本发明涉及发酵法生产甘油尤其是二步发酵生产工艺。 目前，甘油发酵常规工艺大规模工业化的关键困难是产品后提取， 如G.Martin所著的《The Manufacture of Glycerol》一书中 (Sec.III.PT)就明确记载有″从发酵法生产甘油的发酵液中提取甘油是 相当困难的″. P.Kishore等人在″Concentrationof Glycerol in Fermentation BathsbyReverse Osmosis″(J.Microbio，Biotech- nol.1987，2(1)，22-27)一文中亦认为：“从甘油发酵液中提取甘油是发 酵法生产甘油的瓶颈问题”，并提出采用反渗透法解决该问题的可能 性。 具体的说，发酵甘油的提取困难在于：发酵培养基的起始葡萄糖浓 度在25％左右，发酵后期当糖浓度降到1～4％，甘油浓度达到8～12％ 时，菌体由于葡萄糖效应而不再消耗残留糖生产甘油，却反过来将细胞 外的甘油作为二次代谢碳源消耗，发酵过程被迫就此停止，而转入后提 取，即过滤、浓缩和甘油蒸馏工序。甘油的沸点很高，蒸馏时残糖焦化 十分严重，导致甘油蒸馏十分困难甚至无法进行。为解决这一难题，已 提出了多种技术方案。诸如溶析提取法、转化分离法、载体蒸馏法。容 易发现，它们的出发点是共同的，即承认发酵后期残糖不能被菌体消耗 完全的现实，进而采取措施分离残糖与甘油，最终提取甘油，因此这些 现有技术是“治标”的工艺方案。 本发明的目的在于提出一个从根本上解决上述难题的方案，即通 过全新的二步发酵工艺，使菌体在发酵后期能将残糖消耗完全，并尽可 能少或不消耗甘油，将问题解决在提取工序之前的发酵工序。 本发明的技术解决方案是：第一阶段按常规工艺通气供氧发酵，当 残糖浓度降至1-4％甘油浓度升到8-12％时，菌体开始消耗甘油，停止通 气进行第二阶段厌氧发酵，直至残糖浓度降至0.2％以下时结束，发酵转 入后提取。 厌氧开始时可适当添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的营 养成分，加快降糖。 可将残糖包括单糖和低聚糖转变为酒精和少量甘油。 必要时可接入另一种耗糖酵母一起混合厌氧发酵。 二步发酵可与一步发酵在同一设备中完成。厌氧条件下，菌体将不 会消耗甘油却继续消耗残糖，并生产酒精。 甘油合成代谢途径由葡萄糖酵解反应的中间物磷酸二羟丙酮引出， 磷酸二羟丙酮在α-磷酸甘油脱氢酶(E1)的作用下，被还原为α-磷酸 甘油再由甘油磷酸化酶(E2)作用脱去磷酸生成甘油；而甘油的分解代 谢则从甘油激酶(E3)催化磷酸化生成L-α-磷酸甘油开始，此时L-α- 磷酸甘油面临三个可能的代谢途径，一是经甘油磷酸化酶(E2)作用或 甘油激酶(E3)的逆反应重新分解为磷酸和甘油；二是通过α-磷酸甘油 脱氢酶(E1)的逆反应生成磷酸二羟丙酮，再进入糖酵解途径；其三则为 被转运入线粒体内在线粒体磷酸甘油氧化酶(E4)作用下与氧反应，被 氧化为磷酸二羟丙酮，然后再转运出线粒体参与糖酵解反应。后两种代 谢会导致甘油的消耗。 甘油合成途径中的3-磷酸甘油脱氢酶 (E1)活力极高，在该酶作用下从磷酸二羟丙酮L-α-磷酸甘油的反应 是几乎不可逆的，因此，当甘油转入细胞内被菌体消耗时，必须先经甘 油激酶(E3)作用生成L-α-磷酸甘油，再转入线粒体内在3-磷酸甘油氧 化酶(E4)催化下与O2反应生成磷酸二羟丙酮，最后转入胞质内进 入糖酵解途径。在葡萄糖浓度较高时，甘油激酶(E3)的活力受糖代谢中 间产物的强烈抑制，菌体不会消耗甘油，只有当糖浓度低至一定值后， 对E3的抑制才被解除，菌体开始消耗甘油。