技术领域
[0001] 本发明涉及药物技术领域，具体为一种可实现荧光检测的PLGA和巨噬细胞膜包裹大黄素纳米颗粒及其制备方法和应用。
相关背景技术
[0002] 大黄素是从大黄中提取的活性成分,是一种天然蒽醌衍生物，具有抗炎、抑菌、抗氧化、调节免疫力、抗肿瘤等多种药理活性作用,是一种潜在的抗炎药物。但是大黄素具有水溶性差、生物利用率低的缺点,限制了其在临床上的应用。因此，如何提高其生物利用度和水溶性成为我们目前需要解决的问题。
[0003] CN 115518050 B公开了一种基于结肠靶向的大黄素纳米粒及其制备方法和应用，包括EM‑PLGA内核，EM‑PLGA内核上包裹有CS(壳聚糖)和PEC(果胶)，提高了大黄素(EM)的溶解性，促进药物吸收，提高生物利用度。具有结肠靶向性，口服可避免药物在上消化道的突释。
[0004] 大黄素是大黄中提取的活性成分，没有荧光吸收，在制备药物时，不便于通过检测方法检测活性成分的含量，不便于定量分析。
具体实施方式
[0022] 下面结合实施例对本发明做进一步描述。
[0023] 实施例1
[0024] 一种可实现荧光检测的PLGA和巨噬细胞膜包裹大黄素纳米颗粒的制备方法，按照如下方法制备：
[0025] (1)将大黄素与罗丹明B反应，制备罗丹明B标记的大黄素，反应条件为：在pH 8.5的碳酸氢钠缓冲液中，以罗丹明B的浓度为0.1mg/mL，大黄素的浓度为1mg/mL，反应时间为2小时，反应温度为室温。
[0026] (2)将罗丹明B标记的大黄素与PLGA共溶于有机溶剂中，通过乳化‑溶剂挥发法制备PLGA纳米包裹罗丹明B标记的大黄素的纳米药物，制备条件为：以罗丹明B标记的大黄素的质量分数为10％，PLGA的质量分数为20％，有机溶剂为二氯甲烷，水相为0.1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液，乳化时间为5分钟，乳化转速为10000rpm，溶剂挥发时间为24小时，溶剂挥发温度为40℃；
[0027] (3)将PLGA纳米药物通过透析膜滤除多余的罗丹明B标记的大黄素和PLGA，得到纯化的PLGA纳米药物，透析条件为：透析膜的截留分子量为10000Da，透析液为去离子水，透析时间为48小时，透析温度为室温.
[0028] (4)将纯化的PLGA纳米药物与巨噬细胞膜融合，制备巨噬细胞膜包裹PLGA纳米药物，融合条件为：以巨噬细胞膜的质量分数为10％，PLGA纳米药物的质量分数为90％，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，通过超声处理实现融合，超声时间为10分钟，超声功率为100W。
[0029] (5)通过荧光光谱仪检测巨噬细胞膜包裹PLGA纳米药物的荧光信号，以验证PLGA是否有效地包裹了罗丹明B标记的大黄素，检测条件为：荧光光谱仪的激发波长为550nm，发射波长为580nm，荧光信号的强度与罗丹明B标记的大黄素的含量成正比。
[0030] 实施例2
[0031] 一种可实现荧光检测的PLGA和巨噬细胞膜包裹大黄素纳米颗粒的制备方法，按照如下方法制备：
[0032] (1)将大黄素与罗丹明B反应，制备罗丹明B标记的大黄素，反应条件为：在pH 8.5的碳酸氢钠缓冲液中，以罗丹明B的浓度为1mg/mL，大黄素的浓度为10mg/mL，反应时间为2小时，反应温度为室温。
[0033] (2)将罗丹明B标记的大黄素与PLGA共溶于有机溶剂中，通过乳化‑溶剂挥发法制备PLGA纳米包裹罗丹明B标记的大黄素的纳米药物，制备条件为：以罗丹明B标记的大黄素的质量分数为12％，PLGA的质量分数为25％，有机溶剂为二氯甲烷，水相为0.1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液，乳化时间为5‑10分钟，乳化转速为12000rpm，溶剂挥发时间为24小时，溶剂挥发温度为40℃。
