[0001] 本发明属于色谱技术领域，具体涉及一种水凝胶型细胞膜半制备色谱柱及其制备方法，以及在中药活性成分筛选、纯化和鉴定中的应用。

[0002] 细胞膜色谱法作为生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术，其将活性组织细胞膜固定在特定载体表面，以缓冲溶液为流动相，运用细胞膜特有亲和力，实现对中药复杂体系中的活性成分的分离和筛选。为了进一步满足中药活性成分快速筛选的要求，研究者更倾向于将新型细胞膜色谱制备技术与全二维色谱串联高分辨质谱技术相结合，以实现离线或在线对中药某种疾病的活性成分快速筛选和鉴定工作。更进一步，可运用分子对接技术或体内体外评价模式实现对特定活性成分的验证。但该方法忽视了对筛选后从中药中获得的整体活性成分的纯化及评价，无法真实反映被筛选出的天然存在中药的一组作用于机体的特定靶点的活性成分的药效，也不利于后续的药效和机理研究开展。

[0049] 为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

[0050] 实施例1

[0051] 本技术方案包括两部分，第一部分制备一种水凝胶复合基质为载体的细胞膜半制备色谱柱以构建纯化和筛选系统；第二部分提供一种半制备液相色谱结合水凝胶复合基质细胞膜色谱柱纯化系统用于中药活性成分的筛选和纯化。流程如图1所示。

[0052] 1一种水凝胶复合基质为载体的细胞膜半制备色谱柱

[0053] 制备方法如下：

[0054] (1)多孔硅球表面修饰：在SiO2多孔硅球(5μm, )表面修饰双键是细胞膜色谱柱模型成功与否的关键，以硅球为载体，分别经过0.2M HCl处理1h和1M NaOH处理2h后，二次水洗涤至中性，再用乙醇洗涤阴干后，用γ‑MAPS乙醇溶液(体积1:5)逐滴加入其中，反应24h，反应结束后将硅球离心下来，以二次水洗涤若干次，真空干燥，室温保存备用，以SiO2@MAPS表示。其表面引入双键为后续聚丙烯酰胺水凝胶提供聚合位点，制得聚合物包覆硅球表面不容易脱落。

[0055] (2)水凝胶聚合：控制影响水凝胶聚合反应的交联度、凝胶度、pH值和物料比，按T＝0.25％，C＝4.8％比例，称取192mg丙烯酰胺、9.6mg N,N‑二甲基酰胺和150mg SiO2@MAPS硅球，密闭分散于10mL磷酸盐缓冲液(pH＝6.2,0.02M)的反应瓶中，震荡混匀后，预组装l h，超声脱气，然后加入100μL 10％的过硫酸铵(APS)和25μL四甲基乙二胺(TEMED)引发聚合，室温磁力搅拌反应24h后,2000r/min离心，备用。得到水凝胶型硅胶载体，以SiO2@MAPS@hydrogel表示。其结合的细胞膜和网状空腔分别为后续中药组分筛选和富集提供靶点和高容量。

[0056] (3)细胞膜组装：取对数期生长的细胞，PBS清洗后离心，取沉淀，细胞计数为10×7
10 个。采用高压细胞破碎仪对细胞混悬液进行破碎；控制高压破碎细胞的时间大于等于
5s，将破碎的匀浆在倒置荧光显微镜下观察，在1000r/min条件下离心，其沉淀使用5倍体积的细胞裂解液混匀，反复冻融3次，加入上样缓冲液，高速冷冻离心，取上清液，使用丙烯酰胺凝胶电泳的方法分析，考察不同破碎时间的总蛋白量；而后取上清液在4℃，14000r/min条件下离心20min后，沉淀用生理盐水混悬，将细胞膜混悬液与水凝胶复合硅胶载体在真空震荡条件下反应10min，冰水浴磁力搅拌1h,4℃静置过夜，形成细胞膜固定相。通过测定细胞膜和水凝胶型载体结合前后的蛋白浓度差，确定载体与细胞破碎悬液中细胞膜含量结合的最佳值为0.15g:2.368mg，即15.79mg/g。表明分子间的氢键和静电作用，水凝胶的氨基与细胞膜蛋白的羧基可以充分结合，达到组装的效果。