若此时停气使细胞缺氧，一 方面厌氧导致酵母菌本来就不发达的线粒体萎缩，线粒体酶(E4)的活 性受到强烈抑制，另一方面厌氧使线粒体内从L-α-磷酸甘油到磷酸二 羟丙酮的反应因缺乏底物氧而无法进行。因此，后期采用厌氧发酵可以 保证菌体不将甘油作为代谢碳源消耗掉。相反，从代谢途径可知，厌氧 发酵时，还可能使部分残糖继续转变为甘油。 此外，厌氧条件下，酵母菌可通过糖酵解途径将残糖转变为有用产 物酒精，即两步发酵工艺可以副产酒精。 具体操作办法是：在发酵过程监测甘油和葡萄糖浓度，当甘油浓度 开始下降时，即停止第一阶段供氧发酵而转入第二阶段厌氧发酵，直至 残糖浓度被降至0.2％以下结束发酵转入后提取。第二阶段发酵的温度 与第一阶段发酵温度相同，PH值即为第一阶段结束时的自然PH值(3.2- 5.0)，其他条件与第一阶段发酵一致。厌氧开始时，可适当添加0.02- 0.2％含氮、磷的营养成分加快降糖。若发酵在实验室摇瓶上进行，则 在供氧发酵结束时将三角瓶口用封口膜封上，隔断空气，适当调低度振荡 速率，进行厌氧发酵。若发酵在发酵罐中进行，则在供氧发酵结束时停 止通空气，采用适当方式进行搅拌发酵。 必要时还可以接入另一种耗糖。酵母一起混合发酵，使残糖被消耗 完全，并转化为酒精，而甘油不被消耗，从而使得后续甘油蒸馏容易进 行。 本发明与现有发酵法生产甘油的技术相比，其优点如下： 1.现有技术立于酵结束以后再设法分离残糖与甘油，本发明 则通过采用第二阶段厌氧发酵将残糖完全消耗。 2.现有技术为分离残糖和甘油加复杂反应步骤(如残糖氧化)或 操作设备(如溶析法、树脂吸附)，使生产成本增加，本发明两步发酵可 在同一设备中完成，成本增加极少。 3.现有技术将残糖简单去除，本发明则将残糖(包括单糖和低聚 糖)转变为有用产品酒精和少量甘油，提高原料利用率。 以下结合工艺流程图做进一步说明： 将发酵原料注入发酵罐，灭菌冷却后接入油菌种并通气供氧：进行第一 次发酵，时间为60-101小时，当残糖浓度降至1-4％，甘油浓度升至8- 12％时，停止通气转第二阶段厌氧发酵，即本发明的二步工艺。二次发 酵与一次发酵可在同一设备中完成。厌氧发酵开始时可另加或不加耗 糖菌种：亦可适当添加0.02-0.2％含氮、磷及其它微量元素的营养成 分，以便加快降糖。在厌氧条件下菌体将不会消耗甘油。却继续消耗残 糖，9-35小时后停止厌氧发酵。经过滤器过后，进入离子交换器进行交 换，同时将产生的酒精进行回收。最后通过浓缩蒸馏等工艺生产出甘 油，甘油回收率约为95％。 实施例 本发明经过了多次实验验证。下表是其中的一些实验结果。其中第 1、2、4、5号实验是在摇床上500ml三角瓶中进行的，第3、6号实验 则是在7升机械搅拌罐中进行的。摇床供氧发酵和厌氧发酵的振荡频率 分别是140rpm和80rpm，搅拌罐供氧和厌氧氧发酵的转速分别是1200rpm 和300rpm。 例 号 初 糖 (％) 一次发酵 时间(hr) 厌氧开始时(％) 二次发 酵时间 (hr) 发酵终了时(％) 是否 加耗 糖菌 甘油 酒精 糖 甘油 酒精 糖 1 22.42 72 9.60 0 2. 32 9 8.20 0.78 0.04 是 2 22.41 72 9.60 0 2.32 9 8.70 0.92 0 是 3 21.32 72 7.65 0 2.85 18 7.43 1.83 0.25 是 4 19.05 78 9.70 0 2.74 40 9.42 1.24 0 否 5 20.56 78 9.92 0 1.42 40 11.2 0.65 0.18 否 6 26.74 101 8.41 0 5.69 35 9.06 2.55 0.48 否