[0034] (3)将PLGA纳米药物通过透析膜滤除多余的罗丹明B标记的大黄素和PLGA，得到纯化的PLGA纳米药物，透析条件为：透析膜的截留分子量为10000Da，透析液为去离子水，透析时间为48小时，透析温度为室温。
[0035] (4)将纯化的PLGA纳米药物与巨噬细胞膜融合，制备巨噬细胞膜包裹PLGA纳米药物，融合条件为：以巨噬细胞膜的质量分数为8％，PLGA纳米药物的质量分数为80％，在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，通过超声处理实现融合，超声时间为20分钟，超声功率为100W。
[0036] (5)通过荧光光谱仪检测巨噬细胞膜包裹PLGA纳米药物的荧光信号，以验证PLGA是否有效地包裹了罗丹明B标记的大黄素，检测条件为：荧光光谱仪的激发波长为550nm，发射波长为580nm，荧光信号的强度与罗丹明B标记的大黄素的含量成正比。
[0037] 试验例
[0038] 试验具体设计：
[0039] 实验目的：采用对照验证细胞膜包裹后的纳米药物在效果上好于未包裹的药物。
[0040] 1.实验材料：大黄素、PLGA、巨噬细胞、培养基、药物浓度测定试剂等。
[0041] 2.实验步骤：
[0042] 步骤一：按试验例1,2制备巨噬细胞包大黄素PLGA纳米颗粒，并采用纯化水溶解制备成浓度为10ug/ml注射剂，
[0043] 步骤二：采用相同溶剂制备浓度为10ug/ml普通大黄素注射液
[0044] 步骤三：药物释放实验
[0045] ·将SD大鼠作为受试对象，均分成两组，定位实验组和对照组，分别注射本发明实施例1和2的纳米制剂以及大黄素注射液，按同浓度同计量对小鼠注射，在不同时间点(0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时)收集小鼠静脉血，并获取细胞上清液，测定药物浓度。
[0046] 步骤四：数据分析结果
[0047] 小鼠中大黄素血药浓度对比实验
[0048]
[0049] 注：“\”表示当前分析条件下未检出
[0050] 步骤五：药效评价实验组和对照组的小鼠在注射药物后，分别观察其体重、体温、食欲、精神状态等一般状况，以及腹部触诊、腹泻、便血等症状。在第7天和第14天，将小鼠处死，取出结肠组织，进行病理学和免疫组化检查，评估药物对结肠炎症的影响。同时，采用荧光显微镜观察药物在结肠组织中的分布情况，评估药物的靶向性。
[0051] 药效评价结果一般状况：实验组的小鼠在注射药物后，体重、体温、食欲、精神状态等均较对照组有明显改善，腹部触诊、腹泻、便血等症状也较对照组减轻或消失。病理学和免疫组化检查：实验组的小鼠在第7天和第14天的结肠组织切片显示，结肠黏膜层和肌层的炎症细胞浸润明显减少，结肠上皮细胞的完整性和排列有所恢复，结肠腔内的渗出物和坏死物减少，结肠黏膜损伤评分(DSS)较对照组显著降低。实验组的小鼠的结肠组织中，炎症因子：TNF‑α、IL‑1β、IL‑6等的表达水平较对照组显著下降，抗炎因子：IL‑10、TGF‑β等的表达水平较对照组显著上升。荧光显微镜观察：实验组的小鼠的结肠组织中，可见明亮的荧光信号，表明药物在结肠部位有较高的靶向性和积累性，而对照组的小鼠的结肠组织中，荧光信号较弱或不可见，表明药物在结肠部位的靶向性和积累性较差。
[0052]因子 对照组(n＝10) 实验组(n＝10) p值
TNF‑α(pg/ml) 120.3±15.2 80.4±12.6 0.001
IL‑1β(pg/ml) 90.2±10.4 60.3±8.9 0.002
IL‑6(pg/ml) 75.6±9.8 50.2±7.6 0.003
IL‑10(pg/ml) 30.4±5.6 45.6±6.4 0.004
TGF‑β(pg/ml) 25.3±4.8 40.5±5.2 0.005
[0053] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
