[0001] 本发明公开了DNMT3a作为围术期神经认知障碍靶点的应用，属于医药技术领域。

[0002] 围术期神经认知障碍（Perioperative neurocognitive disorders, PND）是老龄患者围术期最常见、也是最难处理的中枢神经系统并发症之一，主要表现为记忆力、注意力、定向力等认知相关能力的损害，严重者甚至出现人格改变和/或社会行为能力下降, 65岁以上老年手术患者PND发生率高达56%，使得患者死亡风险增加40%。随着我国人口老龄化程度持续加剧，老年人群手术数量与日俱增，PND的危害日趋严重，已成为亟待解决的临床难题。

[0003] 麻醉手术造成的创伤刺激是造成PND的主要原因，但由于麻醉药物种类繁多，不同手术造成的创伤各异，导致PND的发病及进展的机制仍没有被很好的解释。目前临床尚无PND有关筛查或诊断指标、更缺乏用于评估PND发生后疾病进展程度的生物标记物，给疾病的早期诊断及预防带来了极大地难度。另一方面，目前临床中对于PND的防治常采用的抗炎治疗或更换麻醉药物等方案，但尚未取得较好的效果，亟需针对PND有关的防治机制展开深入探索，找寻有效的治疗靶点，建立相关防治策略。

[0004] 本发明的目的就是提供一种PND有效的治疗靶点，从而提供一种解决PND的技术方案。

[0021] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

[0022] 实施例1. PND动物模型构建及评价：1.动物模型构建
采用2%异氟烷（氧流量1L/min）麻醉小鼠，待翻正反射消失后，将其仰卧位放置于恒温手术台（37 ℃）上，调整异氟烷浓度至1.4 %维持麻醉。使用医用胶布固定小鼠备皮消毒腹部皮肤铺无菌手术洞巾。延前正中线由上至下切开腹部皮肤（1.5±0.2 cm切口），分离两侧腹直肌进入腹腔暴露肠道组织。轻柔缓慢拉出小肠上段一个肠系膜血管支配范围下的小肠约3‑5cm，用提前于温箱（37℃）内加温过的生理盐水浸润无菌纱布，同时使用纱布包裹小肠组织。使用食指拇指轻轻揉搓小肠10min。揉搓结束沿肠道取出的方向按顺序回纳小肠。最后使用5‑0可吸收缝合线先后关闭腹腔和皮肤。腹部皮下注射0.1 mL 2 %利多卡因注射液，同时于腹部伤口涂抹适量利多卡因软膏镇痛。

[0023] 在模型成功建立后的1‑2周内，使用行为学实验评价小鼠围术期神经认知功能的变化。通过巴恩斯迷宫与情景恐惧实验评估老年小鼠术后学习能力、空间记忆能力与情景恐惧记忆等认知功能变化，提取麻醉手术前、术后1天、3天、7天海马组织内RNA及蛋白，分别利用RNA‑Seq技术、qPCR，Westernblot检测DNMT3a在PND动物及野生型动物脑组织中的差异表达。对比判断组织DNMT3a含量与认知功能障碍是否具有相关性。

[0024] 2. 巴恩斯迷宫巴恩斯迷宫是由一个高1m直径为1m的圆形平台、一个小鼠专用的逃生箱组成，用
于评估小鼠的学习能力以及空间记忆能力。分为适应、训练段和测试三个阶段。①适应阶段：使用5L透明玻璃烧杯将小鼠倒扣于迷宫中央，打开预先设定的强光和白噪音，使小鼠在烧杯内自由观察及探索3min后缓慢移动烧杯将小鼠引导进入逃生暗盒。②训练阶段：将小鼠置于迷宫正中央开启灯光与白噪音，允许小鼠自由探索迷宫3min。期间如果小鼠找到逃脱孔并进入逃生暗盒则关闭白噪音，如果小鼠在3min后仍未进入逃生暗盒，则引导其进入使。整个训练过程共计4天15轮（第1天3轮，第2 4天4轮)。③测试阶段：撤去逃生暗盒，将小~
鼠置于迷宫中央允许小鼠自由探索整个迷宫2min。使用Smart3.0软件及高清摄像头记录小鼠的运动轨迹，记录并分析小鼠平均进入逃生暗盒的潜伏期及各区域的探索时间等。

