[0001] 本发明属于医药化工领域，更具体地涉及一种含卡比多巴的药物中致突变杂质肼的分析检测方法。技术背景

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003] 肼(又称联氨)，化学结构式为H2N‑NH2，为无色油状液体，有类似于氨的刺鼻气味，是一种强极性化合物，该物质是一种腐蚀性和致癌物质，肼为2A类致癌物清单中物质。根据国际人用药品注册技术要求协调会(ICH)相关指导原则，肼的可接受摄入量(AI)或每日允许暴露量(PDE)为0.2(吸入)或39μg/天(所有其他途径)。

[0004] 在药物合成过程中，特别含肼类结构的化合物，如卡比多巴、异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪等，可能因合成起始物料带入或化合物降解等途径，使得在原料药或药物制剂中有微量致突变杂质(又称基因毒性杂质，简称基毒杂质)肼残留的可能，威胁人体服用该类药物成分的安全性，因此，对肼的检测和合理控制是该类药物研制过程中非常重要的一环。

[0005] 由于肼为强极性化合物，在液相色谱分离中呈现明显弱保留性，难以直接检测，且该物质化学结构中不含任何发色基团，常规紫外检测器或荧光检测器均不能直接应用于检测该物质。因此，现阶段对肼的检测大多采用衍生化试剂，通过与肼衍生形成具有紫外吸收或荧光吸收的衍生物后，进而再通过高效液相色谱仪等进行定量检测。

[0006] 针对含肼或肼基团原料药或药物制剂的潜在致突变杂质肼的分析检测方法，现阶段多以醛类化合物为衍生化试剂，如苯甲醛、水杨醛、5‑硝基糠醛、邻苯二甲醛、2,3‑萘基二缩醛、五氟苯甲醛等，这是由于醛类衍生化试剂可与肼能快速反应，并形成较稳定具紫外吸收的衍生物，其中，应用最广泛和相对较为成熟的是以苯甲醛为衍生化试剂，这也被收载入了这类药物成分杂质肼检测的药典质量标准，如异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪药物的欧洲药典(EP)。苯甲醛与肼的衍生化反应机理为，肼与苯甲醛在常温条件下即可快速形成具有紫外吸收的二苄肼，具体衍生反应过程如下所示：

[0007]

[0008] 但是，与异烟肼、别嘌呤醇、硫酸双肼屈嗪等化合物不同的是，卡比多巴化合物结构上含有肼基团，且位于脂肪链上，这种结构特征就使得在以苯甲醛为衍生化试剂的反应中，衍生化试剂除了与致突变杂质肼反应外，还可与卡比多巴结构上的肼基团反应，并最终形成相同的二苄肼衍生物，进而影响了药物中实际存在基毒杂质肼的含量检测结果。卡比多巴参与衍生化反应的机理如下所示：

[0009]

[0010] 即苯甲醛首先与卡比多巴化学结构上的肼基团一侧反应，然后苯甲醛继续进攻其脂肪链上另一侧肼基团，并使其从脂肪链上脱掉，形成二苄肼。由于苯甲醛活性较强，与卡比多巴相对较易反应，这使得该反应时间差非常短，难以控制卡比多巴与杂质肼参与衍生反应的时间间隔，导致卡比多巴生成的二苄肼衍生物干扰杂质肼的定量检测结果。

[0011] 因此，在卡比多巴原料药中基毒杂质肼的检测中，通常首先需经复杂的分离手段，使原料药与可能存在的基毒杂质肼分离后，再单独对含肼的分离液进行衍生化处理后检测，如卡比多巴原料药的英国药典(BP)质量标准中，基毒杂质肼的检测方法为先充填制备离子交换树脂层析柱，利用卡比多巴与肼在层析柱中保留性差异，去除保留性较强的卡比多巴成分，从而分离得到弱保留性的含肼分离液，然后再以水杨醛为衍生化试剂进行衍化处理，最后采用薄层色谱法与同样经衍生化的对照品溶液进行荧光显色对比。该方法针对卡比多巴原料药中基毒杂质肼检测的优点在于可较大程度避免衍生化过程中主成分的干扰，缺点在于前期层析分离过程较繁杂，且易存在因杂质肼在分离过程中的损失，而出现低于实际含量的情况。

