[0001] 本发明属于天然药物化学技术领域，具体涉及从蒙药泡囊草中分离出的一种类托酚酮新骨架化合物B及其制备方法，还涉及该化合物在制备抗胃癌药物中的应用。

[0002] 胃癌(Gastric carcinom，GC)是一种原发于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，全球每年新发病例超过100万，为全球癌症相关死亡的第三大常见原因。据统计，由于饮食结构的改变、工作压力导致的情绪焦虑以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得我国胃癌新发人群呈现年轻化倾向。临床上治疗胃癌的技术手段主要包括手术切除、化疗、放疗等，大部分胃癌患者因其早期症状不显在被确诊时已处于中、晚期阶段，错失手术治疗最佳时机，只能采取药物化疗。目前，世界范围内能够提高胃癌患者生存率的临床一线药物有奥沙利铂、伊立替康、氟尿嘧啶等，但均存在药物毒性以及耐药性的问题。与化学药物不同，天然药物具有天然无毒、调节免疫、多靶点的特性，在胃癌的治疗中占有越来越重要的地位。因此，从天然产物中寻找开发新型靶点疗效高且毒性低的化疗药物是临床上治疗胃癌前病变和胃癌的研发方向之一。

[0003] 泡囊草为茄科植物泡囊草(Physochlaina physaloides(L.)G.Don)的干燥根茎，作为蒙药始载于蒙医经典著作《无误蒙药鉴》，蒙药名“混‑浩日素”或“唐普如木”，主产于内蒙古、黑龙江、河北等地。泡囊草的根茎具有强烈的芳香气味和极为类似人参的外观，其乙醇酊剂在蒙医临床上常被用于治疗肠胃炎症、痉挛、脑刺痛、肿瘤和微生物感染等。目前研究发现泡囊草中主要含有二氢黄酮、黄酮醇苷、羟基香豆素、托品烷生物碱等成分，但结构、活性均为已知，缺乏深入的系统化学研究，尤其是泡囊草中对胃癌起到毒性作用的活性成分至今不明确。

[0004] 为进一步发现结构新颖抗肿瘤活性良好的化合物，本发明采用多种色谱分离手段，如ODS、MCI柱层析以及制备型HPLC，运用多种波谱技术，如核磁共振、高分辨质谱、电子圆二色谱等，从蒙药泡囊草醇提物的正丁醇部位中发现了一个类托酚酮新骨架化合物B，并包含了其制备方法与抗胃癌方面的应用。

[0032] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

[0033] 实例一：Physochlosides B的制备方法

[0034] ①原材料获取：泡囊草(Physochlaina physaloides(L.)G.Don)根茎于2019年8月采自内蒙古自治区乌兰察布盟兴和县，标本现存于内蒙古大学植物标本馆(编号HIMC0031223)，采回的新鲜根茎在45℃恒温电热烘箱中干燥至恒重。

[0035] ②浸膏提取：取5.0kg泡囊草干燥根机械粉碎，用95％乙醇浸泡24h超声辅助提取3h(料液比＝1:3)，提取程序重复3天，合并提取液，40～45℃减压浓缩，得到总乙醇浸膏
0.68kg。

[0036] ③浸膏萃取：将0.68kg总乙醇浸膏混悬于2L超纯水中，依次用石油醚(6L)、乙酸乙酯(6L)、正丁醇(6L)萃取，萃取液40～45℃减压浓缩后，得到石油醚部位13g、乙酸乙酯部位28g、正丁醇部位39g。

[0037] ④反相ODS柱色谱分离：取上述正丁醇部位39g，用少量甲醇溶解备用。ODS填料(粒径75μM)装柱，湿法上样，甲醇‑水(20:80～80:20，v/v)梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪分析，合并相同流分后得7个主流分(Fr.A～Fr.G)。

[0038] ⑤反相MCI柱色谱分离：取6.2g干燥后的主流分Fr.C(50％甲醇水洗脱组分)，用甲醇和水(1:4，v/v)溶解。MCI填料(粒径75μM)装柱，湿法上样，甲醇‑水(20:80～70:30，v/v)梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪分析，合并相同流分后得5个次级流分(Fr.C1～Fr.C5)。

[0039] ⑥反相ODS柱色谱分离：取2.5g干燥后的次级流分Fr.C1(60％甲醇水洗脱组分)，用甲醇和水(1:4，v/v)溶解。ODS填料(粒径50μM)装柱，湿法上样，甲醇‑水(20:80～85:15，v/v)梯度洗脱，TLC薄层色谱跟踪分析，合并相同流分后得5个次级流分(Fr.C1.1～Fr.C1.5)。

[0040] ⑦反相制备液相色谱纯化富集；取1.1g干燥后的次级流分Fr C1.5(60％甲醇水洗脱组分)，用甲醇和水(2:3，v/v)溶解过滤，经反相制备液相色谱(C‑18)多次重复纯化富集，流速8mL/min，双通道波长254nm和280nm，流动相为甲醇：水(40:60～80:20，v/v)，在保留时间28.4min左右得到该化合物。

