一种雾化吸入用穿心莲内酯冻干脂质体制剂及其制备方法和 应用 技术领域： [0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种雾化吸入用穿心莲内酯冻干脂质体制剂及其制备方法和应用。 背景技术： [0002] 呼吸道感染为临床最常见的感染性疾病，具有反复发作的特点。呼吸道感染在临床中较为常见，一般有以下两种类型：其中，上呼吸道感染主要指鼻腔到咽喉部之间的急性炎症；而下呼吸道感染主要指支气管炎、肺炎、慢性支气管炎和支气管扩张等。绝大多数的上呼吸道感染是由于病毒侵袭所致，再之后出现细菌感染。下呼吸道感染主要是由支原体和衣原体以及细菌病毒等微生物感染所致。目前，治疗呼吸道感染的首选方案是先确定病原体，再有针对性的进行抗生素治疗。然而，由于抗生素的广泛使用，诸多呼吸道感染患者出现耐药性。因此，亟需开发新型、高效、无耐药性的抗炎药物。 [0003] 穿心莲内酯为从爵床科植物穿心莲中提取的半日花烷型二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的有效成分之一，具有清热解毒、凉血消肿的功效，对诸多感染性疾病有特殊疗效，被誉为天然抗生素药物。化学结构式如下所示： [0004] [0005] 穿心莲内酯能够抑制某些前炎症蛋白的表达，这些蛋白在基因中起到核因子(NF‑κB)连接位的作用，穿心莲内酯通过抑制NF‑κB与DNA连接发挥抗炎作用，进而降低前炎症蛋白如COX‑2的表达。穿心莲内酯一方面能够降低趋化肽(fMLP)所致的CD11b和CD18+的高表达，从而下调中性粒细胞表面的mac‑1高表达；另一方面抑制人中性粒细胞内蛋白激酶C(PKC)介导的活性氧自由基(ROS)生成和整合素Mac1的上调，从而减少中性粒细胞的黏附与穿壁过程，阻止其向炎症部位迁移。临床已用于上呼吸道感染、急慢性支气管炎、菌痢、脑膜炎、中耳炎、牙周炎、肺炎、子宫内膜炎及感冒发热等的治疗。 [0006] 穿心莲内酯味极苦，通常口服给药，可因苦极而致呕吐，且口服吸收效果差，体内生物利用度低，口服生物利用度仅为2.67％，极大地影响临床效果。在分子结构上引入亲水基团以增强水溶性，从而实现注射途径给药，目前应用于临床的品种有穿琥宁、炎琥宁、莲必治以及喜炎平等。但研究表明，这些结构修饰产物在化学稳定性和安全有效性均不及母体化合物，在临床使用过程中常有一定过敏反应和毒副作用发生，逐渐出现了过敏性休克、血小板减少等不良反应的案例。 [0007] 专利CN1568970公开了一种穿心莲内酯滴丸及其制备方法，解决了由于穿心莲内酯类成分疏水性较强而造成穿心莲内酯片溶出度低的问题，但滴丸常用的某些化学合成辅料不在国家的食品添加剂目录中，且滴丸口感较差，滴丸可使用的基质较少，而且仅适用于剂量较小的药物。载药量小等缺点严重影响了其大规模生产使用。 发明内容： [0008] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种以穿心莲内酯为主要有效成分的新药物剂型，雾化吸入用穿心莲内酯冻干脂质体制剂，该制剂使用前用合适溶剂如盐水溶解后，联合雾化器使用，由口鼻直接吸入，可在肺部聚集成较高浓度，进而可达到全身治疗的目的，避免了肝脏的首过效应及胃肠道的破坏与降解，并且大大减少了由肝肾对药物的代谢过程，极大降低了对患者的器官损伤。本发明将该药开发成脂质体雾化吸入制剂，解决了其在水中溶解度低的问题，提高了药物的生物利用度；冻干后有更好的苦味掩盖机制和更小的刺激性，弥补了目前国内市场上的空白，提供了一种穿心莲内酯新型安全有效的给药制剂及给药方式。 [0009] 脂质体是磷脂双分子层构成的囊泡，药物根据性质可包封于脂质膜中。脂质体由生物可降解的物质(磷脂和胆固醇)组成，对人体无毒，组织相容性好。脂质体与细胞膜亲和力强，可增加被包裹药物穿透细胞膜的能力。