芳樟醇的生物合成 [0001] 对相关申请的交叉引用 [0002] 本申请要求2022年2月22日提交的新加坡申请第10202201742V号的优先权权益，该新加坡申请的内容通过引用整体并入本文用于所有目的。 发明领域 [0003] 本发明涉及芳樟醇的生物合成。 [0004] 发明背景 [0005] 芳樟醇是花香单萜醇，且天然芳樟醇可见于许多花卉(例如薰衣草和玫瑰)或柑橘类水果中。天然芳樟醇以两种立体异构体的形式存在，即(S)‑芳樟醇和(R)‑芳樟醇，每种立体异构体都具有独特的气味和味道。重要的是，芳樟醇是商业上重要的芳香分子，广泛用于食品、饮料、化妆品和个人护理产品(例如香水、清洁剂、洗发水和洗剂等)中。芳樟醇还用作制造维生素E的起始原料。 [0006] 从天然植物组织中提取芳樟醇的产率很低。因此，目前供应的芳樟醇主要是通过化学合成产生的。然而，这种方法产生外消旋芳樟醇，不可持续、对环境不友好且不太受消费者青睐。许多研究人员正在探索芳樟醇的生物技术生产，但绝大多数都取得了有限的成功。此外，芳樟醇的生物合成只能产生对映体纯的芳樟醇，即(S)‑芳樟醇和(R)‑芳樟醇。因此，需要提供新型、绿色且有成本效益的合成芳樟醇的方法，所述方法克服或至少改善上述一个或更多个缺点。 [0007] 概述 [0008] 在一方面，本文提供了包含一个或更多个载体的宿主细胞，该载体包含编码以下基因的多核苷酸序列：a)甲羟戊酸途径基因；和b)芳樟醇途径基因，其中芳樟醇途径基因包含多于一个二磷酸合酶基因、异戊烯转移酶(prenyltransferase)基因或其组合，以及至少一个芳樟醇合酶基因。 [0009] 在另一方面，本文提供了产生芳樟醇的方法，包括在培养基中培养本文所描述的宿主细胞，其中培养基任选地包含诱导剂和至少一种碳底物(carbon substrate)。 [0010] 在另一方面，本文提供了用于产生芳樟醇的试剂盒，其中试剂盒包含本文所描述的宿主细胞和使用说明。 [0011] 定义 [0012] 本文所用的术语"单萜"或"类单萜"是通过各种单萜合酶由香叶基二磷酸产生的一类类异戊二烯。类单萜具有两个类异戊二烯单元。单萜是植物中的次级代谢产物，并且是精油、化妆品、食品调味品、清洁产品和药物的主要成分。它们促成植物的特定气味特征。单萜在工业上用作调味品成分、芳香成分和化妆品成分。此外，它们是若干调味化合物诸如香茅醇、香叶醇、薄荷醇和马鞭草烯醇的前体。 [0013] 本文所用的术语"甲羟戊酸途径"是指通过合成固醇类异戊二烯(例如胆固醇)和非固醇类异戊二烯(例如多萜醇、血红素‑A、异戊烯基tRNA和泛醌)，在多种细胞过程中发挥关键作用的细胞代谢途径。甲羟戊酸途径是首个公认的异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和二甲烯丙焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)生物合成途径，其包括将乙酰‑CoA转化为IPP的一系列六个酶促步骤。在甲羟戊酸途径的前两个步骤中，三个乙酰‑CoA分子缩合合成甲羟戊酸。乙酰乙酰‑CoA硫解酶和HMG‑CoA合酶(HMGS)催化缩合反应，形成羟甲基戊二酰‑CoA(HMG‑CoA)。此外，HMG‑CoA还原酶(HMGR)催化HMG‑CoA还原成甲羟戊酸。由此合成的甲羟戊酸经磷酸化和脱羧，形成IPP。磷酸化首先由甲羟戊酸激酶催化，然后在磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的作用下形成甲羟戊酸‑5‑焦磷酸。脱羧是最后一步，在这一步中，磷酸甲羟戊酸脱羧酶催化甲羟戊酸‑5‑焦磷酸的ATP依赖性脱羧，形成IPP。 IPP可以与DHNA相互作用形成AQ，或与异构酶相互作用，通过IPP异构酶(IDI)形成DMAPP。甲羟戊酸途径基因是指编码甲羟戊酸途径的酶的基因。 [0014] 本文所用的术语"芳樟醇途径"是指在芳樟醇合酶的催化下由前体香叶基二磷酸(GPP)合成芳樟醇。法尼基焦磷酸合酶催化甲羟戊酸途径中的IPP和DMAPP单元缩合，生成不同链长的异戊烯基二磷酸(prenyl diphosphate)中间体。IPP和DMAPP缩合产生香叶基二磷酸(GPP)，作为类单萜的前体。然后，芳樟醇合酶催化香叶基二磷酸转化成芳樟醇。芳樟醇途径基因是指编码芳樟醇途径的酶的基因。 [0015] 本文所用的术语"多肽"包括多肽、蛋白、肽、多肽片段和融合多肽。 [0016] 本文所用的"核酸"是指以单链或双链形式共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。 [0017] 本文所用的术语"可操作连接"是指核酸表达控制序列(例如启动子)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列调控对应于第二序列的核酸的转录。 [0018] 本文所用的术语"变体"是指DNA序列的修饰。DNA序列的修饰包括突变、截短、易位、取代、缺失和插入，从而导致基因活性的改变。 [0019] 本文所用的术语"启动子"是指启动基因转录的DNA区域。该DNA区域通常位于基因的转录起始位点附近和DNA的上游。启动子可以是诱导型启动子或非诱导型启动子。本文所用的术语"诱导型启动子"是指可以响应于特定刺激(也称为诱导剂)而被调控的启动子。启动子系统可以被修饰为诱导型的。诱导型启动子系统的实例包括Tet‑on系统、Tet‑off系统、T7系统、Trp系统、Tac系统、λcI857‑PL系统、细菌EL222系统和Lac系统。启动子也可以是组成型启动子，其是始终有活性的启动子。 [0020] 本文所用的术语"启动子工程化"是指对质粒中的每个操纵子或单个基因使用不同的启动子，以优化基因表达的水平。 [0021] 本文所用的术语"核糖体结合位点"在本申请的上下文中是指mRNA分子中募集并结合核糖体的位点，从而允许在翻译起始过程中选择适当的起始密码子。核糖体结合位点控制mRNA翻译起始的准确性和效率。 [0022] 本文所用的术语"通过核糖体结合位点(RBS)工程化滴定"是指使用由具有不同翻译速率的RBS组成的合成RBS文库来改变RBS，以调节生物合成途径中基因的表达。 [0023] 本文所用的术语"接头"是指在重组蛋白或融合蛋白中分隔多个结构域的短氨基酸序列。接头的作用是阻止离散的结构域之间的不期望的相互作用。然而，存在富含Gly的柔性接头，其连接单个蛋白中的各种结构域，而不会干扰每个结构域的功能。富含Gly的接头还可有助于在蛋白之间创建共价连接，以形成稳定的蛋白‑蛋白复合物。接头的长度从2‑ 31个氨基酸不等，根据每种条件进行优化，使得接头不会对所连接的对象的构象或相互作用施加任何限制。 [0024] 本文所用的术语"缺乏"在基因或蛋白表达的上下文中是指基因或蛋白的表达水平相对于基因或蛋白的基线表达水平的降低。在基因或蛋白表达的上下文中的缺乏也可以指在基因或蛋白本应表达的情况下基因或蛋白不表达。基因或蛋白的基线表达应理解为意指未突变基因或野生型基因的表达水平，或在基因或蛋白本应表达的情况下，基因或蛋白的表达水平。 [0025] 本文所用的术语"约"，用于成分浓度和化合物百分比的上下文中，但不限于此，通常是指所述及的值的+/‑10％、所述及的值的+/‑9％、所述及的值的+/‑8％、所述及的值的+/‑7％、所述及的值的+/‑6％、所述及的值的+/‑5％、所述及的值的+/‑4％，更通常是所述及的值的+/‑3％，更通常是所述及的值的+/‑2％，甚至更通常是所述及的值的+/‑1％，且甚至更通常是所述及的值的+/‑0.5％。在整个本公开内容中，某些实施方案可能以范围形式公开。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应理解为对所公开范围的僵化限制。因此，对范围的描述应视为已具体披露了该范围内所有可能的子范围以及个体数值。例如，对诸如1‑6的范围的描述应视为已具体公开了诸如1‑3、1‑4、1‑5、2‑4、2‑6、3‑ 6等的子范围以及该范围内的个体数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围有多宽，这都适用。 [0026] 附图简述 [0027] 结合非限制性实例和附图，参考详述，将更好地理解本发明，在附图中： [0028] 图1描述了通过优化代谢途径产生芳樟醇(滴度、OD600和比产率(specific yield))。通过改变用于甲羟戊酸途径的启动子强度，测试了九种构建体。 [0029] 图2显示了通过优化诱导的芳樟醇产生和生物质。图2A显示了诱导时间。图2B显示IPTG浓度的优化。图2C显示乳糖浓度的优化。 [0030] 图3示出工程化GPP合酶(GPPS)和芳樟醇合酶以提高芳樟醇产率。图3A显示了工程化方案(蛋白融合、截短和途径再设计)。图3B描述了使用截短的ApLS和ispA与ApLS融合物的不同构建体的芳樟醇产生。图3C描绘了另外的GPPS，AgGPPS的补充。 [0031] 图4描绘了各种培养基的比较以及通过优化碳底物提高芳樟醇滴度。图4A显示了三种培养基中的芳樟醇产生：2xPY、TB和确定成分培养基(defined medium)。图4B显示了对碳源浓度的优化。 [0032] 图5是所有策略的总结。产率定义为所产生的芳樟醇与培养基中提供的总碳之比。 [0033] 图6描绘了所用sps004质粒图谱的实例 [0034] 图7描绘了所用ApLS‑ispA_S80F‑AgGPPS质粒图谱的实例。 [0035] 发明详述 [0036] 在第一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含一个或更多个载体，该载体包含编码以下基因的多核苷酸序列：a)甲羟戊酸途径基因；和b)芳樟醇途径基因，其中芳樟醇途径基因包括多于一个二磷酸合酶基因、异戊烯转移酶或其组合，以及至少一个芳樟醇合酶基因。 [0037] 甲羟戊酸途径基因和芳樟醇途径基因可以在宿主细胞内的一个或更多个载体上编码。例如，甲羟戊酸途径基因和芳樟醇途径基因可以在一个载体、两个载体、三个载体、四个载体、五个载体或六个载体上编码。本领域技术人员应当认识到，甲羟戊酸途径基因和芳樟醇途径基因可以以不同的组合位于一个或更多个载体中。在一个实例中，甲羟戊酸途径基因可以在一个载体上编码，并且芳樟醇途径基因可以在另一个载体上编码。在另一个实例中，甲羟戊酸途径基因可以在两个载体上编码，并且芳樟醇途径基因中的一个或更多个基因可以在另一个载体上编码。在另一个实例中，芳樟醇途径基因可以在两个载体上编码，并且甲羟戊酸途径基因可以在另一个载体上编码。本领域技术人员还应当认识到，如果一个途径存在多于一个基因，则这些基因可以与另一途径的一个或更多个基因组合地在单独的载体上编码。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。 [0038] 甲羟戊酸途径基因可以由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码，且芳樟醇途径基因可以由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码。一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个甲羟戊酸途径基因和两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个芳樟醇途径基因。本领域技术人员应当认识到，一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以以不同的组合编码甲羟戊酸途径基因和芳樟醇途径基因。在一个实例中，宿主细胞可以包含一个载体，其中载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个甲羟戊酸途径基因和两个芳樟醇途径基因。在另一个实例中，宿主细胞可以包含两个载体，其中第一载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个甲羟戊酸途径基因，且第二载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个芳樟醇途径基因。在另一个实例中，宿主细胞可以包含一个载体，其中载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码三个甲羟戊酸途径基因和三个芳樟醇途径基因。在另一个实例中，宿主细胞可以包含两个载体，其中第一载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个甲羟戊酸途径基因，且第二载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码三个芳樟醇途径基因。在另一个实例中，宿主细胞可以包含两个载体，其中第一载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个甲羟戊酸途径基因和两个芳樟醇途径基因，且第二载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码一个甲羟戊酸途径基因和一个芳樟醇途径基因。在另一个实例中，宿主细胞可以包含三个载体，其中第一载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个甲羟戊酸途径基因，第二载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码两个芳樟醇途径基因，且第三载体上的一个或更多个多核苷酸序列可以编码三个甲羟戊酸途径基因。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，而且不同的组合是可以接受的。在一些实例中，可以将两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个芳樟醇途径基因和两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个甲羟戊酸基因插入宿主细胞的基因组中。本领域技术人员应当理解，将芳樟醇途径基因和甲羟戊酸途径基因插入宿主基因组中是指，将外源基因定向且稳定地插入宿主基因组中，从而允许稳定的基因表达。芳樟醇途径基因和甲羟戊酸途径基因可以使用基因组修饰方法(包括但不限于CRISPR‑Cas9、TALEN介导的基因敲入)插入宿主细胞的基因组中。 [0039] 通常，应当理解的是，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个芳樟醇途径基因和两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个甲羟戊酸途径基因可以由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码，或可以插入宿主细胞的基因组中，或者可以由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码并插入宿主细胞的基因组中。 [0040] 在一个实例中，宿主细胞可以包含一个或更多个载体，其中a)甲羟戊酸途径基因由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码；和b)芳樟醇途径基因由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码。 [0041] 在一个实例中，宿主细胞可以包含插入宿主细胞基因组中的甲羟戊酸途径基因和芳樟醇途径基因。 [0042] 在一个实例中，宿主细胞可以包含一个或更多个载体，其中a)甲羟戊酸途径基因由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码；和b)芳樟醇途径基因插入宿主细胞的基因组中。 [0043] 在一些实例中，甲羟戊酸途径基因分离自细菌或酵母。在一个实例中，甲羟戊酸途径基因可以分离自选自由以下组成的组的细菌：大肠杆菌(Escherichia coli)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、未培养海洋细菌HF10_19P19、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)以及短波单胞菌属的种(Brevundimonas sp.)。在一个实例中，甲羟戊酸途径基因可以分离自选自由以下组成的组的酵母：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、假丝酵母属(Candida)以及毕赤酵母属(Pichia)。 [0044] 甲羟戊酸途径基因包括但不限于HMG‑CoA合酶(hmgS)、乙酰乙酰‑CoA硫解酶(atoB)、HMG‑CoA还原酶(hmgR)、甲羟戊酸激酶(mevK)、磷酸甲羟戊酸激酶(pmK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(pmd)、(异戊烯二磷酸)IPP异构酶(idi)、异戊烯磷酸激酶、甲羟戊酸3‑磷酸激酶、胆碱激酶和酸性磷酸酶。 [0045] 在一个实例中，甲羟戊酸途径基因可以选自HMG‑CoA合酶(hmgS)、乙酰乙酰‑CoA硫解酶(atoB)、HMG‑CoA还原酶(hmgR)、甲羟戊酸激酶(mevK)、磷酸甲羟戊酸激酶(pmK)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(pmd)、(异戊烯二磷酸)IPP异构酶(idi)或其组合。 [0046] 本领域技术人员应当认识到，甲羟戊酸途径基因可以以各种组合的形式由一个或更多个载体上的一个或更多个多核苷酸序列编码。例如，编码atoB、hmgS、hmgR、mevK、pmK、pmd和idi的一个或更多个多核苷酸序列位于一个载体上。在另一个实例中，编码atoB的多核苷酸序列位于一个载体上，而编码hmgS、hmgR、mevK、pmK、pmd和idi的一个或更多个多核苷酸序列位于第二载体上。在另一个实例中，编码atoB和hmgS的一个或更多个多核苷酸序列位于一个载体上，而编码hmgR、mevK、pmK、pmd和idi的一个或更多个多核苷酸序列位于第二载体上。通常应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。 [0047] 在一个实例中，编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS、hmgR、mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列位于一个载体上。 [0048] 在一个实例中，编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS、hmgR基因的多核苷酸序列位于第一载体上，而编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列位于第二载体上。 [0049] 在一个实例中，编码atoB基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:1。在一个实例中，编码hmgS基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:2。在一个实例中，编码mevK基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:3。在一个实例中，编码pmK基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:4。在一个实例中，编码pmd基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:5。在一个实例中，编码idi基因的多核苷酸序列是SEQ ID NO:6。 [0050] 在一些实例中，甲羟戊酸途径基因可以被修饰。对一个或更多个基因的修饰可以包括突变、截短、易位、取代、缺失和插入，或经翻译的基因的翻译后修饰。基因可以被修饰以提高表达水平，翻译的蛋白的翻译后修饰或这些修饰中任何修饰的组合。 [0051] 在一个实例中，hmgR基因是被截短的。本领域技术人员应当认识到，术语"截短"是指通过操作结构基因消除蛋白的N端或C端部分，或由于无义突变导致结构基因中存在终止密码子而过早终止蛋白的延伸。在一个实例中，编码截短的hmgR的多核苷酸序列是SEQ ID NO:7，且截短的hmgR的多肽序列是SEQ ID NO:8。 [0052] 在一些实例中，甲羟戊酸途径基因可以仅是野生型基因、仅是突变基因或其组合。 例如，宿主细胞可以表达野生型atoB、hmgS、hmgR、mevK、pmK、pmd和idi。在另一个实例中，宿主细胞可以表达突变的atoB、hmgS、hmgR、mevK、pmK、pmd和idi。在又一个实例中，宿主细胞可以表达野生型atoB、hmgS、mevK、pmK、pmd、idi和突变的hmgR。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。在优选的实例中，宿主细胞表达野生型atoB、hmgS、mevK、pmK、pmd、idi和截短的hmgR。 [0053] 在一些实例中，芳樟醇途径基因分离自真核生物或原核生物或其组合。真核生物可以是真菌或植物。原核生物可以是细菌。在一些实例中，芳樟醇途径基因可以分离自包括但不限于以下的植物：狭叶薰衣草(Lavandula angustifolia)、水薄荷(Mentha aquatica)、樟树(Cinnamomum camphora)、玉米(Zea mays)、小果咖啡(Coffea arabica)、砂仁(Wurfbainia villosa)、沼生菰(Zizania palustris)、姜(Zingiber officinale)、葡萄(Vitis vinifera)、豇豆(Vigna unguiculata)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu)、千叶蓍千叶亚种(Achillea millefolium subsp.millefolium)、软枣猕猴桃(Actinidia arguta)、葛枣猕猴桃(Actinidia polygama)、节节麦(Aegilops tauschii)、合欢(Albizia julibrissin)、无油樟(Amborella trichopoda)、凤梨具苞片变种(Ananas comosus var.bracteatus)、变色耧斗菜(Aquilegia coerulea)、黄花蒿(Artemisia annua)、铁皮石斛(Dendrobium catenatum)、地三叶(Trifolium subterraneum)、异色山黄麻(Trema orientale)、小麦(Triticum aestivum)、水青树(Tetracentron sinense)、除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)、柠檬香桃叶(Backhousia citriodora)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、油菜(Brassica campestris)、木豆(Cajanus cajan)、怒江山茶(Camellia saluenensis)、茶(Camellia sinensis)、Cannabis sativa、淡红荠(Capsella rubella)、樟树(Cinnamomum camphora)、沉水樟(Cinnamomum micranthum f.kanehirae)、土肉桂(Cinnamomum osmophloeum)、蜜柑(Citrus unshiu)、Clarkia concinna、长蒴黄麻(Corchorus olitorius)、芫荽(Coriandrum sativum)、独脚金(Striga asiatica)、Spirodela intermedia、水果鼠尾草(Salvia dorisiana)、簸箕柳(Salix suchowensis)、玫瑰(Rosa rugosa)、月季(Rosa chinensis)、杜鹃(Rhododendron simsii)、Rhodamnia argentea、萝卜(Raphanus sativus)、秋子梨x西洋梨(Pyrus ussuriensis x Pyrus communis)、Dichanthelium oligosanthes、马唐(Digitaria exilis)、吉野樱裸花变种(Prunus yedoensis var.nudiflora)、桃(Prunus persica)、扁桃(Prunus dulcis)、无花果(Ficus carica)、小苍兰属杂交品种(Freesia hybrid cultivar)、野大豆(Glycine soja)、Handroanthus impetiginosus、姜花(Hedychium