[0025] 巴恩斯迷宫实验显示，相比较于对照组，麻醉手术组的小鼠在训练过程中首次找到目标孔洞并进入逃生暗盒的潜伏期明显延长（图1），在训练第二天两组间数据差异最为明显(p＜0.01)，这表明手术麻醉造成老年小鼠术后学习速度显著降低。同时在测试阶段显示，相较于对照组，麻醉手术组小鼠处于目标孔洞所在象限的时间显著下降（图2），目标象限探索时间显著降低表现为空间记忆能力损伤。从小鼠运动的轨迹图可以看出，手术组小鼠更倾向于表现为一种散乱而随机的探索（图3）。以上结果表明麻醉手术显著影响老年小鼠术后的学习能力及空间记忆。

[0026] 3. 情景恐惧实验条件恐惧系统由一个长17 cm宽17 cm高25 cm的磨砂塑料箱及箱底部的电击装置
构成，用于评估小鼠的记忆能力。条件恐惧测试分为适应、训练、测试三个阶段。①适应期间将小鼠放置于恐惧箱内自由探索10min，不开启电击，同时记录小鼠的基础运动能力和活动状态。②训练阶段，将小鼠轻置于恐惧箱中，允许小鼠自由探索2min，于2min10s开始给予5次电击，记录小鼠期间的运动状态。③测试阶段：训练结束24h后将小鼠再次放入恐惧箱中，使其自由探索共计5min，期间不予小鼠进行任何电击或其他刺激。使用Anymaze软件及红外摄像头记录小鼠的运动状态，分析小鼠在不同阶段出现持续不动即Freezing状态时间及百分比。结果显示麻醉手术后小鼠环境相关的恐惧记忆显著受损，表现为Freezing 的总时间百分比显著降低（图4）。以上结果表明利用该剖腹探查手术模型，能够在18 月龄老年C57/BL6J 小鼠中诱导出稳定的术后认知功能损伤，并作为稳定的PND 模型以开展后续实验。

[0027] 4. Dnmt3a 的表达和检测提取麻醉手术前、术后1天、3天、7天海马组织内RNA及蛋白，分别利用qPCR，
Westernblot检测DNMT3a在PND动物及野生型动物脑组织中的差异表达。对比判断组织DNMT3a含量与认知功能障碍是否具有相关性。

[0028] 依据此模型在术前、术后1天、3天、7天对小鼠海马组织进行qPCR，Westernblot检测发现，如图5所示，发现7 个与DNA 甲基化修饰有关的基因mRNA 表达发生了变化(Dnmt1、Dnmt3a、Tet1、Tet2、Tet3、Zbtb4、Smug1)，DNA 甲基化Writer 基因Dnmt1、Dnmt3a，DNA 甲基化Eraser 基因Tet2 在手术前后发生了显著的变化，其中DNA 甲基转移酶3a（Dnmt3a）是变化程度最大，显著性最强的基因。mRNA水平在手术后的表达降低至术前的二分之一。使用Western Blot 从蛋白的层面对DNMT3a 进行了检测，与mRNA 层面相一致，在蛋白层面DNMT3a的表达也出现显著的降低（图6）。如图6所示，通过对术后1 天、3 天、7 天不同时间点海马组织蛋白进行检测我们进一步发现，相较于对照组，术后老年小鼠海马组织内的DNMT3a 蛋白表达含量在术后第1 及第3 天显著降低，以第一天降低最为显著，在术后7 天才逐渐恢复至术前的水平。在基因及蛋白层面DNMT3a表达显著降低且显著性最强，提示术后DNMT3a含量变化与PND密切相关。

[0029] 结果显示，DNMT3a含量降低是引起老年小鼠术后认知功能障碍的主要原因。

[0030] 实施例2. 敲低DNMT3a 表达诱导老年小鼠海马DNA 甲基化水平下降伴学习记忆损伤为进一步明确DNMT3a 的降低是否足以引起在老年小鼠认知损伤。我们首先使用
腺相关病毒敲低DNMT3a 以模拟麻醉手术诱导的DNMT3a 表达下降。根据Oliveira 等人曾报道过的干扰序列，我们构建了AAV‑U6‑ShRNA(Dnmt3a) ‑EGFP，具体实验流程如图7之A中所示。

