[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及联苯类化合物的制备方法及其用途，具体涉及从药用植物山楂叶中分离得到的2个联苯类化合物，以及该化合物在制备抗氧化药物的应用。

[0002] 山楂叶是蔷薇科植物山里红(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)或山楂(C.pinnatifida Bge.)的干燥叶，主要分布于我国东北、华北等地。最早于东晋时期《肘后方》中就有山楂叶煮汁，治漆疮的记载。山楂叶通常在夏、秋二季采收，晾干，其粉末用药或泡茶饮，具有消食健胃、行气散瘀、化浊降脂等功效。山楂叶及其制剂在临床治疗中已有广泛地应用，如山玫胶囊以山楂叶50％乙醇提取部位和刺玫果的70％乙醇提取部位为原料，用于治疗冠心病、脑动脉硬化等病症，已经被收录于2020年版的《中国药典》，是药食两用的典范。

[0003] 山楂叶含有丰富的化学成分，如黄酮类、萜类、酚酸类、联苯及其苷类、糖苷类及一些微量有机物等。而对山楂叶中新化合物的研究还在不断进行中。本发明中采用70％乙醇提取和多种柱色谱方法，对山楂叶中的化学成分进行分离纯化，并应用DPPH和ABTS自由基清除实验对山楂叶中分离得到的2个新化合物进行了抗氧化活性筛选，发现2个新化合物均具有良好的抗氧化活性。

[0037] 本发明结合具体实施例作进一步的说明。

[0038] 实施例1

[0039] 山楂叶中化合物1‑2的制备方法，具体操作如下：

[0040] (1)选取山楂叶25kg，用70％(v:v)工业乙醇采用冷浸回流的方式提取3次，每次2h，提取液减压浓缩得浓缩液；

[0041] (2)浓缩液用EtOH/H2O＝0:100,25:75,55:45,95:5(v:v)梯度洗脱，通过大孔吸附树脂吸附，在55％ EtOH组分干燥得棕红色固体粉末；

[0042] (3)将棕红色提取物溶解过滤后经CH2Cl2‑MeOH＝5:1‑0:1(v:v)梯度洗脱，经减压聚酰胺色谱快速将其分成4个粗馏分Fr.A‑D；

[0043] (4)将Fr.C通过MeOH:H2O＝70:30(v:v)浓度的凝胶柱色谱分离得到五个部分(Fr.C1‑C5)；

[0044] (5)Fr.C4通过MeOH:H2O＝20:80‑100:0(v:v)梯度洗脱，通过反相ODS柱色谱分离得到六个部分Fr.4‑1‑Fr.4‑6；

[0045] (6)将Fr.4‑2通过MeOH:H2O＝70:30(v:v)浓度的凝胶柱色谱分离得到四个部分Fr.4‑2‑1‑Fr.4‑2‑4；

[0046] (7)将Fr.4‑2‑2通过CH2Cl2‑MeOH＝5:1‑0:1(v:v)梯度洗脱，经硅胶H柱色谱分离得到化合物2；洗脱条件乙腈：水(20:80)(v:v)，HPLC制备得到14.7mg化合物2；

[0047] (8)Fr.4‑2‑3通过CH2Cl2‑MeOH＝5:1‑0:1(v:v)梯度洗脱，经硅胶柱色谱分离得到化合物1；洗脱条件甲醇：水(33:67)(v:v)，HPLC制备得到7.6mg化合物1；

[0048] 所得的化合物1‑2经过系统结构鉴定，结果如下(如附图1‑6)：

[0049] 化合物1：黄色粉末(MeOH)。10％硫酸香草醛试剂显色呈紫色。+
HR‑ESI‑MS给出431.0933[M+Na] (calcd.431.0949),确定其
分子式为C19H20O10，计算不饱和度为10。

[0050] 1H‑NMR(600MHz,DMSO‑d6)谱中，给出了4个芳香质子信号δH 7.65(1H,d,J＝8.4Hz),7.46(1H,s),6.97(1H,d,J＝2.0Hz),6.77(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz)；一组糖信号，糖端基质子信号δH 4.69(1H,d,J＝7.6Hz)，糖上6′位质子信号δH 3.77(1H,dd,J＝11.6,
1.5Hz),3.51(1H,dd,J＝11.6,6.2Hz)，化学位移在δH 3.36‑3.18之间的4个糖上质子信号，
1 13
H‑NMR谱中还给出1个甲氧基信号δH 3.99(3H,s)。C‑NMR(150MHz,DMSO‑d6)谱中给出了12个苯环碳信号δC 156.9,156.7,143.9,143.5,139.2,133.0,120.3,116.0,115.0,111.5,
102.5,98.3，结合氢谱中给出的信号及不饱和度计算，推测化合物为联苯类，且一个苯环为ABX取代，另一个苯环为五取代；一组β‑葡萄糖的碳信号δC 103.8,77.4,76.0,73.5,69.9,
60.8；此外还有一个甲氧基碳信号δC 60.4，结合不饱和度为10，推测该化合物还存在一个环状结构。