coronarium)、橡胶树(Hevea brasiliensis)、薰衣草(Lavandula angustifolia)、宽叶薰衣草(Lavandula latifolia)、Lavandula x intermedia、Leersia perrieri、Magnolia champaca、苹果(Malus domestica)、美洲黑杨(Populus deltoides)、北美云杉(Picea sitchensis)、白云杉(Picea glauca)、欧洲云杉(Picea abies)、Microthlaspi erraticum、薇甘菊(Mikania micrantha)、南荻(Miscanthus lutarioriparius)、杨梅(Morella rubra)、川桑(Morus notabilis)、刺毛黧豆(Mucuna pruriens)、罗勒(Ocimum basilicum)、扭刺仙人掌(Opuntia streptacantha)、Phyla dulcis、粗毛紫苏(Perilla frutescens var.hirtella)、Parasponia andersonii、柳枝稷(Panicum virgatum)、金桂(Osmanthus fragrans var.thunbergii)、粳稻(Oryza sativa subsp.Japonica)、斑点稻(Oryza punctata)、疣粒稻(Oryza meyeriana var.granulate)以及短花稻(Oryza brachyantha)。在其他实例中，芳樟醇途径基因可以分离自包括但不限于以下的真菌：平田头菇(Agrocybe pediades)、纹缘盔孢伞(Galerina marginate)、砖红韧伞(Hypholoma sublateritium)、Hebeloma cylindrosporum、松乳菇(Lactarius deliciosus)、光盖裸盖菇(Psilocybe cyanescens)、簇生黄韧伞(Hypholoma fasciculare)、盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)、热焦曲霉(Aspergillus calidoustus)、小麦秆锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、松杨栅锈菌(Melampsora larici‑populina)、多头绒泡菌(Physarum polycephalum)、Paxillus rubicundulus以及Postia placenta。在又其他实例中，芳樟醇途径基因可以分离自包括但不限于以下的细菌：大肠杆菌、甲烷丝菌属的种(Methanothrix sp)、海洋螺菌目细菌(Oceanospirillales bacterium)、油螺旋菌属的种(Oleispira sp.)以及棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。 [0054] 芳樟醇途径基因包括但不限于芳樟醇合酶(LIS或LS)、IspA、g9127、Psicya1、Psicya2和QDF59315。芳樟醇途径基因还可以包括二磷酸合酶和异戊烯转移酶。宿主细胞中芳樟醇途径的多于一个二磷酸合酶基因、异戊烯转移酶基因或二磷酸合酶和异戊烯转移酶基因的组合包括但不限于香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、法尼基二磷酸合酶(FPPS)或其组合。 [0055] 在一些实例中，芳樟醇途径基因可以被修饰。修饰可以包括突变、截短、易位、取代、缺失和插入，或经翻译的基因的翻译后修饰。基因可以被修饰以提高表达水平，翻译的蛋白的翻译后修饰，或这些修饰中任何修饰的组合。 [0056] 在一个实例中，芳樟醇合酶基因分离自平田头菇(ApLS)。在其他实例中，芳樟醇合酶基因是被截短的。本领域技术人员应当认识到，术语"截短"是指通过操作结构基因消除蛋白的N端或C端部分，由于无义突变导致结构基因中存在终止密码子而过早终止蛋白的延伸或蛋白水解。在一个实例中，ApLS是在C端被截短的。在另一个实例中，ApLS C端的前10或 19个氨基酸被截短，且截短的ApLS包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的多核苷酸序列。 在另一个实例中，截短的ApLS包含SEQ ID NO:11所示的多肽序列。 [0057] 在一些实例中，多于一个GPPS可以分离自原核生物或真核生物或原核生物和真核生物的组合。真核生物可以是真菌或植物。原核生物可以是细菌。在一些实例中，多于一个GPPS可以分离自真菌，所述真菌包括但不限于Neocamarosporium betae、Phomopsis amygdali和Zymoseptoria tritici。在其他实例中，多于一个GPPS可以分离自植物，所述植物包括但不限于辣薄荷(Mentha piperita)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大冷杉(Abies grandis)、金鱼草(Antirrhimum majus)和仙女扇(Clarkia breweri)。在又其他实例中，多于一个GPPS可以分离自细菌，所述细菌包括但不限于大肠杆菌、茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)和雪白链霉菌(Streptomyces niveus)。本领域技术人员应当认识到，多于一个GPPS可以分离自同一来源或不同来源的组合。多于一个GPPS可以分离自单个原核生物或不同原核生物。例如，多于一个GPPS可以仅分离自大肠杆菌。在另一个实例中，多于一个GPPS可以分离自大肠杆菌和茂原链霉菌。多于一个GPPS可以分离自单个真核生物或不同真核生物。例如，多于一个GPPS可以仅分离自大冷杉。在另一个实例中，多于一个GPPS可以分离自大冷杉和拟南芥。多于一个GPPS也可以分离自原核生物和真核生物的组合。例如，多于一个GPPS可以分离自大肠杆菌和大冷杉。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。在优选的实例中，GPPS分离自大肠杆菌或大冷杉(AgGPPS)或大肠杆菌和大冷杉的组合。 [0058] 在一些实例中，多于一个GPPS基因分离自大肠杆菌，并且可以是法尼基焦磷酸合酶。在一个实例中，法尼基焦磷酸合酶可以是但不限于IspA。 [0059] 分离自大肠杆菌的GPPS基因可以是在一个或更多个氨基酸位置处发生突变的法S80F 尼基焦磷酸合酶。在一个实例中，突变的GPPS是IspA 。 [0060] 在一个实例中，IspAS80F包含SEQ ID NO.12所示的多肽序列。 [0061] 在一些实例中，多于一个GPPS基因分离自大冷杉(AgGPPS)。AgGPPS可以是在N端被截短的。 [0062] 在一些实例中，AgGPPS在氨基酸位置2‑86之间被截短。在一个实例中，AgGPPS可以从氨基酸位置2至10被截短。在另一个实例中，AgGPPS可以从氨基酸位置2至20被截短。在另一个实例中，AgGPPS可以从氨基酸位置2至50被截短。在另一个实例中，AgGPPS可以从氨基酸位置2至70被截短。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。在优选的实例中，AgGPPS从氨基酸位置2至86被截短。 [0063] 在一个实例中，截短的AgGPPS包含SEQ ID NO:13所示的多肽序列。 [0064] 在一些实例中，芳樟醇途径基因可以仅是野生型基因、仅是突变的基因或其组合。 例如，宿主细胞可以表达野生型ApLS、ispA和AgGPPS。在另一个实例中，宿主细胞可以表达突变的ApLS、ispA和AgGPPS。在又另一个实例中，宿主细胞可以表达野生型ApLS、突变的ispA和AgGPPS。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。在优选的实例中，宿主细胞表达野生型ApLS、突变的ispA和截短的AgGPPS。 [0065] 在一些实例中，编码ApLS基因、IspAS80F基因和截短的AgGPPS基因的多核苷酸序列可以位于一个或更多个载体上，插入宿主细胞的基因组中或其组合。