[0001] 本发明属于生殖医学技术领域，具体地说，是关于一种圣草酚在制备预防和/或治疗复发性自然流产的药物中的应用。

[0002] 复发性自然流产(recurrent miscarriage,RM)为连续发生三次或三次以上的自然流产，多发生于妊娠早期，发病率通常为1％～5％。目前RM的病因主要集中在女性生殖道畸形、遗传性因素、免疫性因素、内分泌代谢性因素等。

[0003] 绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophoblast，EVT)的主要特点为有自主侵袭和迁移的能力，与肿瘤细胞的侵袭迁移具有一定的相似性，但EVT的侵袭迁移和肿瘤细胞最大的不同在于，在胎盘形成后，EVT的侵袭迁移将终止。所以在早期妊娠时，EVT功能的正确执行是影响胚胎存活的关键。若EVT浸润妊娠子宫肌层不足将会导致胎盘形成异常，进而导致流产等妊娠相关疾病的患病风险增高。近年来，越来越多的研究证据显示，RM的发生与EVT侵袭迁移功能机制失衡关联密切。深入研究并阐明RM的发病机制对寻找有效的治疗靶点以及制定新的诊疗策略具有极其重要的意义。

[0004] 目前有较多研究报道BMP信号通路在妊娠维持方面起着重要作用。BMPR2作为BMP信号通路的二型受体之一，对小鼠植入后胚胎发育和妊娠维持的子宫功能至关重要。研究表明，小鼠子宫蜕膜中BMPR2的缺失会引发中期蜕膜化异常，导致血管发育异常、滋养层缺陷和子宫自然杀伤细胞缺乏，从而造成流产等妊娠相关疾病的发生。另外，对于BMPR2激活的下游p‑SMAD1，也有许多文献报道其激活程度与细胞的侵袭迁移程度成正相关。Xu等研究表明，p‑Smad1信号通路的激活可通过EMT促进头颈部鳞状癌细胞的侵袭和迁移；Gao等发现，在黑色素瘤组织中，p‑SMAD1的表达相较于正常组织高，加入p‑Smad1信号通路的特异性抑制剂后，可以减弱黑色素瘤细胞的侵袭；滋养层细胞的侵袭和肿瘤细胞的侵袭具有相似性，故Yu等人发现GDF15促进了HTR‑8/SVneo和JEG‑3细胞的迁移和侵袭能力，并且GDF15是通过增加p‑Smad1磷酸化，导致SNAI1/2和VIMENTIN上调，从而促进滋养层细胞的侵袭迁移。综上，研究滋养层细胞侵袭的机制及调控因素对于防治胎盘相关疾病是至关重要的。

[0005] 在虚拟药物筛选与设计方面，计算机模拟分子对接是一种常见的方法。这种方法用到的主要原理是对受体‑配体复合物结合的构象经由一些计算机算法进行合理预测。受体通常是蛋白质等生物大分子，配体可以是小分子或者生物大分子。所以利用这种方法，我们可以从现存的小分子数据库、多肽库、天然化合物库等对目的受体进行分子对接，以期待能够筛选出特定靶点的激活剂或抑制剂，继而进行下一步的实验验证。

[0028] 以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0029] 以下实施例中所使用的实验材料，如未特别说明的，均可通过常规市售途径获得。

[0030] 实施例1

[0031] 从PDB蛋白数据(https://www.rcsb.org/)中下载BMPR2蛋白(PDB编号：3G2F)的三维构象，利用薛定谔软件(Schrodinger)对该蛋白的构象进行结构优化，利用Sitemap模块预测其配体的结合位点。从ZINC小分子数据库(https://zinc.docking.org/)下载了63925个“可购买‑已命名”的小分子配体，利用LigPrep模块对小分子配体进行批量预处理。使用Virtual Screening Workflow模块对小分子和优化后的BMPR2三维构象进行批量对接，最后保留打分最高的小分子化合物‑圣草酚(ERI)进行后续实验验证。