[0057] (4)细胞膜色谱柱效评价：湿法装柱法将组装好的载体填充至5mm(L)×10mm(I.D.)半制备液相空柱，以阴性药(四环素)、阳性药(吉非替尼)为对象，对细胞膜色谱柱的专属性、重现性及稳定性进行考察；同时评估其的竞争置换能力。

[0058] 2一种半制备液相色谱‑水凝胶复合基质细胞膜色谱柱纯化系统及其应用[0059] 2.1半制备液相色谱‑水凝胶复合基质细胞膜色谱柱纯化系统：该系统由岛津20AR半制备液相色谱系统和岛津FRC‑10A馏分收集器组成，由岛津LabSolutions工作站控制，为第一维色谱。SiO2@MAPS@hydrogel‑co‑HUVEC/CMC半制备色谱柱(内径5×10mm，5μm)作为色谱柱。再通过离线方式与安捷伦1260系列液相色谱(HPLC)和G6520型四级杆‑飞行时间质谱仪(QTOF)相结合，由安捷伦MassHunter工作站控制，为第二维色谱。

[0060] 2.2该系统在中药活性成分筛选、纯化和鉴定中的应用：

[0061] (1)制备中药材提取液。

[0062] (2)将上述提取液上样至所述的半制备液相色谱‑水凝胶复合基质细胞膜色谱柱纯化系统中，采用一定的色谱条件，并设定馏分参数和程序，对所需要的中药活性成分进行筛选和纯化。

[0063] (3)将收集的馏分浓缩干燥，得到纯化的潜在活性成分，在HPLC‑QTOF系统中采用一定的色谱条件和设定的质谱参数对纯化后的潜在活性成分进行鉴定。

[0064] (4)对中药筛选和纯化的潜在活性成分进行药效验证和评价，一方面采用CCK8法分别测定SiO2@MAPS@hydrogel‑co‑HUVEC/CMC半制备色谱柱和空白色谱柱筛选和纯化的潜在活性成分对细胞的增殖抑制作用；另一方面采用不同浓度的潜在活性成分处理细胞，通过流式细胞术测定细胞凋亡率变化情况。

[0065] 本筛选和纯化系统为中药后续细胞实验、动物实验等提供纯化样品，为中药药效物质基础及作用机制研究提供实验依据。

[0066] 实施例2

[0067] 一、水凝胶型血管内皮细胞膜色谱载体的合成及表征

[0068] 水凝胶型血管内皮细胞膜色谱柱的合成路线如图2所示。

[0069] 1、水凝胶型血管内皮细胞膜色谱载体的合成

[0070] 1.1硅球表面修饰

[0071] SiO2硅球分别经过0.2M HCl处理1h和1M NaOH处理2h后，二次水洗涤至中性，再用乙醇洗涤阴干后，用γ‑MAPS乙醇溶液(体积1:5)逐滴加入其中，反应24h，反应结束后将硅球离心下来，以二次水洗涤若干次，真空干燥，室温保存备用，以SiO2@MAPS表示。将SiO2@MAPS按表1进行水凝胶聚合，得到水凝胶型硅胶载体，以SiO2@MAPS@hydrogel表示。

[0072] 1.2水凝胶复合硅球的凝胶度和交联度的优化

[0073] 按表1所示比例，称取SiO2@MAPS硅球，密闭分散于10mL磷酸盐缓冲液(PBS，0.02M)的反应瓶中，震荡混匀后，预组装l h，超声脱气，然后加入100μL 10％的APS和25μL TEMED引发聚合，室温磁力搅拌反应24h后,2000r/min离心，备用。将得到不同的复合硅球分散于细胞膜蛋白溶液，按BCA试剂盒步骤测定细胞膜蛋白浓度差，最终选择T＝0.25％，C＝4.8％，pH＝6.2时，载体质量为150mg为最优制备水凝胶型血管内皮细胞膜色谱载体的条件(即表1中的G方案)。