在一个实例中，编码S80F ApLS基因和IspA 基因的多核苷酸序列可以位于一个或更多个载体上，且芳樟醇途径的截短的AgGPPS基因插入宿主细胞的基因组中。在另一个实例中，编码芳樟醇途径的ApLS基S80F 因、IspA 和截短的AgGPPS基因的多核苷酸序列插入宿主细胞的基因组中。在优选的实例S80F 中，编码芳樟醇途径的ApLS基因、IspA 基因和截短的AgGPPS基因的多核苷酸序列位于一个载体上。通常可以理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。 [0066] 在一个实例中，宿主细胞包含： [0067] a)第一载体，所述第一载体包含编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS和截短的hmgR基因的多核苷酸序列； [0068] b)第二载体，所述第二载体包含编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列； [0069] c)第三载体，所述第三载体包含编码芳樟醇途径的ApLS基因、IspAS80F基因和截短的AgGPPS基因的多核苷酸序列。 [0070] 一个或更多个载体的每个载体中的多核苷酸序列应理解为与启动子可操作地连接。通常，应当理解的是，可以使用允许多核苷酸序列表达的任何启动子。启动子的实例包括但不限于T7 RNA聚合酶启动子、lac启动子、araBAD启动子、tac启动子、λcI857‑PL启动子和T5启动子。 [0071] 在一些实例中，启动子可以是诱导型启动子。在一个实例中，启动子可以是天然诱导型的。在一个实例中，启动子被工程化为诱导型的。应当认识到，可以使用任何合适的诱导型启动子系统。诱导型启动子系统可通过诱导剂或刺激(包括但不限于化学诱导剂、光或热)诱导。 [0072] 在一个实例中，一个或更多个载体中的多核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接，且其他载体中的多核苷酸序列与非诱导型启动子可操作地连接。例如，每个载体中的多核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接。在另一个实例中，两个载体中的多核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接，且其他载体中的多核苷酸序列与非诱导型启动子可操作地连接。 [0073] 在一个实例中，每个载体中的多核苷酸序列都与诱导型启动子可以操作地连接。 在一个实例中，诱导型启动子是野生型T7 RNA聚合酶启动子或野生型T7 RNA聚合酶启动子的变体。野生型T7 RNA聚合酶启动子的变体可以经由野生型启动子的突变生成。在另一个实例中，T7 RNA聚合酶启动子变体选自由TM1、TM2、TM3、TV1、TV2、TV3和TV4组成的组。在一个实例中，编码野生型T7 RNA聚合酶启动子的多核苷酸序列是SEQ ID NO:14。在一个实例中，编码TM1启动子的多核苷酸是SEQ ID NO:15。在一个实例中，编码TM2启动子的多核苷酸是SEQ ID NO:16。在一个实例中，编码TM3启动子的多核苷酸是SEQ ID NO:17。在一个实例中，编码TV1启动子的多核苷酸序列是SEQ ID NO:18。在一个实例中，编码TV2启动子的多核苷酸序列是SEQ ID NO:19。在一个实例中，编码TV3启动子的多核苷酸序列是SEQ ID NO: 20。在一个实例中，编码TV4启动子的多核苷酸序列是SEQ ID NO:21。 [0074] 每个载体中的诱导型启动子可以独立地选自野生型T7 RNA聚合酶启动子或变体。 野生型T7 RNA聚合酶启动子的变体可以包含具有至少一个突变的多核苷酸序列。变体T7 RNA聚合酶启动子的多核苷酸序列可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个突变。在一些实例中，变体T7 RNA聚合酶启动子的多核苷酸序列可以是SEQ ID NO:22中所示的taatacgactcX1X2X3X4X5X6ggggaattgtgagc，其中‘X1‑X6’可以代表任何核苷酸。通常，应当理解的是，T7 RNA聚合酶启动子的突变的多核苷酸序列的不同组合是可以接受的。 [0075] 在一个实例中，每个载体中的诱导型启动子可以是野生型T7 RNA聚合酶启动子。 在另一个实例中，每个载体中的诱导型启动子可以是相同的T7RNA聚合酶启动子变体。在又另一个实例中，每个载体中的诱导型启动子可以是不同的野生型T7 RNA聚合酶启动子和变体或其组合。通常，应当理解的是，除了本文提供的实例外，本发明的每个载体还可以使用诱导型启动子的不同组合。 [0076] 在一些实例中，与编码甲羟戊酸途径基因的多核苷酸序列、编码芳樟醇途径基因的多核苷酸序列或编码甲羟戊酸途径基因的多核苷酸序列和编码芳樟醇途径基因的多核苷酸序列可操作地连接的一个或更多个诱导型启动子，被工程化以平衡甲羟戊酸途径、芳樟醇途径或甲羟戊酸途径和芳樟醇途径。 [0077] 在一个实例中，第一载体可以包含：a)与第一诱导型启动子可操作地连接的编码甲羟戊酸途径的hmgS、atoB、hmgR基因的多核苷酸序列；和b)与第二诱导型启动子可操作地连接的编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列。 [0078] 在一个实例中，本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS和截短的hmgR基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM1，且本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM1。在一个实例中，本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS和截短的hmgR基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM1，且本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM2。在一个实例中，本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS和截短的hmgR基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM3，且本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM2。在一个优选的实例中，本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的atoB、hmgS和截短的hmgR基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM2，且本文所描述的宿主细胞中包含编码甲羟戊酸途径的mevK、pmK、pmd和idi基因的多核苷酸序列的第一载体中的诱导型启动子是TM1。通常，应当理解的是，除了本文提供的实例外，本发明的每个载体可以使用诱导型启动子的不同组合。 [0079] 在一些实例中，宿主细胞的基因通过RBS工程化来滴定。本文所描述的宿主细胞中的一个或更多个载体还可以包含编码核糖体结合位点(RBS)的多核苷酸序列。宿主细胞中的每个载体还可以包含编码RBS的多核苷酸序列，或一些载体还可以包含编码RBS的多核苷酸序列，而其他载体则不包含编码RBS的多核苷酸序列。例如，第一载体和第二载体中的每一个还可以包含编码RBS的多核苷酸序列。在另一个实例中，第一载体可以包含编码RBS的多核苷酸序列，而第二载体不包含编码RBS的多核苷酸序列。在优选的实例中，编码RBS的多核苷酸序列位于编码芳樟醇途径基因的载体上，其中芳樟醇途径基因包含多于一个GPPS。 [0080] 本领域技术人员应当认识到，编码RBS的序列可以针对RBS相对于待翻译的多核苷酸序列的翻译效率和强度进行优化。RBS的优化通常应理解为涉及RBS的多核苷酸序列的修饰。RBS可以通过一个或更多个核苷酸碱基的取代、缺失、插入或其组合来修饰。RBS可以使用简并寡核苷酸碱基来修饰。 [0081] 可以合成编码RBS的多核苷酸序列，并将其插入位于一个或更多个载体中的基因的上游。