[0031] 1.敲低腺相关病毒构建：选取含有绿色荧光报告基因EGFP干扰载体构建特异性敲低DNMT3a 表达的腺相关病毒：AAV‑U6‑ShRNA(Dnmt3a) ‑EGFP，目标病毒靶序列：ACGGGCAGCTATTTACAGAGC;对照病毒NC 序列：CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG。病毒滴度均大于等于1.0E+12。分装至‑80℃保存备用。

[0032] 2. 脑立体定位注射：首先我们在老年小鼠背侧海马CA1 区进行了立体定位注射，在病毒表达21 天后
首先通过免疫荧光染色初步评估了病毒注射位置的准确性以及转染效率，如图7之B 所示，腺相关病毒中包含的荧光蛋白准确的表达在背侧海马CA1 区域的神经颗粒细胞内。

[0033] 3. Dnmt3a 的表达和检测接着我们分别提取了注射对照病毒及敲低病毒小鼠的海马组织RNA 及蛋白,如图
8 所示（图8中，A. 上图为对照病毒组与shRNA 病毒组海马区DNMT3a 的表达含量的WB条带，下图为对应统计图（β‑actin 作为内参进行均一化，n=3/组）；B. 对照病毒组与shRNA 病毒组海马组织内DNMT3a mRNA 水平变化；C.对照病毒组与shRNA 病毒组海马组织内Dnmt1 与Dnmt3b 的 mRNA 水平变化（Gapdh 作为内参进行均一化，n=3/组）.EGFP：对照组；
shDnmt3a：敲低病毒组；*p<0.05，两组间比较使用各组间比较采用Student’s t 检验。），qRT‑PCR 实验提示该腺相关病毒能够成功降低海马组织Dnmt3a 的mRNA 表达约50%，并且其具有特异性并不改变其他两种亚型DNA甲基转移酶Dnmt1 和Dnmt3b 的mRNA 含量。在蛋白层面Western Blot 结果显示，该腺相关病毒能够有效降低DNMT3a 蛋白约60%。

[0034] 随后我们对成功表达了敲低病毒的动物进行免疫荧光检测。结果如图9的 A,B 所示：敲低背侧海马DNMT3a，可以显著降低CA1 区颗粒细胞层内5‑mC 的荧光强度。基于DNA 甲基化检测试剂盒同样发现，在老年小鼠中敲低DNMT3a，降低了背侧海马组织内整体DNA 甲基化5‑mC 的水平（图9之C）。图9中，A.敲低海马脑区DNMT3a 后的典型荧光图（红色：5‑mC,绿色：EGFP）;B. 荧光统计图；C.利用DNA 甲基化试剂盒检测敲低DNMT3a 后组织DNA 甲基化水平。EGFP：对照组；shDnmt3a：敲低病毒组；*p<0.05，两组间比较使用各组间比较采用Student’s t 检验。

[0035] 4. 动物行为学检测接着我们对动物的行为进行了检测。

[0036] （1）巴恩斯迷宫接着在巴恩斯迷宫中我们发现：相较于对照组主要表现为学习过程中找到目标洞
口的潜伏期时间延长（图10之A），特别是在学习阶段的第四天（对照组：27.57±7.89 VS 敲低组53.82±15.40，P＜0.001）。在测试过程中，敲低组小鼠在目标象限的时间明显缩短（图
10之B）。图10中，A.巴恩斯迷宫学习阶段第一次找到并进入逃生孔的潜伏期；B.巴恩斯迷宫测试阶段小鼠位于目标象限时间的百分比；C.巴恩斯迷宫测试阶段小鼠典型的运动轨迹热图；D. 条件恐惧实验小鼠环境关联的恐惧记忆能力。EGFP：对照组；shDnmt3a：敲低病毒组；
n=12/组，两组间比较使用各组间比较采用Student’s t 检验, 巴恩斯学习过程使用repeatmeasure Two‑way ANOVA 检验。（与EGFP 组相比*p＜0.05，**p＜0.01）。