[0012] 虽然针对卡比多巴原料药中基毒杂质肼的检测而言，可以采用离子交换树脂对弱保留性的肼进行分离后再进行衍生后的检测，但是上述操作繁琐，并且对于同时含卡比多巴和其它辅料的药物制剂而言，这种方式却不可行，其原因在于制剂样品中含有较多辅料成分，如填充剂、黏合剂、崩解剂等，这就使得供试品溶液呈非溶液状，而为具有一定粘度的溶液，供试品溶液难以顺利通过层析柱，也不能有效分离出含肼的分离液。因此，现阶段针对含卡比多巴药物制剂中致突变杂质肼的检测仍然采用以苯甲醛为衍生物的分析检测方法，利用苯甲醛与卡比多巴的反应速率相较于与肼略慢的特点，通过异常精准的操作时间控制，如以精确至10～15秒的时间差，以及扣除主成分存在的相对固定的基础干扰值，来进行这类药物制剂中基毒杂质肼的检测分析，而这种方式除了对操作要求异常高外，也仍会因不同操作时间差，导致检测波动大等问题。

[0013] 因此，如何提供一种受卡比多巴主成分干扰小、准确度和检测灵敏度高，且具有良好稳定性和操作便捷的分析检测方法，对含卡比多巴药物制剂中微量致突变杂质肼的定量检测具有重要的现实意义。

[0058] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0059] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0060] 实施例1肼与2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈衍生物的紫外吸收波长扫描[0061] 取二盐酸肼对照品(批号13152，来源：QCS，含量：97.18％)约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取4ml，置25ml量瓶中，用稀释剂(乙腈‑水＝1：1)稀释至刻度，摇匀，即得二盐酸肼对照品溶液。精密量取二盐酸肼对照品溶液1ml，置25ml具塞锥形瓶中，加入含2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈浓度为2μg/ml的乙腈溶液和pH 8.2硼酸盐缓冲液4ml(反应液pH值为
7.6)，置35℃水浴振摇13min后，立即加入5ml的0.1mol/L冷盐酸溶液(约为4℃)，并冷却至室温后，取上述衍生后溶液，采用紫外分光光度计在200～400nm范围内进行全波长扫描，如图1所示。肼与2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈反应生成的衍生物的最大紫外吸收波长为
299.7nm。

[0062] 实施例2致突变杂质肼衍生化检测的分析方法学验证

[0063] (1)检查方法

[0064] 稀释剂：乙腈‑水(1：1)。

[0065] 硼酸盐缓冲液(pH 8.2)：取硼酸3.09g和氯化钾3.73g，置1000ml量瓶中，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液60ml，加水稀释定容至刻度，摇匀，即得。

[0066] 衍生化溶液：取2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈适量，精密称定，置适宜量瓶中，加乙腈溶解并定量稀释至刻度，摇匀，配制含2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈约为2μg/ml的衍生化溶液。

[0067] 对照品溶液：精密称取二盐酸肼对照品适量，置适宜量瓶中，加稀释剂溶解并定量稀释至含二盐酸肼约为0.8μg/ml的溶液。

[0068] 供试品溶液：取卡比多巴片，研细，取细粉适量(含卡比多巴约25mg)，置10ml量瓶中，加入量瓶50％体积稀释剂超声10min，然后用稀释剂稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

[0069] 衍生化程序：分别量取1mL对照品溶液和供试品溶液，分别置25ml具塞锥形瓶中，精密加入衍生化溶液1ml和pH 8.2硼酸盐缓冲液4ml(反应液pH值为7.8)，置35℃水浴振摇13min后，取出立即加入5ml的0.1mol/L冷盐酸溶液(约5℃)，并冷却至室温。

[0070] 检测仪器：高效液相色谱仪(紫外检测器)；

[0071] 色谱柱：SUPELCO LiChrospher 100RP(4.0mm×125mm，5μm)

[0072] 检测波长：300nm；

[0073] 进样体积：20μL；

[0074] 流速：1.2mL/min；

[0075] 柱温：30℃；

[0076] 流动相：乙腈‑0.05％乙二胺四醋酸二钠水溶液(55：45)；

[0077] 精密量取衍生后的对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算肼含量(肼与二盐酸肼的换算系数为0.3053)。