雾化吸入制剂是将药物的水溶液或混悬液经雾化器分散成悬浮于气体中的液滴或固体微粒，通过吸入的方式沉积于呼吸道和(或)肺部，目前广泛用于治疗多种呼吸道疾病，特别是哮喘的儿童和老年患者，以及不适用于其他吸入制剂者。治疗呼吸系统疾病时，雾化吸入用穿心莲内酯冻干脂质体可起到靶向定位的作用，可降低不良反应，安全性好且毒副作用小。 [0010] 一般地，穿心莲内酯脂质体雾化吸入制剂的制备可采用以下步骤： [0011] (1)制备穿心莲内酯脂质体 [0012] (2)制备穿心莲内酯脂质体雾化吸入制剂 [0013] 穿心莲内酯脂质体的制备方法选自薄膜分散法、逆相蒸发法、复乳法、熔融法、注入法、冷冻干燥法、表面活性剂处理法、离心法、前体脂质体法、加压挤出法、钙融合法，优选自薄膜分散法、逆相蒸发法、注入法、加压挤出法，更优选的是薄膜分散法。这些制备方法可以参考相关专业书籍和文献，由专业技术人员设计和操作完成。如果采用薄膜分散法制备脂质体，可以将穿心莲内酯与磷脂等膜材共同溶于有机溶剂，盛入烧瓶中，减压旋转蒸发，得到一层薄膜，然后加入水或适当缓冲液，进行振荡和超声，直至形成均匀的混悬液。 [0014] 穿心莲内酯脂质体中含有的脂质优选自卵磷脂、大豆磷脂、胆固醇、二月桂酞磷脂酞胆碱、二硬脂酞磷脂酞胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000(DSPE‑PEG 2000)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)，更优选自蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱，最优选自大豆卵磷脂和胆固醇。 [0015] 当采用大豆卵磷脂和胆固醇制备穿心莲内酯脂质体时，大豆磷脂和胆固醇的摩尔比例选自100:1～1:2，优选自20:1～1:1，更优选自10:1～2:1。 [0016] 穿心莲内酯脂质体中穿心莲内酯的量、辅料的量没有限制，只要满足穿心莲内酯雾化吸入的制剂要求和治疗要求就可以，本专利中优选的穿心莲内酯含量药脂比为1:4.8。 [0017] 本实验采用薄膜分散‑超声法制备穿心莲内酯脂质体。将大豆卵磷脂S‑100，胆固醇溶于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1,v:v)使其充分溶解，后加入穿心莲内酯，溶解完全后，旋蒸(45℃，100rpm,‑0.1MPa)，旋至底部形成均匀黄色薄膜；加入配置好的缓冲盐溶液(精密称1.3609g KH2PO4，0.28g NaOH，加200ml去离子水，用PH计测定PH为 7.2)，膨胀1h，后超声处理30s；微射流循环6次(25000psi)，使用马尔文测粒径；将样品分装于20mL西林瓶中。 [0018] 本发明提供的雾化吸入用冻干脂质体制剂为单剂量包装，使用过程便捷；可大大降低使用过程中的微生物污染和浪费，采用单次用药的剂量而避免了多剂量大包装所导致的反复量取、反复稀释配制易滋生微生物的弊端。本发明提供了一种现有技术所缺乏的药用剂量准确，药品质量优质、稳定，临床应用安全、简捷的新制剂及其制备方法。 [0019] 不同种类和不同浓度的保护剂对冷冻干燥过程中脂质体的保护机制和效果均有所不同。常用的冻干保护剂有：葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖等糖类；甘露醇、山梨醇、丙三醇等多元醇；聚氧乙烯脱水山梨醇，单油酸酯(Tween，80)等表面活性剂；甘氨酸、谷氨酸、精氨酸等；还有抗氧化剂、缓冲剂等其他类保护剂。更优选自甘露醇和蔗糖，其作为保护剂可较好阻止脂质体的聚集，使冻干品有良好的外观、粒子形态和稳定性，使药物泄漏明显减少。 [0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0021] (1)目前尚无针对儿童、老人或其他吞咽困难或注射困难患者使用的穿心莲内酯制剂，该雾化吸入制剂可以达到有效雾化颗粒要求，可经呼吸道清除，不会沉积在肺部，减少了肺部感染的发生率，不会刺激或损伤肺组织； [0022] (2)脂质体冻干后分散在盐水中雾化吸入，能极大掩盖药物苦味，降低了药物的刺激性，提高药物生物利用度，提高患者的顺应性； [0023] (3)本发明将脂质体制成冻干粉，并在配制及冻干全程中充氮气保护，避免脂质体长期放置或环境温度等改变而导致的氧化变色、水解、药物泄露等问题，稳定性提高； [0024] (4)复溶后脂质体快速分散均匀，且粒径及包封率较冻干前无显著变化，生物利用度高，疗效好； [0025] (5)本发明由于是吸入式的，药物直接到达靶器官肺，避免了肝脏的首过效应及胃肠道的破坏与降解； [0026] (6)本发明制备的穿心莲内酯脂质体，有稳固的膜载药，粒径可控且很小。即使使用加压和破碎也不漏药，说明药载在膜中而不是内水相中。 [0027] (7)本发明制备的穿心莲内酯脂质体，雾化吸入给药后能够明显减少模型动物肺灌洗液的中性粒细胞数量，抑制模型动物肺脏组织炎症。 [0028] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他形式的修改、替换或变更。 附图说明 [0029] 图1为本发明实施例1制备的穿心莲内酯冻干脂质体冻干前的透射电镜照片。 [0030] 图2为本发明实施例1制备的穿心莲内酯冻干脂质体复溶后的透射电镜照片。 [0031] 图3是穿心莲内酯冻干脂质体雾化粒经分布图。 [0032] 图4是空白组、模型组、阳性组(地塞米松注射液)、喜炎平注射液组、穿心莲内酯滴丸组、穿心莲内酯雾化10min组和穿心莲内酯雾化20min组的病理图片。 [0033] 图5是麻醉大鼠微渗析药代动力学测定的一般实验装置。 [0034] 图6是大鼠肺部和股静脉注射给予喜炎平后的浓度‑时间曲线。 [0035] 图7是大鼠肺部和股静脉注射给予穿心莲内酯脂质体后的浓度‑时间曲线。 [0036] 具体实施方法： [0037] 上述的一种穿心莲内酯冻干脂质体，100ml所述脂质体溶液由以下原料制成：穿心莲内酯231mg,固醇类物质155mg,磷脂2415.2mg,余量为PBS缓冲液。 [0038] 本实验采用薄膜分散‑超声法制备穿心莲内酯脂质体 [0039] 实施例1： [0040] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体，由穿心莲内酯脂质体溶液与冻干保护剂混合后冻干制成；100ml所述脂质体溶液由以下原料制成：穿心莲内酯115.5mg,固醇类物质 77.5mg,磷脂1207.6mg,余量为PBS缓冲液。所述冻干保护剂为甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的用量是每100ml脂质体混悬液用3.0g甘露醇，蔗糖的用量为每100ml脂质体混悬液用2.2g蔗糖；所述磷脂为S‑100大豆卵磷脂；所述固醇类物质为胆固醇。 [0041] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体的制备方法包括以下步骤： [0042] (1)将S‑100大豆卵磷脂1207.6mg，胆固醇77.5mg溶于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1,v:v)使其充分溶解，后加入穿心莲内酯115.5mg，溶解完全后，旋蒸(45℃，100rpm,‑0.1MPa)，旋至底部形成均匀黄色薄膜。 [0043] (2)向步骤(1)中加入配置好的缓冲盐溶液80ml(精密称1.3609g KH2PO4，0.28g NaOH，加200ml去离子水，用PH计测定PH为7.2)，膨胀1h，后超声处理30s。 [0044] (3)将所得样品使用微射流均质机在匀质压力25000psi下循环6次后，使用马尔文测粒径。将样品分装于20mL西林瓶中。 [0045] 实施例2 [0046] 本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于：所述磷脂为蛋黄卵磷脂E80、大豆卵磷脂、天然磷脂(注射级)PC‑98T、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中的一种。药物与所述磷脂的分子比于1:4‑1:20之间的一种；所述冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖中的一种或两种以上。 [0047] 实施例3 [0048] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体，由穿心莲内酯脂质体溶液与冻干保护剂混合后冻干制成；100ml所述脂质体溶液由以下原料制成：穿心莲内酯5.75mg,固醇类物质 6.34mg,磷脂100mg,余量为PBS缓冲液。所述冻干保护剂为甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的用量是每100ml脂质体混悬液用3.0g甘露醇，蔗糖的用量为每10ml脂质体混悬液用2.2g蔗糖； 所述磷脂为蛋黄卵磷脂E80；所述固醇类物质为胆固醇。 [0049] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体的制备方法包括以下步骤： [0050] (1)将蛋黄卵磷脂E80100mg，胆固醇6.34mg溶于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1,v:v)使其充分溶解，后加入穿心莲内酯5.75mg，溶解完全后，旋蒸(45℃， 100rpm,‑0.1MPa)，旋至底部形成均匀黄色薄膜。 [0051] (2)向步骤(1)中加入配置好的缓冲盐溶液100ml(精密称1.3609g KH2PO4，0.28g NaOH，加200ml去离子水，用PH计测定PH为7.2)，膨胀1h，后超声处理30s。 [0052] (3)将所得样品使用微射流均质机在匀质压力25000psi下循环6次后，使用马尔文测粒径。将样品分装于20mL西林瓶中。 [0053] 实施例4 [0054] 本实施例与实施例3相同，其中不同之处在于：所述磷脂为蛋黄卵磷脂E80、大豆卵磷脂、天然磷脂(注射级)PC‑98T、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中的一种。药物与所述磷脂的分子比于1:4‑1:20之间的一种；所述冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖中的一种或两种以上。 [0055] 实施例5 [0056] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体，由穿心莲内酯脂质体溶液与冻干保护剂混合后冻干制成；20ml所述脂质体溶液由以下原料制成：穿心莲内酯5.79mg,固醇类物质 6.37mg,磷脂100mg,余量为PBS缓冲液。所述冻干保护剂为甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的用量是每10ml脂质体混悬液用300mg甘露醇，蔗糖的用量为每10ml脂质体混悬液用204mg蔗糖；所述磷脂为S‑100大豆卵磷脂；所述固醇类物质为胆固醇。 [0057] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体的制备方法包括以下步骤： [0058] (1)将大豆卵磷脂S100100mg，胆固醇6.37mg溶于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1,v:v)使其充分溶解，后加入穿心莲内酯5.75mg，溶解完全后，旋蒸(45℃， 100rpm,‑0.1MPa)，旋至底部形成均匀黄色薄膜。 [0059] (2)向步骤(1)中加入配置好的缓冲盐溶液10ml(精密称1.3609g KH2PO4，0.28g NaOH，加200ml去离子水，用PH计测定PH为7.2)，膨胀1h，后超声处理30s。 [0060] (3)将所得样品使用微射流均质机在匀质压力25000psi下循环6次后，使用马尔文测粒径。将样品分装于20mL西林瓶中。 [0061] 实施例6 [0062] 本实施例与实施例3相同，其中不同之处在于：所述磷脂为蛋黄卵磷脂E80、大豆卵磷脂、天然磷脂(注射级)PC‑98T、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)中的一种。药物与所述磷脂的分子比于1:4‑1:20之间的一种；所述冻干保护剂为蔗糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖中的一种或两种以上。 [0063] 实施例7 [0064] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体，由穿心莲内酯脂质体溶液与冻干保护剂混合后冻干制成；100ml所述脂质体溶液由以下原料制成：穿心莲内酯50mg,固醇类物质110mg,磷脂500mg,余量为PBS缓冲液。所述冻干保护剂为甘露醇和蔗糖，其中甘露醇的用量是每 100ml脂质体混悬液用3.0g甘露醇，蔗糖的用量为每100ml脂质体混悬液用2.2g蔗糖；所述磷脂为天然磷脂PC98T；所述固醇类物质为胆固醇。 [0065] 本实施例的穿心莲内酯冻干脂质体的制备方法包括以下步骤： [0066] (1)将PC98T500mg，胆固醇110mg溶于250mL圆底烧瓶中，加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1,v:v)使其充分溶解，后加入穿心莲内酯50mg，溶解完全后，旋蒸(45℃，100rpm,‑ 0.1MPa)，旋至底部形成均匀黄色薄膜。 [0067] (2)向步骤(1)中加入配置好的缓冲盐溶液100ml(精密称1.3609g KH2PO4，0.28g NaOH，加200ml去离子水，用PH计测定PH为7.2)，膨胀1h，后超声处理30s。 [0068] (3)将所得样品使用微射流均质机在匀质压力25000psi下循环6次后，使用马尔文测粒径。将样品分装于20mL西林瓶中。 [0069] 实施例8：冻干工艺 [0070] 取适量上述脂质体混悬液于西林瓶中，加入冻干保护剂(甘露醇：蔗糖＝2:1)，2小时从室温降至‑40℃，‑40℃预冻维持4小时。抽真空至350mTorr并维持30分钟，2小时升至‑ 20℃并维持3小时，1小时升至‑10℃并维持3小时，2小时升至0℃并维持3小时，2小时升至20℃并维持2小时，即得穿心莲内酯冻干脂质体，4℃保存，备用。 [0071] 对本发明的穿心莲内酯冻干脂质体进行以下检测试验： [0072] 一、穿心莲内酯冻干脂质体的外观检测 [0073] 对本发明的穿心莲内酯冻干脂质体进行肉眼观察。可见冻干脂质体外观平整光滑，呈白色粉末，无皱缩和塌陷现象。穿心莲内酯冻干脂质体复溶后外观为半透明乳白色。 [0074] 图1为为本发明实施例1制备的穿心莲内酯冻干脂质体冻干前的透射电镜照片，图 2为本发明实施例2制备的穿心莲内酯冻干脂质体复溶后的透射电镜照片。由图1和图2可知，穿心莲内酯冻干脂质体冻干前和复溶后外形均圆整，结构均一。 [0075] 二、穿心莲内酯冻干脂质体包封率的考察 [0076] 色谱条件：以碳十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇：水＝45:55为流动相，检测波长223nm。进样量20μL，流速1mL/min。 [0077] 供试品溶液配制及测定法：取均质后本品100μL。加入1.9mL pH 7.2PBS。混合均匀后，加入3KD超滤管，3000rpm条件下离心30min。离心后取下层液体过滤膜后进液相测定。按下式计算包封率： [0078] C待测＝A待测×C标准品/A标准品 [0079] m游离＝(C待测×2ml)/(100μL×10‑3ml/μL)×V总 [0080] 包封率(％)＝(M总‑M游离)/M总×100％ [0081] 表1.穿心莲内酯脂质体包封率测定结果 [0082] [0083] [0084] 三、穿心莲内酯脂质体雾化吸入给药的粒经分布 [0085] (1)实验方法 [0086] 雾化器与雾化压缩机连接，确保在压缩机特定的气体流速和压力下，雾化器不和雾化压缩机脱离，在雾化器中装入药物穿心莲内酯脂质体溶液。激光衍射仪进口处连接，出口处连接外部过滤器，外部过滤器连接真空泵。入口处连接流量计，打开真空泵，调节入口处气体流速稳定到15L/min(±5％)。调节好气体流速后，在计算机上打开软件(Spraytec software version 3.20，Malvern)并设置好SOP(测试模式：连续模式；颗粒的折光系数： 1.33；分散介质：空气；折光系数：1.00)，然后开始测试光路背景。待背景测试合格后将雾化器与induction port的入口端紧密连接。然后开启压缩机进行雾化并测试药物粒子的粒径，到气溶胶浓度快速下降时停止测试，关闭雾化器。在分析过程中，持续监测粒径分布(d10、d50、d90)和激光强度。 [0087] (2)实验结果 [0088] 结果显示雾化粒经：Dv(10)＝1.088(μm)，Dv(50)＝3.826(μm)、Dv(90)＝9.074(μm)，Span＝2.087，结果见表2，图3。 [0089] 表2.穿心莲内酯脂质体雾化吸入后粒经分布 [0090] [0091] 四、穿心莲内酯脂质体雾化吸入给药的体内抗炎实验 [0092] (1)实验材料 [0093] Wistar大鼠，雄性，70只，体重170‑190g，SPF级。 [0094] 穿心莲内酯脂质体冻干粉，注射前分散至生理盐水中。 [0095] 喜炎平注射液：江西青峰药业有限公司生产，批号：2019101803。 [0096] 穿心莲内酯滴丸：天士力医药集团股份有限公司，批号：190606。 [0097] 地塞米松磷酸钠注射液：贵州天地药业有限责任公司生产，批号：19110802A。 [0098] 三氯乙醛水合物：上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10636049。 [0099] 甲醛：福晨(天津)化学试剂有限公司生产，批号：20190920。 [0100] 生理盐水：石家庄四药有限公司生产，批号：192110。 [0101] (2)实验方法 [0102] Wistar大鼠，适应性喂养5天，根据体重随机分为7组，空白组、模型组、阳性(地塞米松注射液组)、喜炎平注射液组、穿心莲内酯滴丸组、穿心莲内酯雾化10min组、穿心莲内酯雾化20min组，每组10只。各组给药剂量地塞米松注射液组静脉给予(3.6mg/kg)，雾化各组分别吸入穿心莲内酯脂质体冻干粉雾化吸入溶液10min、20min。