[0001] 本发明属于中药鉴别技术领域，具体涉及一种PCR鉴别蜘蛛香及其混伪品的引物对及方法。

[0002] 蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones)为忍冬科(Caprifoliaceae)缬草属(Valeriana)植物，收录于2015年版《中国药典》，为新疆维吾尔医药中常用药材，药性为二级干热，具有补脑、安神、健胃、舒肝、燥湿利水，止咳平喘的功效，常用于治疗胸闷气结，神经衰弱，失眠，高血压，咳嗽气喘，心脏病和肠胃疼痛，尿闭诸症。蜘蛛香以干燥根茎入药，主要分布于河南、湖北、四川、云南贵州等省，国外分布于巴基斯坦、印度等国。

[0003] 维文记载的相关参考资料在记载药材的名称时存在混淆，造成维吾尔医药使用的药材中存在大量同物异名、同名异物的现象。其中蜘蛛香药材就常与马兜铃科(Aristolochiaceae)细辛属(Asarum)的欧细辛(Asarum europaeum L.)和其代用品细辛(Asarum heterotropoides F.Schmidt)混用，由于其混用广泛存在于新疆，国内其他地区未产生三者混用现象，目前未见对蜘蛛香与欧细辛、辽细辛进行鉴别区分的研究。鉴于蜘蛛香与后两者功能主治及药理作用不同，不可互相代用，亟需建立鉴别区分蜘蛛香与欧细辛、细辛的方法。位点特异性PCR扩增法(allele‑specific polymerase chain reaction，AS‑PCR)是一种简单快捷、准确的检测SNP方法，其建立的检测方法无需测序，且鉴别效率高，已成功用于中药材延胡索、当归、九里香等多种药材的鉴别。目前未见利用AS‑PCR扩增法在鉴别蜘蛛香中的应用。本研究以ITS2序列为靶序列，以蜘蛛香、欧细辛、细辛的差异位点片段建立位点特异性PCR鉴别方法，对维药蜘蛛香药材进行鉴别，保障维药蜘蛛香的用药准确性和安全性。

[0027] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0028] 实施例1

[0029] 本实施例采用的实验仪器：电泳系统(北京市六一仪器厂，型号：DYY‑6C)；Del DocTM XR+凝胶成像系统(美国Bio‑Rad公司，型号：Gel Doc XR+)；梯度PCR扩增仪(德国Biometra公司，型号：TProfessional)；PCR仪(美国Bio‑Rad公司，型号：C‑1000TM)；梯度PCR扩增仪(天隆科技，型号：Gentier96E)；超微量紫外分光光度计(德国Implen公司，型号：N60)；电子天平(余姚纪铭称重校验设备有限公司，型号：JM1000)；低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司，型号：5424)，纯水仪(优普公司，型号：UPC‑I‑10T)。

[0030] 采用的试剂及样品：DNA凝胶快速纯化试剂盒、EasyTaq DNA聚合酶、High Pure dNTPs(北京全式金生物技术股份有限公司)，Ex Taq(TaKaRa公司)，Taq DNA聚合酶(北京天根生化科技有限公司)，CTAB(白鲨生物)，琼脂糖(Agrose公司)，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。样品收集来自药店购买、野外采集，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江研究员鉴定，凭证标本保存于新疆维吾尔自治区药物研究所(表1)。

[0031] 表1样品信息表

[0032]

[0033]

[0034] 1.DNA模板的制备

[0035] 取供试品用75％乙醇擦拭表面，晾干，加入液氮用研钵研磨成细粉，取约20mg。参考改良的CTAB法提取样品DNA，方法如下：1、加入800μL核分离液，静置3min后12000rpm离心‑15min，去上清；2、加入800μL 55℃预热的2×CTAB缓冲溶液、25μL的10mg·mL 蛋白酶K、10μL‑1
的20mg·mL RNaseA，于55℃水浴2小时；3、取出样品12000rpm离心5min，取上清加入600μL氯仿混匀后12000rpm离心5min，取上清；4、加入等体积的氯仿：酚(1：1)混匀后12000rpm离心5min，取上清；5、加入等体积的氯仿：异戊醇(25：1)混匀后12000rpm离心5min，取上清；6、加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀4次，再加与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min；7、10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；8、将吸附柱放回收集管中，加入500μl PW Solution，10000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；9、将吸附柱放回收集管中，加入500μlWash Solution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液；10、将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min；11、取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl 65℃预热的TE Buffer，静置3min，12,
000rpm离心2min，即得。所得DNA用微量紫外分光光度计测定浓度和纯度，将得到的DNA溶液于4℃冰箱保存。

[0036] 2.ITS2片段扩增及电泳

[0037] 对样品Z0‑Z7、O1‑O4、X0‑X6进行ITS2序列扩增，PCR扩增采用25μL体系，包括2μL DNA模板，0.25μL DNA聚合酶，2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，上下游引物各0.5μL ITS2通用引物(S2F：ATGCGATACTTGGTG TGAAT，S3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT)，用ddH20补足，进行扩增，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s，运行35个循环；72℃延伸7min，将目的条带进行切胶回收，纯化后的产物取5μL与1μL 6×loading buffer混匀后于染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，在130V电泳的条件下电泳30min，在凝胶成像系统中观察并记录结果，并将纯化产物送至上海生工进行双向测序。