[0078] (2)专属性

[0079] 分别配制二盐酸肼对照品溶液、卡比多巴片供试品溶液、含二盐酸肼的加标供试品溶液、空白辅料溶液，经衍生化处理后，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见图2所示。试验结果显示，加标供试品溶液中色谱峰位置(保留时间6.385min)与对照品溶液色谱峰位置(保留时间6.417min)基本一致，且空白辅料对衍生物色谱峰无干扰，表明方法专属性良好。

[0080] (3)检测限与定量限

[0081] 取二盐酸肼对照品溶液适量，经稀释后按衍生化程序进行处理，分别至衍生物色谱峰高约为基线噪音的3倍(s/n＝3)作为检测限，色谱图中衍生物色谱峰高约为基线噪音的10倍(s/n＝10)作为定量限，具体试验结果如下表所示。

[0082]

[0083] 试验结果显示，采用信噪比法，测得该方法条件二盐酸肼的检测限浓度为0.0094μg/ml；定量限浓度为0.0371μg/ml，连续6针定量限浓度峰面积的相对标准偏差为2.06％，方法灵敏度良好。

[0084] (4)线性与范围

[0085] 取二盐酸肼对照品约15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，然后分别稀释成为0.0371μg/ml、0.1234μg/ml、0.2468μg/ml、0.3703μg/ml、0.4937μg/ml和0.6171μg/ml的系列浓度的对照品溶液，按衍生化程序进行处理，注入液相色谱仪，以二盐酸肼浓度为横从标，色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，线性回归图见图3所示，具体试验结果如下表所示。

[0086]

[0087] 试验研究结果显示，二盐酸肼在0.0371～0.6171μg/ml浓度范围内，线性方程为y＝179790x+2.5619，线性相关系数r为0.9999，说明线性关系良好。

[0088] (5)准确度

[0089] 分别取二盐酸肼对照品各适量及对应处方量卡比多巴片空白辅料，精密称定，置适宜量瓶中，配制含二盐酸肼为0.12μg/ml、0.24μg/ml和0.37μg/ml的溶液，即限度浓度的50％、100％和150％准确度溶液，平行配制三份，然后按衍生化方法进行处理，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算回收率，具体试验结果见下表。

[0090]

[0091] 试验研究结果显示，在50％、100％和160％三种浓度条件下的回收率在94.3～102.3％，9份样品的平均回收率为97.6％，相对标准偏差为2.93％，表明方法准确度良好。

[0092] (6)精密度

[0093] 取上述准确度考察项下100％准确度溶液样品，重复配制6份，经衍生化方法进行处理后，在同一色谱条件下进样分析，按外标法以峰面积计算含量的相对标准偏差(RSD)，具体试验结果见下表。

[0094]

[0095]

[0096] 试验研究结果显示，6份样品含量平均值为19.5ppm，含量的RSD值为2.4％，方法精密度良好。

[0097] (7)溶液稳定性

[0098] 按“检查方法”项下方法，分别配制对照品溶液和供试品溶液，经衍生化方法进行处理后，在室温条件下分别放置0、6、12、24、36、48h后进样分析，考察对照品溶液和供试品溶液中美金刚衍生物的稳定性，具体试验结果见下表。

[0099]

[0100] 试验结果显示，在室温条件下48h内，各时间点供试品和对照品溶液色谱图中主峰面积与0h峰面积比值在0.98～1.02范围内，峰面积相对标准偏差均在2％以内，表明该衍生物在室温条件下48h内稳定性良好。

[0101] 实施例3恩他卡朋双多巴片中致突变杂质肼的检测

[0102] 本实施例提供一种含恩他卡朋、卡比多巴、左旋多巴三成分复方制剂恩他卡朋双多巴片(商品名：达灵复；规格：左旋多巴100mg、卡比多巴25mg和恩他卡朋200mg)中致突变杂质肼的检测方法。取复方片剂(批号：2129037)10片，研细，取细粉适量(含卡比多巴约25mg)，置25ml具塞锥形瓶中，加2.5mmol/L盐酸溶液3ml使粉末充分润湿，再加入7ml稀释剂(乙腈‑水＝1：1)超声5min，滤过，即得供试品溶液。其余衍生化程序及其它色谱条件同实施例2的检查方法，衍生反应液pH值为7.4，所测定的产品中致突变杂质肼含量为2.3ppm，供试品检测的典型色谱图见图4(衍生物色谱峰保留时间6.395min)。该研究结果也显示，该供试品中含有微量致突变杂质肼，但远低于产品规定的20ppm限度标准。