[0032] 圣草酚是一种已知的黄酮类化合物，是一种有效的黑素生成抑制剂，结构式如下：

[0033]

[0034] 图1显示了使用薛定谔软件结合分子对接技术筛选到的BMPR2的小分子激动剂‑圣草酚(ERI)与BMPR2蛋白对接的二维图。从图中可以看出，圣草酚可以与BMPR2蛋白的ARG 211、GLU 280、TYR 282、ASP 361形成氢键，这些氨基酸均位于ERI的结合位点内，表明ERI与BMPR2蛋白结合紧密，具有较好的预测活性。

[0035] 实施例2

[0036] 将HTR8/SVneo细胞(人绒毛膜滋养层细胞系，商业化细胞)按照5×103个细胞/孔接种于96孔板中，将细胞放入细胞孵箱培养24小时，使细胞完全贴壁。将细胞分为空白组，DMSO组，ERI 5μM组，ERI 10μM组，ERI 15μM组，以及ERI 20μM组，分别将每孔加入DMSO或者相应的药物浓度的培养基，继续培养24小时后，将原培养基吸出，向每孔加入含10％CCK8溶液的新鲜培养基，孵育1～2h后，等其出现橙黄色后，将其置于酶标仪并用450nm测吸光度，测量并记录数据。后续的数据分析按照以下公式计算细胞活性：

[0037] 细胞活性(％)＝[A(加药)‑A(空白)]/[A(DMSO)‑A(空白)]×100。

[0038] 图2显示了用CCK8检测不同浓度的ERI对HTR8/Svneo细胞的毒性作用。由图2可以看出，5μM ERI、10μM ERI、15μM ERI对HTR8/Svneo细胞的生长无明显抑制作用(P＞0.05)，但20μM ERI对HTR8/Svneo细胞的生长有明显抑制作用(P＜0.05)。

[0039] 鉴于20μM ERI对HTR8/Svneo细胞有毒性作用，后续实验选择15μM的ERI浓度进行。

[0040] 实施例3

[0041] 将HTR8/Svneo细胞按照5×105个细胞/孔接种于6孔板中，将细胞放入细胞孵箱培养24小时，使细胞完全贴壁。将细胞分为空白组，ERI 5μM组，ERI 10μM组，ERI 15μM组，以及ERI 20μM组，分别将每孔加入DMSO或者相应的药物浓度的培养基，继续培养1.5小时后，将培养基吸出，并用预冷的PBS缓冲液清洗细胞两次。

[0042] 将预先配置好的蛋白裂解液(RIPA,1％PI,1％PMSF,1％磷酸酶抑制剂)，按照每孔200μL分别加入六孔板，用细胞刮刀在冰上裂解细胞。

[0043] 将得到的细胞蛋白样品进行SDS‑PAGE电泳分离，经转膜(硝酸纤维素膜)和封闭后，用p‑SMAD1(ab226821,Abcam)、SMAD1(ab126761,Abcam)、snail(#3879,CST)、ID1(ab283650,Abcam)、GAPDH(60004‑1‑Ig,Proteintech)等一抗4℃孵育过夜，然后用TBST缓冲液洗涤膜3次，在室温下与适当的对应种属的二抗孵育1小时，并使用Odyssey CLx成像系统检测。

[0044] 图3显示了用western blot检测不同浓度的ERI对HTR8/Svneo细胞的信号通路(p‑SMAD1)及下游转录因子的激活情况。结果显示，当用不同浓度的ERI刺激HTR8/Svneo细胞时，可观察到p‑SMAD1信号通路及下游转录因子snail、ID1明显激活，并且具有浓度依赖性，提示ERI是p‑SMAD1信号通路的激活剂，并且可能促进HTR8/Svneo细胞侵袭、迁移。