[0074] 表1水凝胶复合硅球材料聚合配比表

[0075]

[0076] 1.3血管内皮细胞膜载体组装

[0077] 采用对数期的血管内皮细胞为10×107个时，控制高压破碎细胞的时间大于等于5s，将细胞膜混悬液与水凝胶复合硅胶在真空震荡条件下反应，4℃静置过夜，形成细胞膜固定相。将该固定相采用湿法装柱法，以PBS为流动相装入5mm(L)×10mm(I.D.)的半制备色谱空柱中。

[0078] 2、水凝胶型血管内皮细胞膜色谱载体的表征

[0079] 2.1形貌表征

[0080] 为了更直观了解水凝胶型细胞膜色谱载体的形貌和结构，实验选择最佳配比的载体(G)制备阶段进行扫描电镜表征。由图3明显得知，SiO2硅胶呈现规整的球形，表面光滑，且单分散性好。与图3(A)相比，图3(B)中的SiO2@MAPS@hydrogel表面明显变得粗糙，且有明显的浅色光圈，由此可推测其表面已成功的包覆上聚丙烯酰胺水凝胶，且有大小孔径出现在硅球衔接处。从图3(C)可以看出SiO2@MAPS@hydrogel表面接上血管内皮细胞膜蛋白后，表面明显变得光滑，且有明显的浅色光圈，此外，原有的孔径已被细胞膜蛋白覆盖。

[0081] 2.2傅里叶红外光谱(FT‑IR)

[0082] 图4分别为SiO2硅球、SiO2@MAPS和SiO2@MAPS@hydrogel三种材料的FT‑IR谱图。图4‑1 ‑1 ‑1(a)中1092cm 和798cm 为Si‑O‑Si振动吸收特征峰。与图4(a)相比，图4(b)在1720cm 处出现一个吸收峰，为C＝O伸缩振动峰，说明γ‑MAPS已成功地修饰在SiO2的表面。此外，图4(c)‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
在1300cm ，1448cm ,1532cm ,1680cm ,3100cm 处出现新的吸收峰，其中1532cm 和‑1 ‑1
1448cm 为COCH2中(C—H)的面内弯曲和C—N弯曲振动，1680cm 为C＝O伸缩振动峰，‑1 ‑1
3100cm 为酰胺基对称伸缩振动特征吸收峰；而且1720cm 处的C＝O明显加强，这都属于丙烯酰胺基团的特征吸收峰。表明丙烯酰胺和N,N‑亚甲基双丙烯酰胺成功地包覆在SiO2表面。

[0083] 二、构建水凝胶型血管内皮细胞膜色谱模型

[0084] 1、细胞膜色谱技术的条件优化

[0085] 1.1细胞培养

[0086] 用含10％胎牛血清、含双抗的DMEM培养基培养人血管内皮细胞株，培养环境37℃，CO2浓度5％。取对数生长期的细胞进行实验。

[0087] 1.2细胞破碎条件的优化

[0088] 取细胞计数，PBS清洗后离心，取沉淀，采用高压细胞破碎仪对细胞混悬液进行破碎。将破碎的匀浆在倒置荧光显微镜下观察，其结果如图5所示，未破碎细胞量随破碎次数增加而减少。当破碎时间≥5s时，未破碎细胞量非常少，变化趋势不明显且稳定。

[0089] 破碎后匀浆在1000r/min条件下离心，其沉淀通过细胞裂解处理后，通过凝胶电泳成像，考察不同破碎时间的总蛋白量，再次验证了这一结论(图6)。以上结果说明，5s高压破碎为细胞破碎的最佳条件，而且增加破碎时间不会很明显的提高细胞膜得率。