除空白组外，其他组分别吸入LPS溶液(4mg/mL)15min进行造模，造模后立即给药，连续三天，第四天早上即第三次造模后15h各组进行第四次给药，给药后1小时(造模后16h)，用10％的水合氯醛麻醉(0.35mL/ 100g)，腹主动脉采血，暴露胸腔，右叶结扎，用生理盐水灌洗左肺，缓缓打入，静止平衡30s，缓缓抽出，1mL/次，灌洗2次，灌洗速度2mL/min(30s/次)，合并灌洗液。Wright‑Giemsa染色法观察肺灌洗液中炎症细胞(巨噬细胞、中性粒细胞)含量。左肺用10％甲醛固定，室温保存，待进一步病理检测，制备石蜡切片供组织学检查。 [0103] (3)实验结果 [0104] 3.1对大鼠急性肺炎肺泡灌洗液白细胞总数结果显示：与空白对照组比较，模型组白细胞总数显著升高(P<0.001)，与模型组比较，阳性对照组能够显著降低肺泡灌洗液中白细胞总数(P<0.01)。其余各组白细胞总数均有降低趋势。白细胞分类结果显示，与空白对照组比较，模型组中性粒细胞总数显著升高(P<0.01)，阳性对照组、喜炎平静脉注射组、穿心莲内酯雾化10min组及雾化20min组均能显著降低肺泡灌洗液中中性粒细胞数(P<0.05或P< 0.01)，滴丸组中西粒细胞数具有降低趋势。结果见表3。 [0105] 表3.对大鼠急性肺炎肺泡灌洗液白细胞总数及中性粒细胞 [0106] [0107] [0108] 注：与空白对照组比较**P<0.01，***P<0.001；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01。 [0109] 3.2组织病理结果显示：空白对照组肺泡和支气管上皮结构完整。模型组肺脏可见局灶或弥漫性肺泡上皮变性坏死伴脱落，炎细胞浸润(中性粒细胞和单核细胞为主)等改变。其中，11#和13#动物肺泡上皮弥漫性脱落，重度，仅个别动物(12#、20#等)可见轻度的局灶性化脓性坏死，病变较轻，整体上呈现出较严重的肺脏损伤，提示造模成功。 [0110] 上皮损伤、模型组、阳性对照组、静脉注射组、CXL滴丸组、CXL雾化10min组、CXL雾化20min组模型组上皮细胞坏死脱落发生率分别为：8/10、0/10、9/10、10/10、8/10、8/10。从损伤程度来来看，模型组2只动物为重度肺泡上皮坏死脱落，阳性对照组未见肺泡上皮坏死脱落，模型组、静脉注射组、CXL滴丸组、CXL雾化10min组、CXL雾化20min组中度肺泡上皮坏死脱落的发生率为6/10、0/10、0/10、2/10、0/10，与模型组相比，各治疗组均可减轻上皮细胞的损伤程度，其中静脉注射组、CXL滴丸组、CXL雾化10min组、CXL雾化20min均以轻微肺泡上皮坏死脱落为主，治疗效果相当。CXL雾化20min略优于CXL雾化10min组和静脉注射组。 [0111] 炎细胞浸润。模型组、阳性对照组、静脉注射组、CXL滴丸组、CXL雾化10min组、CXL雾化20min组中性粒细胞浸润在全部动物肺脏出现，但从程度上来看，模型组中性粒细胞浸润发生率为10/10，均为中度以上，其他各组主要为轻度以下，中度中性粒细胞浸润发生率为8/10、0/10、0/10、1/10、0/10、4/10。可见，治疗组可不同程度减轻炎细胞浸润的程度，其中，静脉注射组和CXL雾化10min组炎细胞浸润均为轻度改变，多数动物肺泡上皮坏死脱落轻度以下，治疗保护较好，且与阳性对照组相当。 [0112] 局灶性化脓性炎。模型组、静脉注射组、CXL滴丸组、CXL雾化10min组、CXL雾化 20min组局灶性化脓性坏死发生率为2/10、1/10、3/10、1/10、3/10，阳性药组未见局灶性化脓性坏死。结果见表4，图4。 [0113] 综上，穿心莲内酯雾化吸入给药后能够明显减少模型动物肺灌洗液的中性粒细胞数量，抑制模型动物肺脏组织炎症，结果提示其对于LPS诱导的肺炎模型具有明显的抑制作用。