[0051] 在HMBC谱中，δH 7.65(H‑9)与δC 98.3(C‑6),156.9(C‑7),115.0(C‑8)存在相关，δH 6.97(H‑6)与δC 156.9(C‑7),115.0(C‑8),116.0(C‑9a)存在相关，δH 6.77(H‑8)与δC 156.7(C‑5a),98.3(C‑6),116.0(C‑9a)存在相关，确定了ABX取代苯环的碳信号及OH‑连接位置。
δH 7.46(H‑1)与δC 143.5(C‑2),139.2(C‑3),116.0(C‑9a)存在相关，δH 3.99(4‑OCH3)与δC 
133.0(C‑4)存在相关，δH 4.69(H‑1′)与δC 143.5(C‑2)存在相关，确定了五取代苯环的碳信号及取代基连接位置。碳氢信号的准确归属详见表1，通过以上分析确定了化合物1的平面结构。

[0052] 经过系统的文献检索，为一未报到的新化合物，系统命名为2,3,7‑trihydroxy‑4‑methox‑ydibenzofuran 3‑O‑β‑D‑glucopyranoside,俗名为crataegusnoside G。

[0053] 表1化合物1的核磁共振氢谱(600MHz)和碳谱(150MHz)数据(氘代二甲基亚砜)。1 13
Table 1  H‑NMR(600MHz)and  C‑NMR(150MHz)data of compound 1(DMSO‑d6).[0054]

[0055] 化合物2：无色油状(MeOH)，易溶于甲醇等溶剂。10％硫酸香草醛试剂显色呈暗橙+色。 HR‑ESI‑MS给出的395.1340[M+H] (calcd.395.1336),
确定其分子式为C19H22O9,计算不饱和度为9。

[0056] 1H‑NMR(600MHz,Methanol‑d4)谱中，给出了两组苯环上的质子信号，其中一组质子信号δH 7.08(1H,d,J＝1.8Hz),6.94(1H,d,J＝1.8Hz)，表明为1,3,4,5‑四取代苯环，另一组质子信号δH 7.26(1H,dd,J＝7.9,1.6Hz),7.10(1H,td,J＝7.9,1.6Hz),6.89(1H,dd,J＝8.0,1.4Hz),6.86(1H,dd,J＝8.0,1.4Hz)，说明为1,2‑二取代苯环。一组单糖信号，糖端基质子信号δH 4.84(1H,d,J＝7.7Hz)，糖上C‑6′位氢信号δH 3.72(1H,dd,J＝12.0,5.1Hz),
1
3.86(1H,dd,J＝12.0,2.4Hz)，化学位移在δH 3.38‑3.53之间的4个糖上质子信号，H‑NMR谱
13
中还给出1个氧甲基信号δH 3.87(3H,s)。C‑NMR(150MHz,Methanol‑d4)谱中给出了12个芳香碳信号δC 155.2,149.2,146.6,136.6,131.5,131.2,129.6,129.1,121.0,117.0,112.7,
109.7，一组β‑葡萄糖的碳信号δC 104.2,78.2,77.6,74.9,71.2,62.3；此外还有1个甲氧基碳信号δC 60.4，结合氢谱中给出的信号推测化合物应为联苯类，且连有两个‑OH，一个糖，一个甲氧基。

[0057] 在HMBC谱中，δH 7.08(H‑2)与δC 146.6(C‑3),136.6(C‑4),109.7(C‑6),129.6(C‑1′)存在相关，δH 6.94(H‑6)与δC 112.7(C‑2),136.6(C‑4),149.2(C‑5),129.6(C‑1′)存在相关，δH3.87与δC 149.2(C‑5)存在相关，糖的端基质子信号δH 4.84(H‑1″)与δC 146.6(C‑
3)存在相关，确定了1,3,4,5‑四取代苯环的碳信号及取代基连接位置。δH 7.10(H‑4′)与δC 
155.2(C‑2′),117.0(C‑3′),121.0(C‑5′),131.5(C‑6′)存在相关，δH 6.86(H‑3′)与δC 
129.6(C‑1′),155.2(C‑2′),121.0(C‑5′)存在相关，确定了1,2‑二取代苯环的碳信号及取代基连接位置。碳氢信号的准确归属详见表2，通过以上分析确定了化合物2的平面结构。

[0058] 经过系统的文献检索，为一未报到的新化合物，系统命名为2',4‑Dihydroxy‑5‑methoxy[1,1'‑biphenyl]‑3‑ylβ‑D‑glucopyranoside,俗名为crataegusnoside H。

[0059] 表2化合物2的核磁共振氢谱(600MHz)和碳谱(150MHz)数据(氘代甲醇)。Table 2 1 13
H‑NMR(600MHz)and  C‑NMR(150MHz)data of compound 2(Methanol‑d4).