[0090] 1.3装柱用细胞膜量的优化

[0091] 取破碎后匀浆上清液，4℃14000r/min离心20min后，沉淀重悬于生理盐水中，将混悬液与水凝胶复合硅胶在真空震荡条件下反应1h，4℃静置过夜，形成细胞膜固定相，然后离心，所得沉淀用PBS重悬并再次离心，洗去多余细胞膜，弃去上清。采用BCA蛋白浓度试剂盒对其吸附的细胞膜蛋白量的浓度差进行测定。如图7所示，当血管内皮细胞数从0增加至7
10×10个时，结合到0.15g载体上的蛋白量从0增加至2.368mg，当细胞数再次增加，结合于载体的细胞膜蛋白的绝对量不再增加，键合达到饱和。为保证重现性，实验中细胞膜蛋白总
7
量均控制在2.3mg左右，对应大约10×10个细胞。

[0092] 2、细胞膜色谱模型的专属性、重现性和稳定性

[0093] 2.1专属性

[0094] 为了验证细胞膜色谱模型的专属性，选择对细胞膜色谱模型无亲和力的四环素(TF)作为阴性药(无保留)，有亲和力的吉非替尼(GFT)作为阳性药(有保留)，分别以阴性药和阳性药为分离对象，采用制备的细胞膜色谱柱与空白载体柱对阴性药和阳性药进行分析。未结合细胞膜的色谱柱(空白载体柱)与已结合细胞膜色谱柱对比结果如图8所示，TF和GFT在未结合细胞膜的水凝胶色谱柱上均无保留且无法分离开；而在细胞膜色谱柱表现出对GFT的保留，使TF与GFT相分离。结果表明，构建的细胞膜色谱模型具有较强的专属性。

[0095] 2.2重现性

[0096] 考察制备的血管内皮细胞膜色谱模型的重现性，实验制备3批次细胞膜色谱柱。不同批次细胞膜色谱柱在37℃下平衡后，进样20μL GFT，GFT保留时间和峰面积的相对标准偏差值分别为6.3％和8.84％，表明该色谱柱具有较好的重现性。

[0097] 2.3稳定性

[0098] 为进一步考察构建的细胞膜色谱模型的稳定性，以GFT为对象，通过对同一根色谱柱，分别在日内0,1,3,5h和隔日(18h)进样。结果如图9所示，其保留时间变化不大，日内进样时，GFT的峰面积呈现逐渐变小的趋势，隔日进样时，对GFT的峰面积趋近于零。说明稳定性良好，需要实验在日内完成。

[0099] 3、细胞膜色谱模型竞争置换实验

[0100] 竞争置换实验采用LC20AR半制备液相色谱仪(岛津，日本)，色谱条件为：进样量100μL；波长254nm；流速0.2mL；流动相：A:10mM PBS溶液，B:含有1μM硝苯地平的10mM PBS溶液，C:含有1μM埃罗替尼的10mM PBS溶液。以埃罗替尼为阳性药、硝苯地平为阴性药，考察在流动相A、流动相B和流动相C切换后，GFT的保留时间变化情况。

[0101] 比较图10中a与b，当流动相由A切换为B时，GFT的保留时间降低；比较图10中a与c，流动相由A切换为C时，GFT的保留时间基本无变化。表明埃罗替尼和GFT两者在血管内皮细胞膜色谱柱结合的EGFR受体存在竞争性拮抗作用，而硝苯地平与GFT在细胞膜色谱中不存在竞争关系。构建的水凝胶型血管内皮细胞膜色谱模型具备一定的竞争置换能力，可用于后续中药组分筛选和纯化。

[0102] 4、半制备液相色谱‑水凝胶型血管内皮细胞膜色谱柱纯化系统及其应用[0103] 按实施例1中的2.1方法搭建纯化系统，用于青黛活性成分的筛选、富集和纯化研究。

[0104] 4.1青黛提取物中活性成分的筛选和纯化

[0105] 青黛经超声提取处理后，得到提取液，干燥后，制备出浓度为15mg/ml的青黛提取液，上样到SiO2@MAPS@hydrogel‑co‑HUVEC/CMC半制备色谱柱，按如下条件进行馏分收集：

[0106] 色谱条件：进样量1000μL；波长254nm；流速0.2mL；流动相：A:10mM PBS溶液，B:含有1μM埃罗替尼的10mM PBS溶液；梯度程序：0‑10min A:B＝100:0；10.01min‑30min A:B＝0:100。