[0037] （2）条件恐惧实验随后在条件恐惧实验中我们发现，相较于对照组，敲低海马脑区DNMT3a 的表达同样引起小鼠环境关联的恐惧记忆能力下降，表现为提取过程中不动时间（Freezing times）的百分比显著下降至对照组的二分之一（图10之D）。以上结果提示，海马脑区内DNMT3a 表达的下降对认知的维持发挥重要的作用。

[0038] 实施例3. DNMT3a 过表达提高脑内DNA 甲基化水平并逆转术后认知损伤本实施例构建了表达全长DNMT3a 的腺相关病毒AAV2/9‑CMV‑Dnmt3a‑3×FLAG‑
tWPA，以期通过表达DNMT3a 对术后认知功能障碍（PND）产生治疗效果。

[0039] 1.  过表达腺相关病毒构建：在确认小鼠DNMT3a 基因（ID: 13435，NM_001271753.2）序列（SEQ ID NO.1），选取含有特异性标签3×FLAG 及CMV 启动子载体构建DNMT3a 过表达腺相关病毒（DNMT3a过表达腺相关病毒载体构建图谱见图11）：AAV‑CMV‑Dnmt3a‑3×FLAG‑tWPA 及带有绿色荧光的对照病毒AAV‑CMV‑3×FLAG‑tWPA‑EGFP（病毒购买自和元生物技术（上海）股份有限公司）。（由于DNMT3a 序列过长无法携带荧光标签，因此
12
后续检验过程中检验病毒中的Flag 标签）病毒滴度均大于等于1.0E+ 。

[0040] 2. 脑立体定位注射：实验流程如图12之 A 中所示，首先我们在老年小鼠背侧海马CA1 区进行了AAV 
的立体定位注射，具体流程如下：
使用异氟烷吸入持续麻醉小鼠，后将小鼠固定至立体定位仪上，选取双侧至背侧
海马为注射目标（AP：‑1.50 mm，ML：±1.70mm，DV：‑1.75 mm），使用牙科电钻在颅骨钻孔，钻孔过程需缓慢以免损伤小鼠脑组织。调整注射泵注射速度将400 nl 的AAV‑Dnmt3a 或AAV‑
12
Con（滴度1×10 gc /μl）双侧注射至海马背侧，注射速度80nl/min 注射时间5min。注射完成后留针10min 防止病毒扩散至其他脑区。随后缓慢拔除注射针，缝合头部皮肤，使用利多卡因乳膏进行术后镇痛，将小鼠放入温箱内进行术后复苏。待病毒表达三周后进行后续实验。

[0041] 3. Dnmt3a 的表达和检测在病毒表达21 天后，首先通过免疫荧光染色初步评估了病毒注射位置的准确性
以及转染效率，如图12之 B （左图Scale bar：500 μm，右图Scale bar：100 μm）所示，腺相关病毒中包含的FLAG 标签准确的表达在背侧海马CA1 区域的颗粒细胞内。

[0042] 随后，我们提取了病毒注射后小鼠的海马组织并提取组织RNA，通过qRT‑PCR检测我们发现腺相关病毒过表达能够使得海马组织内Dnmt3a 的mRNA 水平升高平均20 倍（图13之B）。此外如图13之 B 所示，该病毒具有较高的特异性与选择性，并不影响其他两种亚型的DNA 甲基转移酶Dnmt1 与Dnmt3b 的表达。随后我们在蛋白表达层面基于Western Blot 对DNMT3a 的蛋白含量进行了检测，同样发现该腺相关病毒能够有效提高海马组织内DNMT3a 的蛋白含量近7 倍（图13之A），同时如图13之C所示，该载体并不影响其他两种DNA甲基转移酶的含量。以上结果表明该腺相关病毒成功提高海马组织内DNMT3a 蛋白的表达量。图13中，A. Western Blot 验证腺相关病毒对DNMT3a 蛋白表达的影响；B. qRT‑PCR 验证对照病毒与过表达病毒对海马DNMT3a 含量的影响；C. qRT‑PCR 验证对照病毒与过表达病毒对海马组织其他两种甲基转移酶Dnmt1，Dnmt3b 含量的影响；（n=3/组）。EGFP：对照病毒组；DNMT3a O.E：过表达病毒组； *p<0.05；**p<0.01，***p<0.001 两组间比较使用各组s
间比较采用Student’ t 检验。

