技术领域
[0001] 本发明涉及一种兔轮状病毒基因分型的多重RT‑PCR检测的引物及检测方法，属于生物技术领域。
相关背景技术
[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的一些理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003] 兔轮状病毒病(Lapine rotavirus disease)是由呼肠孤病毒科轮状病毒属兔轮状病毒(Lapine rotavirus,LRV)引起的一种兔的急性肠道传染病，给家兔饲养行业造成较大的经济损失，同时也危及公共卫生安全。目前发现的兔轮状病毒均属于A群血清3型。LRV的基因组为一条单股正链的RNA分子，大小约6.4‑7.3Kb，基因组包含3个开放阅读框和多聚腺苷酸(PolyA)尾。其中VP4蛋白是位于外层衣壳的突刺状结构，决定病毒的P型，并经酶切反应增强病毒对宿主细胞的感染性。VP4含有中和抗原表位，诱导机体产生保护性抗体，是鉴定病毒血清型和研制RV疫苗的基础。VP7位于病毒衣壳的最外层，具有膜结合能力，在维持外壳蛋白的稳定和促进病毒的成熟过程中发挥重要作用，根据VP7可分为不同的G型。
[0004] 目前已发现了兔轮状病毒优势基因型有G3P[22]型、G3P[41]型。LRV的常用检测方法有病毒分离、酶联免疫吸附法(ELISA)、电镜观察法、RT‑PCR法等。其中RT‑PCR该技术检测成本低、效率高，可真正实现快速核酸检测。且多重RT‑PCR检测方法可以有效的节约稀少样本，同时节省试剂，因此建立兔轮状病毒多重RT‑PCR基因分型检测方法很有必要。
具体实施方式
[0039] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0040] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
[0041] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0042] 1、引物设计
[0043] 根据轮状病毒VP7和VP4分别将轮状病毒分为G型和P型，到目前为止，RVAs种类已有57个G型和41个P型，优势基因型有G3P[22]型、G3P[41]型。因此根据VP7和VP4基因设计G3、P[22]、P[41]型对应的特异性引物对快速鉴定兔轮状病毒基因型十分关键。
[0044] 本实施例所述的检测LRV基因分型的特异性引物，G3其对应的特异性扩增片段位于LRVVP7基因的第636‑739位点之间，大小为104bp，所述特异性扩增片段的序列结构具体为：
[0045] 5’‑TCCACTAAACACGCAAACTCTAGGAATTGGTTGCTTGACCACCGACACAACGACATTCGAAGAAGTTGCAACAGCTGAGAAATTGGTAATAACTGATGTTGTCG‑3’。
[0046] 所述P[22]引物对应的特异性扩增片段位于LRVVP4基因的第1087‑1598位点之间，大小为333bp；所述特异性扩增片段的序列结构具体为：
[0047] 5’‑GACTCACAAGCATTCAGAAACATGGTGTATGTGAGATCGTTAGCGGCTGATCTAAACTCTGTTATTTGCAGTGGTGGTAGCTATAGTTTCGCATTACCTGTAGGAAATTTCCCAGTAATGTCTGGAGGTGCTGTATCATTACATTCTTCTGGAGTAACACTATCAACGCAATTTACAGATTATGTATCTCTTAATTCGTTAAGATTTAGATTCAGATTAGTAGTCGAGGAACCTCCATTCTCGATAACGCGCACGCGAGTGAGTGGGTTGTACGGGTTGCCAGCCGTGAATCCGAACAATTCTAGAGAATTTTACGAAATAATGGGAAGATTTTCTTTAATATCATTAGTACCTTCGAATGATGATTATCAAACACCAATAATGAATTCAGTAACCGTCAGACAAGACCTCGAGAAACAACTCGGAGAATTACGCGATGAATTTAATGCATTATCTCAACAAATTGCAATGTCACAGCTAATAGATTTAGCACTATTGCCGTTGGATATGTT‑3’。
[0048] 所述P[41]引物对应的特异性扩增片段位于LRVVP4基因的第1685‑2017位点之间，大小为512bp；所述P[41]特异性扩增片段的序列结构具体为：
[0049] 5’‑GCAGCGTCATCAATATCTAGAGGATCAACAATAAGATCAATTAGTTCATCAGTTTCAGCATGGACAGAAATTTCGGATTCAGCTGGGGACTTAACTACGACAGCTAGCTCAGTGGCAACACAGACTGCAACACTTAGCAGACGACTAAGATTAAAAGAAATTGCCACGCAGACTGATGGTATGAATTTCGACGATATTTCTGCTGCAGTGCTTAAGACTAAAATAGATAGGTCTACACAAATTACACCAAACACATTACCAGACATTGTGACAGAAGCATCAGAAAAATTCATACCAAACAGAGCGTATAGAGTTGTAGATAATGATGAAGTG‑3’。