[0045] 实施例4

[0046] 将HTR8/SVneo细胞按照3.5×105个细胞/孔接种于6孔板中，将细胞放入细胞孵箱培养24小时，使细胞完全贴壁。将细胞分为NC组，NC+ERI 15μM组，si BMPR2组，以及si BMPR2+ERI 15μM组。将Lipofectamine 2000(Invitrogen，马萨诸塞州)与siBMPR2(5′‑CCT AAC TGT ATACCAGAA TTA‑3′，TsingkeBiotechnology，上海)和阴性对照(Negtive Control)(TsingkeBiotechnology，上海)混合并分别加至对应的孔中，转染6小时后加入完全培养基，放入细胞孵箱继续培养24小数后，分别向si BMPR2组，si BMPR2+ERI 15μM组加入15μM ERI，继续培养1.5小时后，将培养基吸出，并用预冷的PBS缓冲液清洗细胞两次。

[0047] 再用上述同样的方法得到的细胞蛋白样品，并进行SDS‑PAGE电泳分离，经转膜(硝酸纤维素膜)和封闭后，用BMPR2(SAB5300505,Sigma‑Aldrich)，p‑SMAD1(ab226821,Abcam)、SMAD1(ab126761,Abcam)、snail(#3879,CST)、ID1(ab283650,Abcam)、GAPDH(60004‑1‑Ig,Proteintech)等一抗4度孵育过夜，然后，用TBST缓冲液洗涤膜3次，在室温下与适当的对应种属的二抗孵育1小时，并使用Odyssey CLx成像系统检测。

[0048] 图4显示了用western blot检测敲低BMPR2后，再用ERI刺激HTR8/Svneo细胞，其信号通路(p‑SMAD1)及下游转录因子的激活情况。由图4的结果可知，在敲低HTR8/Svneo细胞BMPR2的条件下，再加入15μM ERI刺激，可观察到p‑SMAD1信号通路及下游转录因子snail、ID1明显下降，说明ERI是通过BMPR2来激活p‑SMAD1信号通路的，可见ERI不仅是p‑SMAD1信号通路的激活剂，而且也是BMPR2的潜在激活剂。

[0049] 实施例5

[0050] 将HTR8/SVneo细胞按照5×105个细胞/孔接种于6孔板中，将细胞放入细胞孵箱培养24～48小时，直至细胞融合度达到90％左右。将细胞分为空白组，ERI 5μM组，ERI10μM组，ERI 15μM组，以及ERI 20μM组。用200μL枪头垂直于六孔板制造线性划痕，吸出旧培养基，并用PBS缓冲液轻柔地冲洗细胞2～3次，直至被划下的细胞冲洗干净。然后分别向相应的孔中加入含有0.1％FBS的RPMI 1640培养基(Thermo Fisher，马萨诸塞州)及含有对应浓度ERI的0.1％FBS的RPMI 1640培养基，用显微镜(尼康，纽约州梅尔维尔)观察划痕。在0小时、24小时拍摄图像。以0小时作为对照，使用ImageJ软件分析每个划痕的面积。

[0051] 图5显示了用划痕实验探究不同浓度的ERI对HTR8/Svneo细胞侵袭迁移能力的影响。结果显示，当用不同浓度的ERI刺激HTR8/Svneo细胞时，与对照组相比，5μM ERI组的细胞迁移率无显著变化(P＞0.05)。10μM ERI组、15μM ERI组、20μM ERI组的细胞迁移率均有显著增加并且随着浓度递增，说明适当浓度的ERI对HTR8/Svneo细胞的迁移有促进作用。

[0052] 实施例6

[0053] 将HTR8/SVneo细胞按照3.5×105个细胞/孔接种于6孔板中，将细胞放入细胞孵箱培养24h，使细胞完全贴壁。将细胞分为NC组，NC+ERI 15μM组，si BMPR2组，以及si BMPR2+ERI 15μM组。使用NC siRNA和si BMPR2分别转染对应的孔后，将细胞放入细胞孵箱机组培养24h，直至细胞融合度达到90％左右。