[0041] 实例二：Physochlosides B的结构鉴定

[0042] 无色不定形固体，Q‑TOF‑MS结果显示m/z:539.2207[M－H]－，提示其分子量为540。1 13
结合H和 C(表1)确定其分子式为C26H36O12，计算不饱和度为9。

[0043] 表1.式I所示化合物在DMSO‑d6中的1H‑NMR(500MHz)和13C‑NMR(500MHz)化学位移数据

[0044]

[0045]

[0046] 参照附图1～8，结合表1数据。该化合物分子中存在两个糖基团，端基碳上的氢信号分别为[δH 4.79(d,J＝7.8Hz)]和[δH 4.21(d,J＝7.8Hz)]，由于耦合常数均为7.8Hz故确定为β构型。除上述糖基团外，还存在两个甲基[δMe‑13 1.76(br s)；δMe‑14 2.20(br s)]，三个亚甲基[δH‑1a 2.89(m),δH‑1b 3.05(m)；δH‑3a 2.87(m),δH‑3b 3.14(m)；δH‑12a 4.77(br s),δH‑12b 4.80(br s)]，三个次甲基[δH‑2 2.87(m)；δH‑7 7.19(d,J＝9.8Hz)；δH‑8 7.00(br d,J＝9.8Hz)]、一个羰基碳(δC‑5 178.5)和六个烯烃碳信号。由二维核磁图谱进一步分析发现1 1
，H‑H COSY中的H(1)‑H(2)‑H(3)、H(7)‑H(8)、H(11)‑H(12)‑H(13)三个自旋体系，以及HMBC中的H3‑13与C‑2、C‑11、C‑12；H‑12与C‑2、C‑11；H‑1与C‑2、C‑3、C‑8、C‑9、C‑11三种关联方式，共同确定了骨架右侧五元环和异丙烯基的存在。另一个自旋体系H(7)‑H(8)，以及H3‑14与C‑4、C‑5、C‑10；H‑7和C‑5、C‑6、C‑9；H‑8和C‑6、C‑7、C‑10三种关联确定了骨架左侧七元环的存在。糖基的连接位置通过H‑1’到C‑6’和H‑1”到C‑6”的HMBC相关性确定。此外，根据水解反应结果确定化合物中的糖基团均为D‑葡萄糖。该化合物绝对构型则由ECD计算确定，结果发现2‑S构型与化合物实际测得CD谱相符合。经上述证据表明，化合物结构确定为2‑
isopropenyl‑4‑methyl‑6‑[3,4,5‑trihydroxy‑6‑(3,4,5‑trihydroxy‑6‑hydroxymethyl‑te trahydro‑pyran‑2‑yloxymethyl)‑tetrahydro‑pyran‑2‑yloxy]‑2,3‑dihydro‑1H‑azulen‑5‑oen，简称为Physochlosides B。

[0047] 实例三：Physochlosides B的抗胃癌作用

[0048] 对式I所示类托酚酮新骨架化合物的体外抗肿瘤活性进行了考察，在相关实验中所采用的肿瘤细胞株系为胃癌HGC‑27细胞，结果参照附图9～10。

[0049] ①细胞毒性：用培养基将对数期生长的HGC‑27细胞稀释成细胞悬液后，接种于无菌细胞板(96孔)，每孔体积80μL，密度为5000细胞每孔。接种好的细胞板置CO2培养箱过夜后，处理组每孔分别加入10μL的待测化合物(5、10、25、50μM)，对照组每孔加入相同体积的生理盐水。CO2培养箱培养48h后，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液继续培养4h，弃掉培养液，加入150μL DMSO，震荡均匀，使活细胞中的甲 晶体充分溶解。酶标仪570nm下检测细胞板各孔吸光值，三个独立重复进行。

[0050] 经线性回归计算IC50值，结果显示本发明化合物对人胃癌HGC‑27细胞具有显著的毒性作用，IC50为7.02μM，并呈剂量依赖性。②细胞凋亡：对数期生长的HGC‑27细胞用培养基4
稀释成细胞悬液，接种于无菌细胞板(24孔)，每孔体积200μL，密度为2×10细胞每孔。接种好的细胞板置CO2培养箱过夜后，处理组每孔分别加入不同浓度(0、10、25、50μM)待测化合物，继续培养48h后取出细胞板，PBS洗涤1次，加入1mL的4％多聚甲醛固定细胞。室温静置
15min后PBS洗涤1次，加入适量5μg/mL的Hoechst 33342染液，覆盖住细胞即可，37℃孵育
10min。待染色充分后吸出染液，PBS洗涤3次，每次3分钟，荧光显微镜下直接观察拍照。

[0051] Hoechst 33342荧光染料能少许通过正常细胞膜，让正常细胞染上均匀的低亮蓝色荧光。凋亡细胞则由于细胞膜上的P‑糖蛋白功能受损，膜通透性增强，使得该荧光染料大量进入从而呈现紧密的高亮蓝色荧光。结果本发明化合物处理后HGC‑27细胞出现密集的高亮蓝色荧光。随着处理浓度增加视野中发生凋亡的癌细胞数目也明显上升。

[0052] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。