[0050] 根据GenBank(OM416833.1)中已登录的LRVVP7基因序列设计得到G3引物，上游引物F：5’‑TCCACTAAACACGCAAAC‑3’；下游引物R：5’‑CGACAACATCAGTTATTACC‑3’。
[0051] 根据GenBank(OM416832.1)中已登录的LRVVP4基因序列设计得到P[22]引物，上游引物F：5’‑GACTCACAAGCATTCAGA‑3’；下游引物R：5’‑AACATATCCAACGGCAATA‑3’。
[0052] 根据实验室分离株0195(基因型G3P[41])VP4基因序列设计得到P[41]引物，上游引物F：5’‑GCAGCGTCATCAATATCT‑3’；下游引物R：5’‑CACTTCATCATTATCTACAACTC‑3’。
[0053] 2、核酸提取
[0054] 将肝脏组织用PBS以1∶10研磨成悬液，装入高压灭菌处理过的1.5mL EP管中，于‑‑880℃反复冻融3次，冻融后以9000×g/min,离心10min，进行倍比稀释至10 ，分别取300μL于
2mL离心管中，加入900μLTRIZOL试剂，剧烈颠倒60‑100次，室温静置10min。加入200μL氯仿，上下颠倒60‑100次，室温静置5min。4℃、10000×g/min，离心10min，取上清移入1.5mL离心管中(如果浑浊再加入200μL氯仿，摇匀，放置5min，再次离心取上清)。加同体积的异丙醇，轻轻摇匀，‑20℃放30min。4℃、10000×g/min，离心10min，倒掉上清。加入1mL75％的乙醇(DEPC水配制)，4℃、10000×g/min，离心5min。去掉上清，4℃、12000×g/min，离心5min，用微量移液器吸去管底部的液体，在超净工作台中干燥5min(不宜太干，否则RNA很难溶解)。
用适量0.1％DEPC水溶解RNA，‑20℃冻存。
[0055] 3、RT‑PCR扩增
[0056] 以RNA为模板，通过上述引物进行RT‑PCR基因扩增；
[0057] RT‑PCR反应体系：2×one StepBuffer10μL,PrimeScript one Step酶混合液0.5μL，上、下游引物(20μmol/μL)各0.5μL，Template 2μL，ddH2O补充至20μL。
[0058] RT‑PCR反应的扩增参数为：50℃、30min，94℃、3min，94℃、20s、50℃、20s、72℃、30s，共循环35次；72℃、10min。
[0059] 4、结果判断
[0060] 反应结束后取5μL PCR产物加入2℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，检测样品中若有大小约104bp扩增条带，则样本中兔轮状病毒为G3型；当扩增片段大小为333bp，则样本中兔轮状病毒为P[22]型；当扩增片段为512bp，则样本中兔轮状病毒为P[41]型。如图1所示。
[0061] 5、特异性验证
[0062] 分别用兔冠状病毒、兔星状病毒、兔出血症病毒、兔大肠杆菌、兔巴氏杆菌、兔绿脓杆菌提取DNA/RNA作为模板进行RT‑PCR，通过凝胶电泳检测。实验结果如图2所示，只有兔轮状病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
[0063] 6、重复性试验
[0064] 对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果。说明本发明的方法具有很好的重复性。
[0065] 7、灵敏度验证
[0066] 选择LRV G3型构建质粒以10倍系列稀释，用上述建立的RT‑PCR扩增方法进行检‑8 ‑测，结果表明，本发明对G3型的最低模板检测浓度为2×10 ng/mL，判断其灵敏度为2×10
8
ng/mL。如图4所示。
[0067] 选择LRVP[22]型构建质粒以10倍系列稀释，用上述建立的RT‑PCR扩增方法进行检‑7测，结果表明，本发明对P[22]型的最低模板检测浓度为2×10 ng/mL，判断其灵敏度为2×‑7
10 ng/mL。如图5所示。
[0068] 选择LRVP[41]型构建质粒以10倍系列稀释，用上述建立的RT‑PCR扩增方法进行检‑7测，结果表明，本发明对P[41]型的最低模板检测浓度为1×10 ng/mL，判断其灵敏度为1×‑7
10 ng/mL。如图6所示。
[0069] 8、临床样品检测
[0070] 收集家兔粪拭子，加入0.8mL PBS(0.01mol/LpH7.2)，充分震荡，取上清提取核酸，用建立的方法进行检测，并与传统单一RT‑PCR检测方法进行比较，结果符合率为100％。如图3所示。
[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