例如，可以合成RBS，并将其插入两个载体中的基因的上游。在另一个实例中，可以合成编码RBS的多核苷酸序列，并将其插入一个载体中的基因的上游。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举，并且不同的组合是可以接受的。 [0082] 在一些实例中，RBS可以包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的多核苷酸序列。在优选的实例中，RBS包含SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24的多核苷酸序列。 [0083] 在一个实例中，编码分离自大肠杆菌的GPPS的RBS的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:23，且编码AgGPPS的RBS的多核苷酸序列包含SEQ ID NO:24。 [0084] 在一些实例中，宿主细胞可以缺乏参与氨基酸降解的至少一个基因。宿主细胞可以缺乏参与氨基酸降解的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个基因。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举。 [0085] 参与氨基酸降解的基因可以是但不限于tnaA。 [0086] 宿主细胞可以使用基因组修饰方法被修饰为缺乏参与氨基酸降解的至少一个基因。可以使用基因组修饰方法，包括但不限于siRNA敲低和shRNA敲低，降低基因表达水平。 可以使用基因组修饰方法，包括但不限于CRISPR‑Cas9、FRT基因缺失、TALEN介导的基因敲除，使宿主细胞的基因组缺失至少一个基因。 [0087] 如本文所描述的，本发明的宿主细胞可以是细菌细胞。细菌细胞可以是但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、副球菌属(Paracoccus)、链霉菌属(Streptomyces)和聚球藻菌属(Synechococcus)。在优选的实例中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。通常，应当理解的是，任何工业细菌或细菌细胞都可以用于本发明。 [0088] 大肠杆菌细胞的菌株可以是但不限于BL21 DE3菌株、K‑12(RV308)、K‑12(HMS174)、K‑12亚株MG1655、W菌株(ATCC 9637)、JM109(DE3)、BW25113、JM109 DE3、Mach1、DH10B、JM109和任何工业菌株。在优选的实例中，大肠杆菌细胞是BL21 DE3菌株。 [0089] 在另一方面，本发明涉及产生芳樟醇的方法，包括在培养基中培养本文所描述的宿主细胞。可以在合适的培养容器(包括但不限于试管、烧瓶或生物反应器)中培养宿主细胞。 [0090] 芳樟醇产生方法还可以包括从培养基中分离芳樟醇的步骤。 [0091] 方法包括在培养基中培养本文所描述的宿主细胞。培养基可以包含但不限于TB培养基和2XPY培养基中的组分。还可以向培养基中添加另外的组分，并且所述另外的组分包括抗生素、诱导剂和碳底物。 [0092] 可以在培养过程开始时，在培养基中补充抗生素。可以在整个培养过程中持续添加抗生素。可以使用的抗生素的实例包括但不限于卡那霉素、壮观霉素、氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、库马霉素、庆大霉素和四环素。在优选的实例中，抗生素是卡那霉素或壮观霉素。 [0093] 可以用能够诱导诱导型启动子的一种或更多种诱导剂进一步补充培养基。可以在培养过程开始时，将诱导剂添加到培养基中。当宿主细胞生长到一定光密度时，可以用诱导剂补充培养基。在整个培养过程中，可以向培养基持续补充诱导剂。在另一个实例中，可以在适于诱导诱导型启动子的条件下培养宿主细胞。 [0094] 诱导剂的实例包括但不限于半乳糖、乳糖或异丙基β‑D‑1硫代半乳糖苷(IPTG)。在优选的实例中，诱导剂是乳糖或IPTG。 [0095] IPTG的浓度可以为约0.01mM至约0.3mM。例如，IPTG的浓度可以为约0.01mM、约 0.02mM、约0.03mM、约0.04mM、约0.05mM、约0.06mM、约0.07mM、约0.08mM、约0.09mM、约 0.10mM、约0.11mM、约0.12mM、约0.13mM、约0.14mM、约0.15mM、约0.16mM、约0.17mM、约 0.18mM、约0.19mM、约0.20mM、约0.21mM、约0.22mM、约0.23mM、约0.24mM、约0.25mM、约 0.26mM、约0.27mM、约0.28mM、约0.29mM、约0.30mM。在优选的实例中，IPTG的浓度为约 0.20mM。 [0096] 当宿主细胞生长到光密度(OD600)为约1至约5时，可以向试管或烧瓶内的培养基中补充诱导剂。光密度可以为约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5和约 5.0。在优选的实例中，OD600为约2.0。 [0097] 当宿主细胞生长到光密度(OD600)为约20至约60时，可以向生物反应器内的分批进料发酵培养基中补充诱导剂。光密度可以为约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55和约60。 [0098] 培养基还可以包含至少一种碳底物，其可以是但不限于葡萄糖、甘油、乳糖和蔗糖。本领域技术人员应当理解，培养基可以含有单一类型的碳底物或碳底物的组合。在优选的实例中，培养基包含乳糖、葡萄糖和甘油。 [0099] 碳底物的浓度可以为约1g/L至约50g/L。例如，碳底物的浓度可以为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约 13g/L、约14g/L、约15g/L、约16g/L、约17g/L、约18g/L、约19g/L、约20g/L、约21g/L、约22g/L、约23g/L、约24g/L、约25g/L、约26g/L、约27g/L、约28g/L、约29g/L、约30g/L、约31g/L、约 32g/L、约33g/L、约34g/L、约35g/L、约36g/L、约37g/L、约38g/L、约39g/L、约40g/L、约41g/L、约42g/L、约43g/L、约44g/L、约45g/L、约46g/L、约47g/L、约48g/L、约49g/L和约50g/L。 [0100] 乳糖的浓度可以为约5mM至约80mM。例如，乳糖的浓度可以为约5mM、约10mM、约 15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约 70mM、约75mM和约80mM。在优选的实例中，乳糖的浓度为约40mM。 [0101] 葡萄糖的浓度可以为约1g/L至约50g/L。例如，葡萄糖的浓度可以为约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约 13g/L、约14g/L、约15g/L、约16g/L、约17g/L、约18g/L、约19g/L、约20g/L、约21g/L、约22g/L、约23g/L、约24g/L、约25g/L、约26g/L、约27g/L、约28g/L、约29g/L、约30g/L、约31g/L、约 32g/L、约33g/L、约34g/L、约35g/L、约36g/L、约37g/L、约38g/L、约39g/L、约40g/L、约41g/L、约42g/L、约43g/L、约44g/L、约45g/L、约46g/L、约47g/L、约48g/L、约49g/L和约50g/L。在优选的实例中，葡萄糖的浓度为约3g/L。 [0102] 甘油的浓度可以为约1g/L至约50g/L。例如，甘油的浓度可以为约1g/L、约2g/L、约 3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L、约11g/L、约12g/L、约13g/L、约14g/L、约15g/L、约16g/L、约17g/L、约18g/L、约19g/L、约20g/L、约21g/L、约22g/L、约 23g/L、约24g/L、约25g/L、约26g/L、约27g/L、约28g/L、约29g/L、约30g/L、约31g/L、约32g/L、约33g/L、约34g/L、约35g/L、约36g/L、约37g/L、约38g/L、约39g/L、约40g/L、约41g/L、约 42g/L、约43g/L、约44g/L、约45g/L、约46g/L、约47g/L、约48g/L、约49g/L和约50g/L。