[0038] 3.位点特异性引物设计及特异性考察

[0039] 利用Mega  6.0软件对ITS2序列进行对比分析，查找SNP位点，使用Pri mer Premier 6.0软件根据蜘蛛香与欧细辛、细辛的序列差异设计一对富含差异位点的特异性引物鉴别蜘蛛香。选择蜘蛛香、欧细辛、细辛样品各两个；PCR扩增采用25μL体系，包括1μL DNA模板，0.25μL DNA聚合酶，2.5μL10×buffer，2μL dNTP，上下游引物各0.5μL特异引物，用ddH20补足，进行扩增，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30min，55℃退火30s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。产物取5μL与1μL 6×loading buffer混匀后于染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并记录结果。

[0040] 测序结果用CExpress软件进行校对拼接，去除低质量序列及引物区。基于隐马尔可夫模型的注释方法将所有序列去除两端的5.8S和28S区段，获得ITS2间隔区序列，将序列代入到Mega 6.0软件中进行对比。用邻接法(Neighbour‑Joining)构建系统聚类树(NJ树)，设置bootstrap1000次重复，检验各分支支持率。由图1可知蜘蛛香、欧细辛以及细辛均能明显分开(图1)。

[0041] 特异引物设计及特异性考察：根据Mega 6.0软件ITS2序列对比发现，蜘蛛香、欧细辛、细辛在第254位碱基到第279位碱基之间存在多个差异位点，利用Primer Premier 6.0软件根据这段差异位点设计一对特异性引物(T‑F:GGT CGAATATGTCCTCTGT；T‑R：CCTCCGCTTATTGATATGC)，进行扩增，只有蜘蛛香能在100‑200bp扩增出条带(图2)。

[0042] 4.AS‑PCR反应条件

[0043] PCR扩增体系与特异性考察体系一致，对影响扩增准确性和稳定性的主要条件进行考察(循环次数：27、28、29、30、31、32；退火温度：50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃、64℃；Tap DNA聚合酶厂家： PCR仪厂家：)。

[0044] 退火温度考察扩增体系与特异性考察体系一致，以浓度为20ng·μL‑1的Z7样品为模板，对退火温度进行考察，考察退火温度为50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃时的扩增效果，退火温度在50‑58℃时对实验影响不大，为了保证扩增反应的特异性，选择58℃为最佳退火温度进行后续考察(图3)。

[0045] 循环数考察：循环数考察扩增体系与特异性考察体系一致，以浓度为20ng·μL‑1的Z7样品为模板，对循环次数进行考察，结果28‑32次循环对实验影响不大，但低于28次则会扩增失败，根据条带亮度以及扩增时间，选择29个循环作为最佳循环次数进行后续考察(图4)。

[0046] Tap酶考察：Tap酶考察扩增体系与特异性考察体系一致，以浓度为20ng·μL‑1的Z7样品为模板，对Tap酶试剂厂家进行考察，结果发现天根和全式金的酶均能扩出明亮的条带，但TaKaRa的酶未能成功扩增出目的条带。根据成本考虑选择了全式金的Tap酶来建立蜘蛛香特异性PCR方法(图5)。

[0047] PCR仪器考察：PCR仪器考察扩增体系与特异性考察体系一致，考察了不同仪器对AS‑PCR反应的影响，结果显示三种仪器均能扩增出目的条带且条带亮度没有较大差异，说明该方法对仪器的依赖性小(图6)。

[0048] 检出限考察：取Z7样品DNA浓度稀释为：20ng·μL‑1、10ng·μL‑1、2ng·μL‑1、1ng·μ‑1 ‑1 ‑1L 、0.1ng·μL 、0.05ng·μL ，以稀释后的DNA为模板进行特异性PCR扩增进行检出限考‑1
察，结果显示目的条带亮度随着DNA浓度降低而减弱，在DNA浓度0.1ng·μL 时可见隐约的‑1
条带，确定该方法的最低检出限为0.1ng·μL (图7)。

[0049] 特异性PCR方法建立：按建立的特异性PCR扩增方法对Z1‑Z31进行扩增，均扩增成功，除样品Z9、Z10由于DNA浓度较低条带较暗(图8)。经上述考察结果，确定鉴别蜘蛛香的特‑1异性PCR方法如下：PCR体系为25μL，包括1μL DNA模板(≥0.1ng·L )，0.25μL EasyTaq DNA‑1
聚合酶(北京全式金)，2.5μL 10×buffer，2μL dNTP，T‑F、T‑R各0.5μL(10μmol·L )，ddH2O补足；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，运行29个循环；72℃延伸5min。按照该方法如跑出条带则为蜘蛛香。

[0050] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。