
[0052] 步骤S2、将步骤S1得到的粉碎后的石斛采用水提法进行多次提取,得到提取液,具体提取方法与实施例1相同,在此不做多于赘述;
[0053] 步骤S3,同实施例1中的步骤S3。
[0054] 本对比例中还给出了一种基于本对比例1制备的石斛提取物。
[0055] 实施例3
[0056] 本实施例中对实施例2得到的石斛提取物与对比例1得到的石斛提取物分析比对。为方便叙述,本实施例中将实施例2得到的石斛提取物称为未粉碎霍山石斛水提物,用UDHAE表示,将对比例1得到的石斛提取物称为粉碎霍山石斛水提物,用CDHAE表示。
[0057] 1、CDHAE、UDHAE成分分析
[0058] (1)、前期处理:称取适量CDHAE、UDHAE(50~100mg),加入1mL水(H2O):乙腈(ACN):异丙醇(IPA)(1:1:1,v/v),涡旋60s,低温超声30min,12000r/min,4℃离心10min取上清,‑
20℃放置1h沉淀蛋白,12000r/min,4℃离心10min,取上清真空干燥复溶于200μL 50%ACN,涡旋,14000r/min,4℃离心15min,取上清液上机检测。
[0059] (2)、液相色谱参数为:色谱柱:Waters HSS T3(100*2.1mm,1.8μm);流动相:A相为0.1%甲酸‑水溶液,B相为0.1%甲酸‑乙腈;流速0.3mL/min;柱温40℃;进样体积2μL;洗脱梯度:0.0‑1.0min A/B(100:0V/V),1.0‑9.0min A/B(5:95V/V),9‑13min A/B(5:95V/V),
13.1‑17.0min A/B(100:0V/V);整个分析过程中CDHAE、UDHAE检测样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响,采用随机顺序进行样本的连续分析。PCHE队列中插入QC样品,用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
[0060] (3)、质谱条件为:采用美国Thermo公司Q Exactive HFX高分辨质谱系统进行一级、二级谱图的采集。
[0061] 结果显示,霍山石斛水提物采用不相同的提取方法,通过三次平行实验得出最终提取率及相关含量测定,结果如表1,从表中可知,CDHAE提取率高于UDHAE药材,采用苯酚硫酸法测得二者多糖含量,CDHAE中多糖含量高于UDHAE;但对于水溶性黄酮含量和生物碱,CDHAE水溶性黄酮含量及生物碱含量均低于UDHAE。
[0062] 表1霍山石斛水提物含量测定信息表Tab.1‑3Information  Sheet for Determination of D.huoshanense Aqueous Extract Content
[0063]
[0064] 通过LC‑MS对CDHAE、UDHAE成分分析,UPLC‑Q‑TOF/MS结果显示CDHAE中有39种成分被鉴定出来,结果如图1及表2,这些化合物主要是黄酮类、萜类、氨基酸类等,其中黄酮类化合物13种。此外,UPLC‑Q‑TOF/MS结果显示UDHAE中有70种成分被鉴定出来,结果如图2及表3,这些化合物主要是黄酮类、萜类、氨基酸类等,其中黄酮类化合物24种
[0065] 表2CDHAE化学成分的质谱信息
[0066]
[0067]
[0068] 表3UDHAE化学成分的质谱信息
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073] 实施例4
[0074] 本实施例中提供了一种石斛提取物的应用,将实施例2中的一种石斛提取物应用于抑制肿瘤细胞生长的药物中。
[0075] 本实施例中通过CCK‑8法检测细胞毒性
[0076] (1)、细胞培养:取出在液氮中冻存的小鼠黑色素瘤(B16)细胞、小鼠乳腺癌(4T1)细胞、人宫颈癌(Hela)细胞、人肝癌(HepG2)细胞、人黑色素瘤(A375)细胞和人肺癌(A549)细胞,于恒温水浴锅(37℃)融化,转移至含1%(m:v)的青霉素和链霉素混合物、10%胎牛血清(m:v)的培养基中。A375、A549细胞置于DMEM完全培养基,Hela、HepG2细胞置于MEM完全培养基,B16、4T1细胞置于1640完全培养基,轻轻吹打均匀,转移至培养皿中,补齐培养液至10mL,培养条件为37℃,5%CO2。次日,观察细胞生长状态,待其生长至培养皿平底80%面积时,即可传代(1:2比例),传至三代以上才可用于后续实验。
[0077] (2)、CDHAE和UDHAE毒性试验:收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度为1×104个/mL铺于96孔培养板,每孔100μL,外圈PBS(Phosphate‑buffered saline)200μL。培养条件为37℃,5%CO2,培养24h,用不同浓度的CDHAE、UDHAE(0.5、1、2、4、8mg/mL)药液处理。实验设定给药组和空白组,每种药物设多个复孔,每孔加入含有药物的完全培养基100μL,并培养24h。次日,弃培养液,每孔加入完全培养基100μL后,再向每孔中加入10μL CCK‑8(Cell Counting Kit‑8)溶液,继续培养3~4h,直至无颜色变化,用酶标仪在450nm处测定吸光度,使用Graphpad Prism软件进行数据处理。按公式计算细胞增殖活力(%),增殖活力%=(给药组/空白组)×100%)。
[0078] 结果见图3所示,药材经不同方式处理后,对肿瘤细胞的抑制增殖效果有所差异,在0.5~8mg/mL给药范围内,UDHAE对B16、4T1、HepG2、A375、Hela及A549细胞均有抑制增殖作用,且4mg/mL与8mg/mL相比较也具有显著性差异,其中对B16、Hela及HepG2细胞的抑制作用较明显,对B16细胞作用最为明显,IC50=1.38±0.82mg/mL,细胞生存率随着给药浓度的升高而降低,且呈现剂量依赖性,石斛提取物在2mg/mL时,能诱导B16细胞凋亡,凋亡率为56.53±0.47%,且可阻滞B16细胞周期于G0/G1期。
[0079] UDHAE与CDHAE组高浓度(8mg/mL)相比较,均具有显著性差异,CDHAE对A375、4TI及A549细胞均有抑制增殖作用,B16、Hela及HepG2细胞均无抑制增殖作用,其中对A375及4TI细胞的抑制作用较明显,对A375细胞作用最为明显,在0.5~8mg/mL给药范围内,IC50=3.95±0.39mg/mL,细胞生存率随着给药浓度的升高而降低,且呈现剂量依赖性。
[0080] 基于细胞毒性实验结果,进一步通过细胞活死染色、流式细胞术等实验探究UDHAE对B16细胞的影响及抗肿瘤作用。
[0081] 结果见图4和图5所示,细胞活死染色、细胞凋亡周期等实验结果表明UDHAE能抑制肿瘤细胞增殖,并诱导其凋亡,明确了UDHAE为霍山石斛抗肿瘤作用的重要组分。
[0082] 容易理解的是,本领域技术人员在本申请提供的一个或几个实施例基础上,可以对本申请的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例,这些实施例均没有超出本申请的保护范围。
[0083] 总之,以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰,皆应属本发明专利的涵盖范围。

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