[0001] 本发明涉及一种石斛提取，尤其涉及了一种石斛提取物及其制备方法和应用。

[0002] 石斛不仅含有多糖、黄酮类等活性因子，还富含氨基酸、维生素、蛋白质等多种营养成分。现有石斛药理研究表明其具有抗肿瘤作用，但药效物质基础尚不明确，因而导致石斛为抗肿瘤药物研究提供支撑仍然存在较大困难，因而亟待提供一种药效物质基础明确的石斛提取方法。

[0031] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。

[0032] 实施例1

[0033] 本实施例提供了一种石斛提取物的制备方法，具体的本实施例中选用的石斛为霍山石斛(D.huoshanense)，又名米斛，属于兰科多年生草本植物，其主要产于安徽省霍山县大别山一带。

[0034] 石斛提取物的制备方法具体包括以下步骤：

[0035] 步骤S1、将石斛去根、叶，在60‑70℃条件下烘干至恒重，得到石斛干条；

[0036] 步骤S2、将步骤S1得到的石斛干条采用水提法进行多次提取，得到提取液；

[0037] 步骤S3、将提取液在冷冻干燥机中冻干得到冻干粉，然后将冻干粉保存于‑20℃冰箱中得到石斛提取物冻干粉，备用。

[0038] 其中，步骤S2中具体包括以下步骤：

[0039] 步骤S21、对石斛干条进行水提法进行提取，具体为将石斛干条置入温度为70‑90℃的超纯水中溶出提取物，料液比为1:40(w:v)，即石斛干条的质量与超纯水的体积之比为1:40，提取的时间为2‑4h；

[0040] 步骤S22、过滤后得到一次滤液和一次滤渣；

[0041] 步骤S23、将步骤S22中的一次滤渣采用步骤S21中同样的水提法进行提取，即将一次滤渣置入温度为70‑90℃超纯水中进行再次过滤，一次滤渣与超纯水的料液比为1:40，提取的时间为2‑4h，

[0042] 过滤后得到二次滤液和二次滤渣；

[0043] 步骤S24、重复步骤S23，得到三次滤液和三次滤渣；

[0044] 本实施例中步骤S22‑S24均具体为在温度80℃的恒温磁力搅拌器中进行提取2h。

[0045] 步骤S25、将步骤S22‑S24中得到滤液进行合并，然后减压浓缩，得到提取液。

[0046] 步骤S25中的减压浓缩具体为通过旋转蒸发仪，以转速100rpm/min，水浴温度60℃条件下，减压浓缩至原体积的10％‑15％。

[0047] 实施例2

[0048] 本实施例中提供了一种石斛提取物，其采用实施例1中的一种石斛提取物的制备方法制备得到。

[0049] 对比例1

[0050] 同实施例1，所不同的是本实施例中石斛提取物的制备方法具体包括以下步骤：

[0051] 步骤S1、将石斛去根、叶，在60‑70℃条件下烘干至恒重，得到石斛干条，然后将石斛干条进行粉碎、过筛得到粉碎后的石斛；

[0052] 步骤S2、将步骤S1得到的粉碎后的石斛采用水提法进行多次提取，得到提取液，具体提取方法与实施例1相同，在此不做多于赘述；

[0053] 步骤S3，同实施例1中的步骤S3。

[0054] 本对比例中还给出了一种基于本对比例1制备的石斛提取物。

[0055] 实施例3

[0056] 本实施例中对实施例2得到的石斛提取物与对比例1得到的石斛提取物分析比对。为方便叙述，本实施例中将实施例2得到的石斛提取物称为未粉碎霍山石斛水提物，用UDHAE表示，将对比例1得到的石斛提取物称为粉碎霍山石斛水提物，用CDHAE表示。

[0057] 1、CDHAE、UDHAE成分分析

[0058] (1)、前期处理：称取适量CDHAE、UDHAE(50～100mg)，加入1mL水(H2O)：乙腈(ACN)：异丙醇(IPA)(1：1：1，v/v)，涡旋60s，低温超声30min，12000r/min，4℃离心10min取上清，‑
20℃放置1h沉淀蛋白，12000r/min，4℃离心10min，取上清真空干燥复溶于200μL 50％ACN，涡旋，14000r/min，4℃离心15min，取上清液上机检测。

[0059] (2)、液相色谱参数为：色谱柱：Waters HSS T3(100*2.1mm，1.8μm)；流动相：A相为0.1％甲酸‑水溶液，B相为0.1％甲酸‑乙腈；流速0.3mL/min；柱温40℃；进样体积2μL；洗脱梯度：0.0‑1.0min A/B(100：0V/V)，1.0‑9.0min A/B(5：95V/V)，9‑13min A/B(5：95V/V)，
13.1‑17.0min A/B(100：0V/V)；整个分析过程中CDHAE、UDHAE检测样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。PCHE队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