[0107] 馏分参数：半峰宽2sec、斜率100uV/sec、水平1000000uV、馏份收集体积13mL和响应1sec。

[0108] 馏分收集程序：

[0109]

[0110] 结果如图11(A)所示，当保留时间为10min时，将流动相由A切换为B后，通过馏分收集程序，收集在10‑30min的馏分，浓缩干燥，备用。该色谱柱纯化后的得率平均约为8％。

[0111] 4.2青黛提取物中活性成分的鉴定

[0112] 按如下参数设定，通过离线方式，采用四级杆‑飞行时间质谱仪对纯化后的青黛活性成分进行鉴定。

[0113] 液相色谱条件为InetrSustain Swift C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速为‑11mL·min ，检测波长为290nm，进样量为20μL，按表2梯度洗脱。

[0114] 表2梯度洗脱程序

[0115]

[0116] 质谱参数：ESI+；离子扫描参数：100‑1000m/z；干燥气为氮气：10L·min‑1；温度：350℃；雾化气压力：40psig；毛细管电压：3500V。

[0117] 结果如图11(B)所示，分离纯化得到一组青黛潜在活性成分，包括L‑赖氨酸、氧化白藜芦醇、色胺酮、异鼠李素和靛玉红，其基本信息如表3所示。

[0118] 表3QTOF‑MS鉴定的潜在活性成分

[0119]

[0120] 4.3青黛提取物中筛选和纯化的活性成分的药效验证

[0121] 采用CCK8法测定三批平行制备的SiO2@MAPS@hydrogel‑co‑HUVEC/CMC半制备色谱柱和空白色谱柱筛选和纯化的潜在活性成分对K562细胞和HL‑60细胞的增殖抑制作用。空4
白组(只加完全培养基)、正常细胞组(以1.5×10个细胞/孔接种于96孔培养板中，分别加
4
入不同浓度样品及CCK8)，阴性对照组(加入1.5×10个细胞/孔和0.1％DMF)。每组设三个复孔，铺孔后放置于二氧化碳培养箱培养48h，每孔加入10μL CCK‑8，孵育2h，450nm波长下测定各孔吸光度。记录结果，计算细胞增殖抑制率。

[0122] 结果如图12所示，随着浓度增加，平行制备的三批色谱柱纯化的活性成分对K562细胞增殖有较强抑制作用，半抑制浓度(IC50)分别为35.15±0.2784、34.87±1.675和‑133.19±0.2524mg·L ，三批色谱柱未有显著差异；活性成分对HL60细胞增殖有较强抑制作‑1
用，三批色谱柱的IC50分别为45.69±2.869、44.61±1.796和46.54±2.047mg·L ，未有显著差异；而空白色谱柱纯化的活性成分对K562细胞和HL‑60细胞增殖抑制作用不显著。结果表明，相对于空白色谱柱，半制备色谱柱纯化的活性成分对K562细胞和HL‑60细胞具有强大的增殖抑制作用，且三批色谱柱的筛选和纯化性能稳定。

[0123] 为更进一步验证青黛活性成分的抗白血病作用，采用流式细胞术对半制备色谱柱纯化的活性成分进行细胞凋亡实验。结果如图13所示，相比空白组，随着浓度增加，在48小时，青黛活性成分对K562细胞和HL‑60细胞的凋亡作用逐渐增强，K562细胞凋亡率变化趋势分别从空白的4.4％，低浓度22.14％(P<0.001)，中浓度51.3％(P<0.001)到高浓度62.5％(P<0.001)；HL‑60细胞的凋亡率从空白的3.06％，低浓度8.4％(P<0.001)，中浓度32.7％(P<0.001)到高浓度39.4％(P<0.001)。结果表明，青黛活性成分极其显著增加K562细胞和HL‑60细胞的凋亡率，尤其对于K562细胞凋亡率效果更为明显(P<0.001)。采用SiO2@MAPS@hydrogel‑co‑HUVEC/CMC半制备色谱柱可以快速从青黛中分离制备出抗白血病的有效成分。

[0124] 需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。