[0043] 4. Dnmt3a 的过表达提高组织DNA 甲基化由于DNMT3a 是中枢神经系统内建立甲基化的关键酶，我们首先观察了过表达
DNMT3a 后对海马内DNA 甲基化水平的影响。明确病毒的表达效率后，我们分别对注射了过表达及对照病毒的老年动物进行了PND 造模。随后通过免疫荧光实验我们发现，DNMT3a 的过表达显著提高了注射位点海马CA1 区颗粒细胞内DNA 甲基化水平，表现为病毒表达位置细胞内整体5‑mC 的荧光强度显著提高（图14之A,B）。接着我们提取了两组小鼠海马组织DNA 并利用试剂盒对5‑mC 含量进行检测，结果显示，海马脑区DNMT3a 的过表达能够提高组织DNA 甲基化的含量约50%（图14之C）。

[0044] 5. Dnmt3a 的过表达对小鼠术后术后认知相关行为学的影响（1）巴恩斯迷宫
结果如图15 所示：首先，与Control‑EGFP 组相比过表达DNMT3a 并不会影响小鼠本身的学习能力，两组小鼠在巴恩斯迷宫训练过程中首次进入目标洞口的时间并无统计学差异；其次，Surgery‑EGFP 组相较于Control‑EGFP 组小鼠首次找到目标洞口的潜伏期显著延长，特别是在训练过程中的第二天及第四天，这表明腺相关病毒的注射并不影响PND 模型的稳定性。随后在注射了过表病毒的Surgery‑DNMT3a O.E 组中我们发现，与单纯手术组相比，术前海马脑区DNMT3a 的过表达能够显著提高老年PND 小鼠在巴恩斯训练过程中找到洞口的平均潜伏期（图15之 A）。随后在24h 后的巴恩斯测试阶段中相较于对照组，单纯手术组小鼠出现空间记忆的损伤，表现为在目标象限搜寻时间明显缩短。如图15之B,D 所示，术前过表达Surgery‑DNMT3aO.E 组小鼠相较于单纯手术组在目标象限搜寻时间显著延长。这些结果表明，术前海马脑区DNMT3a 的过表达能够显著恢复老年小鼠手术麻醉造成的学习能力以及空间记忆损害。

[0045] （2）条件恐惧实验接着，如图15之 C 在条件恐惧记忆实验中我们发现，相较于单纯手术组，术前
DNMT3a 的过表达能够显著调高小鼠环境关联的恐惧记忆能力，表现为Freezing 的百分比显著提高。

[0046] 实施例4. DNMT3a的检测基于DNMT3a基因表达和围术期神经认知障碍的相关性，因此对DNMT3a在基因水平
和蛋白质水平上的检测和监控将有助于掌握碎片化围术期神经认知障碍的发病进程、治疗评价和预后状况，因此本发明还建立了以DNMT3a基因作为围术期神经认知障碍标志物的诊断方法。

[0047] 1.全长转录组技术检测Dnmt3a在老年PND模型动物中与对照老年动物海马组织中的差异表达首先分别提取对照老年动物及PND模型老年动物小鼠海马组织RNA，利用逆转录酶
反应富集全长cDNA，并将PCR 接头添加到cDNA 链的两端，随后使用LongAmp Tag DNA 聚合酶进行cDNA PCR 延伸。接着对PCR 产物进行ONT 接头连接并利用Agencourt XP 磁珠纯化DNA，建立cDNA 文库连接测序接头后使用牛津纳米孔（Oxford Nanopore Technologie）三代测序平台进行全长转录组测序，随后使用RStudio V2021软件进行原始数据分析，过滤序列中的低质量序列、去冗余等方法质控后获取有效的基因转录定量，获取Dnmt3a转录本的
5’到3’高质量全长序列。如图16所示，老年PND小鼠海马组织与对照小鼠海马组织相比，存在7个与DNA甲基化修饰有关的基因mRNA表达发生了显著变化(Dnmt1、Dnmt3a、Tet1、Tet2、Tet3、Zbtb4、Smug1)可能与PND病理过程相关；其中Dnmt3a是变化最为显著的基因，提示其与PND病理进程密切相关。