[0060] (3)、质谱条件为：采用美国Thermo公司Q Exactive HFX高分辨质谱系统进行一级、二级谱图的采集。

[0061] 结果显示，霍山石斛水提物采用不相同的提取方法，通过三次平行实验得出最终提取率及相关含量测定，结果如表1，从表中可知，CDHAE提取率高于UDHAE药材，采用苯酚硫酸法测得二者多糖含量，CDHAE中多糖含量高于UDHAE；但对于水溶性黄酮含量和生物碱，CDHAE水溶性黄酮含量及生物碱含量均低于UDHAE。

[0062] 表1霍山石斛水提物含量测定信息表Tab.1‑3Information  Sheet for Determination of D.huoshanense Aqueous Extract Content

[0063]

[0064] 通过LC‑MS对CDHAE、UDHAE成分分析，UPLC‑Q‑TOF/MS结果显示CDHAE中有39种成分被鉴定出来，结果如图1及表2，这些化合物主要是黄酮类、萜类、氨基酸类等，其中黄酮类化合物13种。此外，UPLC‑Q‑TOF/MS结果显示UDHAE中有70种成分被鉴定出来，结果如图2及表3，这些化合物主要是黄酮类、萜类、氨基酸类等，其中黄酮类化合物24种

[0065] 表2CDHAE化学成分的质谱信息

[0066]

[0067]

[0068] 表3UDHAE化学成分的质谱信息

[0069]

[0070]

[0071]

[0072]

[0073] 实施例4

[0074] 本实施例中提供了一种石斛提取物的应用，将实施例2中的一种石斛提取物应用于抑制肿瘤细胞生长的药物中。

[0075] 本实施例中通过CCK‑8法检测细胞毒性

[0076] (1)、细胞培养：取出在液氮中冻存的小鼠黑色素瘤(B16)细胞、小鼠乳腺癌(4T1)细胞、人宫颈癌(Hela)细胞、人肝癌(HepG2)细胞、人黑色素瘤(A375)细胞和人肺癌(A549)细胞，于恒温水浴锅(37℃)融化，转移至含1％(m:v)的青霉素和链霉素混合物、10％胎牛血清(m:v)的培养基中。A375、A549细胞置于DMEM完全培养基，Hela、HepG2细胞置于MEM完全培养基，B16、4T1细胞置于1640完全培养基，轻轻吹打均匀，转移至培养皿中，补齐培养液至10mL，培养条件为37℃，5％CO2。次日，观察细胞生长状态，待其生长至培养皿平底80％面积时，即可传代(1：2比例)，传至三代以上才可用于后续实验。

[0077] (2)、CDHAE和UDHAE毒性试验：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为1×104个/mL铺于96孔培养板，每孔100μL，外圈PBS(Phosphate‑buffered saline)200μL。培养条件为37℃，5％CO2，培养24h，用不同浓度的CDHAE、UDHAE(0.5、1、2、4、8mg/mL)药液处理。实验设定给药组和空白组，每种药物设多个复孔，每孔加入含有药物的完全培养基100μL，并培养24h。次日，弃培养液，每孔加入完全培养基100μL后，再向每孔中加入10μL CCK‑8(Cell Counting Kit‑8)溶液，继续培养3～4h，直至无颜色变化，用酶标仪在450nm处测定吸光度，使用Graphpad Prism软件进行数据处理。按公式计算细胞增殖活力(％)，增殖活力％＝(给药组/空白组)×100％)。

[0078] 结果见图3所示，药材经不同方式处理后，对肿瘤细胞的抑制增殖效果有所差异，在0.5～8mg/mL给药范围内，UDHAE对B16、4T1、HepG2、A375、Hela及A549细胞均有抑制增殖作用，且4mg/mL与8mg/mL相比较也具有显著性差异，其中对B16、Hela及HepG2细胞的抑制作用较明显，对B16细胞作用最为明显，IC50＝1.38±0.82mg/mL，细胞生存率随着给药浓度的升高而降低，且呈现剂量依赖性，石斛提取物在2mg/mL时，能诱导B16细胞凋亡，凋亡率为56.53±0.47％，且可阻滞B16细胞周期于G0/G1期。

[0079] UDHAE与CDHAE组高浓度(8mg/mL)相比较，均具有显著性差异，CDHAE对A375、4TI及A549细胞均有抑制增殖作用，B16、Hela及HepG2细胞均无抑制增殖作用，其中对A375及4TI细胞的抑制作用较明显，对A375细胞作用最为明显，在0.5～8mg/mL给药范围内，IC50＝3.95±0.39mg/mL，细胞生存率随着给药浓度的升高而降低，且呈现剂量依赖性。

[0080] 基于细胞毒性实验结果，进一步通过细胞活死染色、流式细胞术等实验探究UDHAE对B16细胞的影响及抗肿瘤作用。

[0081] 结果见图4和图5所示，细胞活死染色、细胞凋亡周期等实验结果表明UDHAE能抑制肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡，明确了UDHAE为霍山石斛抗肿瘤作用的重要组分。

[0082] 容易理解的是，本领域技术人员在本申请提供的一个或几个实施例基础上，可以对本申请的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例，这些实施例均没有超出本申请的保护范围。

[0083] 总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。