[0054] 按照上述同样的方法，用200μL枪头垂直于六孔板制造线性划痕，然后分别向相应的孔中加入含有0.1％FBS的RPMI 1640培养基(Thermo Fisher，马萨诸塞州)及含有15μMERI的0.1％FBS的RPMI 1640培养基，用显微镜(尼康，纽约州梅尔维尔)观察划痕。在0小时、24小时拍摄图像。以0小时作为对照，使用ImageJ软件分析每个划痕的面积。

[0055] 图6显示了用划痕实验探究敲低BMPR2后，再用ERI刺激HTR8/Svneo细胞，其侵袭迁移能力的变化。结果显示，在敲低HTR8/Svneo细胞BMPR2的条件下，再加入15μMERI刺激，可观察到HTR8/Svneo细胞的迁移率明显下降，说明ERI是通过BMPR2来促进细胞的迁移。

[0056] 实施例7

[0057] 本实施例中所使用的雄性和雌性C57BL/6小鼠(7‑8周龄)均购自上海必凯科翼生物科技。所有涉及动物的实验程序均按照《实验动物护理和使用指南(中国)》进行，所有动物均饲养在有空调的屏障设施中，并有12小时光照和12小时黑暗循环。

[0058] 将一只雄性小鼠和两只雌性小鼠饲养在一起进行交配。第二天早上检查雌性小鼠是否有交配栓，交配栓的存在表示妊娠第0.5天。将交配后的雌性小鼠与雄性小鼠分开。将雌性小鼠随机分成三组，分别为对照组、LPS组、LPS+ERI组。在妊娠第7.5天，分别向对照组、LPS组、LPS+ERI组雌性小鼠腹膜内注射200uL玉米油、0.25mg/kg LPS、0.25mg/kgLPS+40mg/kg ERI，并每天动态监测雌性小鼠的体重变化。在妊娠第13.5天，用阿佛丁(Nanjing Aibei Biotechnology,南京)对三组小鼠实施安乐死，以确定胎儿吸收率并对胎盘进行称重并检查是否有畸形。根据以下公式计算胎儿吸收率：

[0059] 胎儿吸收率＝吸收数/(存活胎儿数+吸收数)。

[0060] 图7显示了对照组、流产模型组(LPS 0.25mg/kg)、ERI治疗组(LPS 0.25mg/kg+ERI40mg/kg)的子宫整体观，图8显示了对照组、流产模型组(LPS 0.25mg/kg)、ERI治疗组(LPS 0.25mg/kg+ERI 40mg/kg)的胎盘、胎鼠情况，图9显示了对照组、流产模型组(LPS 0.25mg/kg)、ERI治疗组(LPS 0.25mg/kg+ERI 40mg/kg)的胎鼠吸收率。

[0061] 由图7、图8、和图9的结果可以发现，与正常对照相比，LPS组的胚胎吸收率、胚胎异常率明显增加，ERI治疗组的胚胎吸收率、胚胎异常率相比LPS组有了明显下降，说明ERI可在一定程度上逆转由LPS导致的小鼠异常生殖表型。

[0062] 图10显示了对照组、流产模型组(LPS 0.25mg/kg)、ERI治疗组(LPS 0.25mg/kg+ERI40mg/kg)的胎盘重量，可知与正常对照相比，LPS组的胎盘重量总体呈现下降趋势，ERI治疗组的胎盘重量相对于LPS组有明显改善，说明ERI可在一定程度上逆转由LPS导致的小鼠异常生殖表型。

[0063] 综合以上实验可知，本发明所筛选到的圣草酚是p‑SMAD1信号通路的激活剂，并且是通过BMPR2来激活p‑SMAD1信号通路的，也是BMPR2的潜在激活剂；适当浓度的ERI对HTR8/Svneo细胞的迁移有促进作用，并且是通过BMPR2来促进滋养层细胞的迁移，同时ERI可在一定程度上逆转由LPS导致的小鼠异常生殖表型。因此，圣草酚可用于制备预防和/或治疗复发性自然流产的药物，用作p‑SMAD1信号通路的激动剂，以及用作BMPR2的激动剂。

[0064] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰同样属于本发明的范围。