[0103] 对比例1以苯甲醛为衍生试剂的恩他卡朋双多巴片致突变杂质肼的检测

[0104] 供试品溶液的配制取实施例3中的恩他卡朋双多巴片(批号：2129037)10片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于卡比多巴12.5mg),置25ml量瓶中，精密加2.5mmol/L盐酸溶液1ml，迅速涡旋10～15秒使粉末润湿，再精密加1％苯甲醛的甲醇‑水(9:1)溶液4ml，密塞，振摇3分钟，滤过，取续滤液(从加入2.5mmol/L盐酸溶液开始到最后进样的时间应控制在4分15秒以内)。

[0105] 对照品溶液的配制精密称取二盐酸肼对照品25.2mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取4ml，置50ml量瓶中，用2.5mmol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置25ml量瓶中，精密加
1％苯甲醛的甲醇‑水(9:1)溶液4ml，密塞，振摇3分钟。

[0106] 色谱条件采用LiChrospher 100RP18(125×4mm，5μm)色谱柱，以乙腈‑含0.3％三氟乙酸水溶液(55:45)为流动相；流速为每分钟1.2ml；柱温为30℃；检测波长为310nm；进样体积20μl。所测定的产品中肼含量为8.5ppm，样品检测典型色谱图见图5所示(衍生物色谱峰保留时间9.656min)。

[0107] 该检测方法为药品质量标准收载的检测方法，而与实施例3检测结果相比，虽然检测结果也低于产品20ppm限度要求，但是明显偏高，这也表明以苯甲醛为衍生试剂时，在严格控制衍生反应和操作时间条件下，仍然不可避免卡比多巴主成分参与衍生反应，从而干扰样品检测结果。

[0108] 对比例2降低衍生反应时间的致突变杂质肼的检测

[0109] 在实施例3所制备的恩他卡朋双多巴片供试品溶液制备的基础上，在供试品溶液衍生反应过程中，降低衍生反应时进行杂质肼的检测，即量取1ml供试品溶液，置25ml具塞锥形瓶中，精密加入衍生化溶液1ml和pH 8.2硼酸盐缓冲液4ml，置35℃水浴振摇10min后，取出立即加入5ml的0.1mol/L冷盐酸溶液(约5℃)，并冷却至室温。其它色谱条件同实施例2的检查方法，所测定的产品中致突变杂质肼含量为1.4ppm。该研究显示，2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈与肼的衍生反应速率相对缓慢，衍生反应时间不足情况下，将导致反应不充分而影响检测结果。

[0110] 对比例3延长衍生反应时间时间的致突变杂质肼的检测

[0111] 在实施例3所制备的恩他卡朋双多巴片供试品溶液制备的基础上，在供试品溶液衍生反应过程中，延长衍生反应时进行杂质肼的检测，即量取1ml供试品溶液，置25ml具塞锥形瓶中，精密加入衍生化溶液1ml和pH 8.2硼酸盐缓冲液4ml，置35℃水浴振摇16min后，取出立即加入5ml的0.1mol/L冷盐酸溶液(约5℃)，并冷却至室温。其它色谱条件同实施例2的检查方法，所测定的产品中致突变杂质肼含量为5.9ppm。该研究结果显示，虽然2‑甲基‑5‑硝基‑4‑氟苯腈与卡比多巴化学结构上肼基团反应相对缓慢，但反应时间和条件充分情况下，也仍然会与该衍生化试剂反应，并使其从卡比多巴结构上脱落，进而干扰杂质肼的检测结果。

[0112] 对比例4衍生反应过程中不加盐酸的致突变杂质肼的检测

[0113] 在实施例3所制备的恩他卡朋双多巴片供试品溶液制备的基础上，在供试品溶液衍生反应过程中，进行衍生反应后，不加入冷盐酸溶液进行杂质肼的检测，即量取1ml供试品溶液，置25ml具塞锥形瓶中，精密加入衍生化溶液1ml和pH 8.2硼酸盐缓冲液4ml，置35℃水浴振摇13min后，放冷至室温。其它色谱条件同实施例2的检查方法，所测定的产品中致突变杂质肼含量为4.7ppm。该研究结果表明，冷盐酸可以快速阻滞或中止供试品溶液中卡比多巴与衍生化试剂的作用，否则可能使卡比多巴化学结构上肼基团仍可持续反应，影响样品检测结果。

[0114] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。