[0060]

[0061]

[0062] 实施例2

[0063] 化合物1‑2对DPPH和ABTS自由基清除活性的筛选。

[0064] 材料与仪器：96孔板(Nest Biotech,USA)，酶标仪(Thermo,USA)，紫外分光光度计(UV‑2600i,Shimadzu,Japan)，电子天平(ML‑104,China)。

[0065] 试剂：DMSO(AR级,China)，维生素C(China)，DPPH(Tokyo Chemical Industry,+Japan)，ABTS(Tokyo Chemical Industry,Japan)。

[0066] 实验方法

[0067] 抗氧化活性实验包括清除DPPH自由基能力和清除ABTS+自由基能力两部分。

[0068] 一、清除DPPH自由基能力

[0069] (1)实验试剂的配制

[0070] 精确称取化合物于EP管中，加定量DMSO配置成10mM的样品液。

[0071] 1‰DMSO：取10μL DMSO于10mL的EP管中，加入9990mL的纯水

[0072] 100μM样品液：取10mM的样品液，用1‰DMSO配成100μM样品液。

[0073] DPPH溶液：精密称取7.9mg的DPPH粉末于15mL EP管中，加入10mL的无水乙醇，得到2mM的DPPH储备液。取1mL储备液于15mL EP管中，加9mL的无水乙醇，得到0.2mM的DPPH溶液，待用。4℃保存，现配现用。

[0074] (2)实验内容

[0075] 准确移取100μL浓度为100μM浓度的样品置于微孔板中，分别加入100μL的0.2mM的DPPH溶液，避光反应30min，在517nm下测其吸光度值(A1)。同时，准确移取100μL的样品和100μL无水乙醇，为样品本底组(A2)。空白对照(A0)为100μL的0.2mM的DPPH和100μL的无水乙醇。每个浓度做三组平行实验，清除率R(R＝DPPH自由基清除率,％)，计算公式为：R＝[A0‑(A1‑A2)]/A0×100％。

[0076] 表3DPPH抗氧化试验试剂加样量Table 3DPPH free radical scavenging test reagent added amount.

[0077]

[0078] 二、清除ABTS+自由基能力

[0079] (1)实验试剂的配制

[0080] 精确称取化合物于EP管中，加定量DMSO配置成10mM的样品液。

[0081] 1‰DMSO：取10μL DMSO于10mL的EP管中，加入9990mL的纯水

[0082] 100μM样品液：取10mM的样品液，用1‰DMSO配成100μM样品液。

[0083] 5个浓度的样品液：取10mM的样品液，加入1‰DMSO配制成200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM浓度的样品液。

[0084] ABTS+工作液：将经暗处理24h的体积比为1:1的混合液(7mM的ABTS+和2.5mM的+K2S2O8)稀释40～50倍，使其在734nm处吸光度为0.7±0.02，制成ABTS工作液。

[0085] (2)实验内容

[0086] 准确移取100μL浓度为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM浓度的样品置于微孔板+中，再分别加入100μL的ABTS工作液，避光反应30min,在734nm下测其吸光度值(A1)。同时，+
准确移取100μL的样品和100μL无水乙醇，为样品本底组(A2)。空白对照(A0)为100μL的ABTS+
工作液和100μL的无水乙醇。每个浓度做三组平行实验，清除率R(R＝ABTS 自由基清除率,％)，计算公式为：R＝[A0‑(A1‑A2)]/A0×100％。

[0087] 表4ABTS抗氧化试验试剂加样量Table 4ABTS free radical scavenging test reagent added amount.

[0088]

[0089] 三、实验结果与讨论

[0090] 将本发明所述山楂叶中化合物1‑2进行了在100μM浓度下进行DPPH和ABTS清除自由基活性初筛。DPPH清除自由基活性测试筛选：在100μM浓度下阳性药VC、化合物1和化合物2的抗氧化活性能力分别为50.3％、36.6％和61.4％。ABTS清除自由基活性测试筛选：在100μM浓度下阳性药VC、化合物1和化合物2的抗氧化活性能力分别为76.3％、74.3％和83.8％(图7)。

[0091] 进一步测试了化合物1和化合物2的在12.5‑200μM浓度下的DPPH和ABTS清除自由基活性。DPPH清除自由基活性测试结果显示，联苯类化合物1(IC50＝149.3±0.65μM)和化合物2(IC50＝54.9±0.95μM)具有良好的DPPH清除自由基活性，且活性均强于阳性对照药VC(IC50＝157.5±0.90μM)。ABTS清除自由基活性测试结果显示，联苯类化合物1(IC50＝16.5±1.42μM)和化合物2(IC50＝11.0±0.03μM)具有良好的ABTS清除自由基活性，且活性均强于阳性对照药VC(IC50＝17.1±1.05μM)。化合物展现出优越的抗氧化活性的效果，因此，本发明所述的联苯类化合物具有制备临床抗氧化药的前景(图7)。