在优选的实例中，甘油的浓度为约12g/L。 [0103] 在一些实例中，芳樟醇产生方法包括将宿主细胞在培养基中培养约1天、约2天、约 3天、约4天、约5天、约6天和约7天。通常，应当理解的是，上文提供的实例并非穷举。 [0104] 可以将培养基的pH维持在约6.5至约7.8。例如，pH可以为约6.5、约6.6、约6.7、约 6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7和约7.8。在优选的实例中，pH为约7.0。 [0105] 在一个实例中，芳樟醇产生的产率为至少60mg/L。例如，芳樟醇产生的产率可以为约60mg/L、约100mg/L、约200mg/L、约300mg/L、约400mg/L、约500mg/L、约600mg/L、约700mg/L、约800mg/L、约900mg/L、约1000mg/L、约1100mg/L、约1200mg/L、约1300mg/L、约1400mg/L、约1500mg/L、约1600mg/L、约1700mg/L、约1800mg/L、约1900mg/L、约2000mg/L、约2100mg/L、约2200mg/L、约2300mg/L、约2400mg/L、约2500mg/L、约2600mg/L、约2700mg/L、约2800mg/L、约2900mg/L、约3000mg/L、约3100mg/L、约3200mg/L、约3300mg/L、约3400mg/L、约3500mg/L、约3600mg/L、约3700mg/L、约3800mg/L、约3900mg/L和约4000mg/L。在优选的实例中，芳樟醇产生的产率为至少3000mg/L。 [0106] 在一个实例中，芳樟醇产生的产率通过每OD600的芳樟醇浓度确定。例如，芳樟醇产生的产率可以为约30mg/L/OD600、约40mg/L/OD600、约50mg/L/OD600、约60mg/L/OD600、约70mg/L/OD600、约80mg/L/OD600、约90mg/L/OD600、约100mg/L/OD600、约110mg/L/OD600、约120mg/L/OD600、约130mg/L/OD600、约140mg/L/OD600、约150mg/L/OD600、约160mg/L/OD600、约170mg/L/OD600、约180mg/L/OD600、约190mg/L/OD600、约200mg/L/OD600、约210mg/L/OD600、约220mg/L/OD600、约230mg/L/OD600、约240mg/L/OD600、约250mg/L/OD600、约260mg/L/OD600、约270mg/L/OD600、约280mg/L/OD600、约290mg/L/OD600和约300mg/L/OD600。在优选的实例中，芳樟醇产生的产率为至少240mg/L/OD600。 [0107] 在一个实例中，芳樟醇产生的碳产率被计算为产生的芳樟醇的质量与可代谢碳的总质量之比。例如，芳樟醇产生的碳产率可以为约0.5％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约 3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5.0％、约5.5％、约6.0％、约6.5％、约7.0％、约 7.5％、约8.0％、约8.5％、约9.0％、约9.5％、约10.0％、约10.5％、约11.0％、约11.5％、约 12.0％、约12.5％、约13.0％、约13.5％、约14.0％、约14.5％、约15.0％、约15.5％、约 16.5％、约16.5％、约17.0％、约18.5％、约19.0％、约19.5％和约20.0％。在优选的实例中，芳樟醇产生的碳产率为至少15％。 [0108] 本文所描述的方法可用于产生不同形式的芳樟醇。不同形式的芳樟醇包括芳樟醇的对映体，且不限于(R)‑芳樟醇和(S)‑芳樟醇。通常，应当理解的是，该列表并非穷举，并且方法可以用于产生各种类型的芳樟醇的不同组合。 [0109] 在另一方面，本发明涉及产生芳樟醇的试剂盒，其中试剂盒包含本文所描述的宿主细胞和使用说明。 [0110] 在一些实例中，试剂盒中的宿主细胞可以溶解在溶液中或是冻干的。 [0111] 在一些实例中，可以通过深度冷冻保存宿主细胞。 [0112] 本文说明性描述的本发明可以在缺乏本文未具体公开的任何一个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下被适当实施。因此，例如，术语"包括/包含(comprising)"、"包括(including)"、"含有(containing)"等应作广义解读，而无限制。此外，本文所用的术语和表达是作为描述而非限制性的方式使用，并且在使用这些术语和表达时不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但应当承认，在请求保护的发明范围内可以进行各种修改。因此，应当理解的是，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但本领域技术人员可以对本文所公开的内容所体现的发明进行修改和变型，并且这种修改和变型视为在本发明的范围内。 [0113] 本文已经对本发明进行了广泛和一般性描述。落入一般性公开内容范围内的各较窄的类别和亚属分组也构成了本发明的一部分。这包括对本发明进行的一般性描述，具有将任何主题从类别中删除的附带条件或否定限制，无论本文是否具体叙述了该删除的材料。 [0114] 其他实施方案落入所附权利要求和非限制性实施例的范围内。此外，在按照马尔库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员应当认识到，本发明也由此按照马尔库什组的任何个体成员或成员子组被描述。 [0115] 实验部分 [0116] 本发明的非限制性实施例和对比实施例将通过参考具体实施例进一步详细描述，这些具体实施例不应理解为以任何方式限制本发明的范围。 [0117] 材料和方法 [0118] 菌株和质粒构建 [0119] 耶鲁大学(Yale university)大肠杆菌遗传材料中心(Coli Genetic Stock Center；CGSC)的大肠杆菌BL21 DE3菌株(CGSC#12504)用于产生类单萜化合物。使BL21 DE3菌株的基因组缺失tnaA基因。通过将操纵子hmgS‑atoB‑hmgR和mevK‑pmK‑pmd‑idi与三种不同的启动子变体(TM1、TM2和TM3)组合到相同的p15A‑spec(L2‑8)载体中，构建了一系列新的质粒。新质粒集包括3x3＝9个质粒(表1)。将基因ApLS，即来自平田头菇的芳樟醇合酶，和S80F GPPS(例如，ispA 和AgGPPS)克隆到p15A‑kan载体中。 [0120] 表1.质粒信息 [0121] [0122] [0123] 1sps001‑009表达两个模块M1和M2。 [0124] 2TM1、TM2和TM3启动子的相对强度分别是T7启动子的约92％、37％和16％。 [0125] 3模块M1含有三个基因即HmgS、hmgR和atoB [0126] 4模块M2含有三个基因即mevK、pmk、pmd和idi [0127] 酶截短和融合 [0128] 利用内部简单的克隆方法，从ApLS截短C端19个氨基酸，并通过DNA测序对截短进行进一步验证。将截短的ApLS命名为ApLS*。将ApLS*直接与ispAS80F进行了两个方向的融合：IspAS80F‑ApLS*(GPPS与ApLS*的N端融合)和ApLS*‑IspAS80F(GPPS与ApLS*的C端融合)。 [0129] 培养基和培养条件 [0130] 除碳源外，化学成分确定培养基(或确定成分培养基)含有2g/L(NH4)2SO4、4.2g/L KH2PO4、11.24g/L K2HPO4、1.7g/L柠檬酸、0.5g/LMgSO4和10ml/L微量元素溶液，pH 7.0。微量元素溶液(100X)含有0.25g/LCoCl2·6H2O、1.5g/L MnSO4·4H2O、0.15g/L CuSO4· 2H2O、0.3g/L H3BO3、0.25g/L Na2MoO4·2H2O、0.8g/L Zn(CH3COO)2、5g/L柠檬酸铁(III)和0.84g/L EDTA，pH 8.0。 [0131] 2xPY培养基由20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物和10g/L NaCl组成。 [0132] 除碳源外，TB培养基由12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、2.31g/LKH2PO4和 12.54g/L K2HPO4组成。 [0133] 对于确定成分培养基和TB培养基，使用了两种变化形式的碳源：乳糖自动诱导培养基(LAM)，其中碳源含有2g/L葡萄糖、8g/L甘油和10‑50mM乳糖；IPTG人工诱导培养基(IMM)，其中碳源是10g/L葡萄糖。在LAM中，乳糖用作诱导剂。在IMM中，IPTG充当诱导剂。 [0134] 工程化细胞在28℃/250rpm在14mL BD FalconTM试管内的1mL上述培养基中生长3天。此外，在细胞培养过程中，使用200μL(20％v/v)十二烷或肉豆蔻酸异丙酯提取类萜。在IMM中，最初使细胞在37℃/250rpm生长，直到OD600达到1‑2，用0.01～0.25mM IPTG诱导，且然后在28℃生长3天。在LAM中，使细胞在28℃/250rpm生长3天，并用10‑50mM乳糖自动诱导。 将芳樟醇细胞的培养物用抗生素(50μg/ml卡那霉素和50μg/ml壮观霉素)补充，以维持两种质粒。 [0135] 通过GC/MS量化芳樟醇 [0136] 通过将有机层以100‑10000x稀释到己烷中制备芳樟醇样品。在配备了Agilent 5977B MSD的Agilent 7890气相色谱上分析样品。在350℃，将样品以100:1的分流比注入Agilent DB‑5柱。烘箱程序从120℃开始，持续1分钟，然后以10℃/min升至170℃，接着以 100℃/min升至310℃，并在310℃再维持2分钟。质谱仪以电子电离(EI)模式运行，并进行全扫描分析(m/z 30‑300,2光谱/s)。通过对用其可信标准品(Sigma‑Aldrich，新加坡)制备的标准曲线进行插值，量化芳樟醇浓度。 [0137] 结果 [0138] 类萜化合物途径的优化 [0139] 芳樟醇菌株是在以前的香叶醇菌株上建立的。简而言之，通过将甲羟戊酸途径分为两个模块(上部模块：包括基因atoB、hmgS和截短的hmgR；下部模块：包括基因mevK、pmK、pmd和idi)，通过启动子工程化对途径进行系统平衡(图1)。排在前面的两个菌株#21、#32分别产生了约234.2mg/L和168.9mg/L的芳樟醇。两株菌株的芳樟醇的比产率(以OD600归一化的滴度)分别为39.3mg/L/OD600和30.4mg/L/OD600。 [0140] 诱导时机和诱导剂浓度 [0141] 在确定上游甲羟戊酸途径设计后，研究了两个参数：诱导时机和诱导剂浓度。众所周知，这两个参数对产生次级代谢产物至关重要。在这里，使用了自动诱导确定成分培养基(auto‑induction defined media,AIDM)来优化诱导时机。AIDM含有三种碳：葡萄糖、甘油和乳糖。它们都可以充当细胞生长和芳樟醇产生的碳源。此外，葡萄糖还通过对乳糖(诱导剂)和甘油的吸收强加分解代谢物阻遏来控制诱导时间。当葡萄糖耗竭时，甘油作为桥接碳源，而乳糖的吸收被激活。乳糖在AIDM中充当诱导剂，且1摩尔乳糖转化为1摩尔半乳糖(不可代谢)和1摩尔葡萄糖(可代谢)。本研究中的BL21(DE3)菌株可以使用葡萄糖作为碳底物，但不能使用半乳糖作为碳底物，即所供应的乳糖的约一半可以用作碳底物。当细胞在OD600为约2时受到诱导时，观察到芳樟醇产率是最高的(332.3mg/L)(图2A)。诱导较早或较晚都会导致芳樟醇产量降低。接下来，比较和优化了两种诱导剂IPTG和乳糖。随着使用更多的诱导剂(IPTG和乳糖)，芳樟醇的产量也随之增加，并最终达到饱和(图2B和2C)。对于IPTG，芳樟醇滴度从229mg/L增加到374mg/L(32.7‑56.2mg/L/OD600)，并随着IPTG浓度增加到0.2‑ 0.25mM达到饱和。对于乳糖，芳樟醇滴度从472mg/L增加到665mg/L(56.0到79.3mg/L/OD600)，并在40‑50mM乳糖时达到饱和。 [0142] 酶截短、融合和消除芳樟醇途径的瓶颈 [0143] 接下来，鉴定了芳樟醇生物产生整个途径的限速步骤。先前，利用甲羟戊酸途径实现的两种倍半萜(绿花白千层醇(viridiflorol)和紫穗槐‑4,11‑二烯(amorpha‑4,11‑diene))的理论产率为约81％。由于芳樟醇菌株使用了相同的设计和甲羟戊酸途径基因，因此假定从葡萄糖到异戊二烯二磷酸(isoprenyl diphosphate；IPP)和(DMAPP)的碳通量不S80F 受限制。相反，将IPP/DMAPP转化为芳樟醇的最后两种酶：GPP合酶(GPPS，大肠杆菌ispA )和芳樟醇合酶(ApLS)是焦点。GPPS催化IPP和DMAPP形成GPP。芳樟醇合酶将GPP转化为芳樟醇。先前，对ApLS及其C端截短突变体(C端前19个氨基酸被缺失，命名为ApLS*)进行了研究。 ApLS*仍然保留很强活性，并且其在大肠杆菌中的表达是未截短ApLS的约5‑10倍。此外，有报道称GPPS与单萜合酶的融合可通过将更多的IPP/DMAPP引导至单萜来提高单萜的产率。 因此，研究了截短和融合策略(图3A)。测试了两种方向的融合蛋白(左侧和右侧分别代表蛋白的N端和C端)：一种是ispA‑ApLS*，另一种是ApLS*‑ispA(图3B)。然而，两种融合设计产生的芳樟醇都少于非融合的游离形式(ApLS*+ispA，图3B)。此外，与表达野生型ApLS的菌株相比，使用ApLS*的菌株意外地产生了更少的芳樟醇。两种策略的不成功导致了一种假设，即产生芳樟醇的瓶颈不是芳樟醇合酶，而可能是GPPS活性不足。 [0144] 为了测试这一假设，将另一种GPPS，即来自大冷杉的N端截短GPPS(AgGPPS)在最佳菌株#21中表达，并且将所得的菌株命名为#21g。事实上，在所有测试的乳糖浓缩物中，菌株#21g产生的芳樟醇比菌株#21高出约36％‑61％(图3C)。对于菌株#21g和菌株#21，在芳樟醇产生和乳糖浓度之间也观察到了类似的趋势，并且芳樟醇滴度在40‑50mM乳糖时达到了 1071mg/L(118.2mg/L/OD600)。结果支持菌株#21中GPP供应受到限制，且补充额外的GPPS可以克服这种限制，并显著提高芳樟醇产量。 [0145] 芳樟醇产生的培养基优化 [0146] 此外，还比较了用于芳樟醇产生的不同培养基。根据先前的研究，选择了三种培养基：2xPY、TB和确定成分培养基(图4A)。前两种培养基是复合培养基，而最后一种培养基是化学成分确定培养基(chemically defined medium)，仅由盐和有机碳组成。TB培养基中芳樟醇的滴度(2049mg/L)和比产率(184.1mg/L/OD600)是三种培养基中最高的(图4A)。2xPY培养基和确定成分培养基的芳樟醇滴度相似。然而，由于OD600较低，确定成分培养基中芳樟醇的比产率(114.9mg/L/OD600)比2xPY培养基中的比产率(81.9mg/L/OD600)高40％。接下来，进一步滴定了葡萄糖、甘油和乳糖三种碳的浓度。在(3g/L葡萄糖、12g/L甘油和40mM乳糖)条件下，菌株#21g产生的芳樟醇高达3360mg/L(或246.1mg/L/OD600)。 [0147] 芳樟醇产率(Yp/s) [0148] 对所用的所有策略进行了总结，并计算了芳樟醇产率(产生的芳樟醇质量/可代谢碳的质量)。在此，由于所用的BL21菌株不能代谢半乳糖，因此只有一半的乳糖(质量)可以用作碳底物。因此，总碳是一半乳糖质量、葡萄糖和甘油总质量的总和，并且相应地计算芳樟醇碳产率(图5)。合并所有策略，滴度从66mg/L提高到3360mg/L，且产率从0.5％提高到 15％。该产率是当前文献中最高的。 [0149] 表2.序列表概述. [0150] [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] 等同物 [0159] 提供上述实施例旨在说明本发明，且不应解释为对本发明的范围施加任何限制。 明显的是，在不偏离本发明原理的情况下，可以对以上描述的和实施例说明的本发明具体实施方案进行大量修改和改变。本申请旨在包括所有这些修改和改变。