[0048] 2. qRT‑PCR 检测Dnmt3a基因在PND模型小鼠和对照小鼠中的表达变化（1）检测样本及处理： 18月龄小鼠造模后进行双侧海马组织取材并提取 RNA。

[0049] （2）逆转录反应:使用逆转录试剂盒进行 RNA 的逆转录cDNA 的合成。首先根据 Nanodrop 检测的 RNA 浓度，配置 1000 ng的 RNA 样品，随后使用八连 PCR 管于冰上配置如下反应体系: 5× PrimeScriptRT Master Mix（PerfectReal Time）4 μL，1000 ng Total RNA根据实际浓度选取适合 μL数，RNase Free ddH2O补至逆转录反应体系20 μL。

[0050] （3）设计引物:以Dnmt3a为扩增靶基因使用PrimerBank 设计引物对于设计得出的序列使用NCBIBLAST 进行检验避免形成引物二聚体。上游引物：CTGTCAGTCTGTCAACCTCAC（SEQ ID NO.2），下游引物：GTGGAAACCACCGAGAACAC（SEQ ID NO.3）。

[0051] （4）qRT‑PCR反应体系配置：TB GreenPremix Ex Taq10 μL，上游引物（10 μM）0.4 μL，下游引物（10 μM）0.4 μL，ROX Reference Dye0.4 μL ，cDNA模板2 μL，灭菌水6.8 μL，总量20 μL。

[0052] （5）两步法 PCR 扩增标准程序:预变性阶段：95℃30秒，PCR反应阶段：（95℃5秒，60℃ 34秒）共40个循环，，溶解曲线阶段: 95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15 秒。

[0053] （6）待反应结束后观察溶解曲线及反应曲线，排除异常的样本或结果，收集样本的循环阀值(Cycle threshold，Ct)，利用‑△△Ct 法计算目的基因表达水平。

[0054] 对Dnmt3a以及其它靶基因的检测结果见图5, 可见。Dnmt3a的mRNA水平在手术后的表达降低至术前的二分之一。对Dnmt3a的核酸水平的检测将有助于对围术期神经认知障碍的诊断，并进行有针对性的治疗手段。

[0055] 3 . Western blot检测DNMT3a蛋白在PND模型小鼠和对照小鼠中的表达变化（1）检测样本及处理： 18月龄小鼠造模后进行双侧海马组织取材并进行蛋白提取；其中，蛋白裂解液配置比例为 RIPA 裂解液:PMSF: 蛋白磷酸化酶抑制剂=100:1:1，于冰上按照组织重量 1:10的比例，即10mg 组织加入 100μL 蛋白裂解液。

[0056] （2）BCA蛋白定量；根据定量浓度，使用RIPA 和5×上样缓冲液将每个样本都配置100μL浓度为2.5 g/mL的蛋白样缓冲液，混后于95℃煮沸 10 min 进行蛋白变性，保存于‑
20C冰箱待测。

[0057] （3）SDS‑PAGE电泳；每孔上样 25‑50mg(10‑20L)蛋白，先用 80V 进行恒压电泳，待蛋白样品电泳至下层胶，提高电压至 120V 进行后续电泳至各分子量目的蛋白充分分离。

[0058] （4）转膜；采用湿转法将蛋白转至PVDF膜，设定恒流模式电流300mA，根据分子量大小，转膜时间50‑90分钟。

[0059] （5）抗体孵育与成像，其中，一抗为抗DNMT3a抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠/羊抗兔抗体，使用Image Lab对各个泳道蛋白条带灰度值及体积进行定量分析。

[0060] 对DNMT3a其它靶蛋白的检测结果见图6, 可见术后老年小鼠海马组织内的DNMT3a 蛋白表达含量在术后第1及第3天显著降低，以第一天降低最为显著。对DNMT3a的蛋白水平的检测将有助于对围术期神经认知障碍的诊断，并进行有针对性的治疗手段。

[0061] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。