从上皮损伤，炎细胞浸润，化脓性炎等反应肺脏病变程度等指标进行综合对比来看，在中性粒浸润病理改变上，CXL雾化20min组治疗效果略好于其它各组，与阳性药物组相当。 [0114] 表4.主要病变统计 [0115] [0116] 注：根据病变的分布、严重程度和形态学特点使用合适的诊断术语并将病变分为4个等级：轻微、轻度、中度、重度，分别用+、++、+++、++++表示 [0117] 五、穿心莲内酯脂质体的体内药代动力学研究 [0118] (1)实验材料 [0119] Wistar大鼠，沈阳药科大学实验动物中心 [0120] 穿心莲内酯脂质体冻干粉，注射前分散至生理盐水中 [0121] 喜炎平注射液：江西青峰药业有限公司生产，批号：2019101803 [0122] 喜炎平注射液：江西青峰药业有限公司生产 [0123] 微渗析液(Ringer’s solution)：氯化钠147mM，氯化钙1.3mM，氯化钾4.0mM[0124] 抗凝葡萄糖溶液(ACD)：3.5mM枸橼酸，7.5mM枸橼酸钠和13.6mM葡萄糖 [0125] (2)实验方法 [0126] 血液探针的植入：大鼠腹腔注射乌拉坦(按1.4g/kg体重计)麻醉，必要时给予追加剂量，使之在整个实验过程保持麻醉状态。将大鼠仰卧固定于实验板上，红外灯光照以维持其正常体温(约37℃)。剥离颈部皮肤和肌肉，分离出大鼠左侧颈静脉，在上面开一小口，将探针向心脏方向插入约1.5cm,迅速结扎，防止血液流出。 [0127] 肺部探针的植入：大鼠麻醉后仰卧，颈部中线1.5cm小切口，分开筋膜后，可见相对较大的甲状腺(300g大约1cm直径大小)，甲状腺容易与周围游离，切不可碰伤，以避免出血。 再用血管钳分开颈前肌，即见白色、有环形软骨的气管。一手固定气管，另一手用尖刀挑开前面1mm小口，沿左支气管方向将微渗析探针植入左肺叶的肺粘膜层中，最后用黏胶带将露在气管外的微渗析探针部分固定在大鼠皮肤上。 [0128] 反向渗析法测定探针的体内回收率：待微渗析探针植入大鼠颈静脉和肺后，血液渗析和肺部渗析依次用浓度为100,500和2500ng/ml穿心莲内酯ACD溶液和穿心莲内酯Ringer溶液进行灌注(Cperfusate)，流速4μg/min，收集各个灌注流浓度下的微渗析液样品，每个浓度收集3次，测定微渗析液中药物浓度(Cdialysis)。更换灌注液后，至少开泵冲洗30min才开始收集下一个样品。体内回收率按下述公式计算：Rinvivo＝1‑Cdialysis/Cperfusate。经校正后的血液微渗析探针的体内回收率为5.57％，肺微渗析探针的体内回收率为5.88％。 [0129] 样品采集：探针植入后，开启微量注射泵，分别以空白ACD和Ringer对血液和肺部微渗析探针进行灌注，流速3μg/min，至少平衡1.0h后开始给药。大鼠肺部给穿心莲内酯脂质体溶液，大鼠股静脉注射给喜炎平注射液，给药剂量为90mg/kg。大鼠在肺部及股静脉给药后立即开始收集渗析液，每15min采集一次，采集时间为12小时。血液或ELF中游离的穿心莲内酯浓度(Cu)通过下述公式计算：Cu＝Cdialysis/Rinvivo [0130] (3)实验结果 [0131] 大鼠股静脉注射给予喜炎平注射液后，不同时刻血液中游离穿心莲内酯的浓度值见表5，不同时刻ELF中游离穿心莲内酯的浓度值见表6，浓度时间曲线见图6。 [0132] 表5.静脉注射喜炎平注射液不同时刻血液中游离穿心莲内酯浓度值 [0133] [0134] 表6.静脉注射喜炎平注射液不同时刻ELF中游离穿心莲内酯浓度值 [0135] [0136] 大鼠肺部给予穿心莲内酯脂质体雾化吸入剂后，不同时刻血液中游离穿心莲内酯的浓度值见表7，不同时刻ELF中游离穿心莲内酯的浓度值见表8，浓度时间曲线见图7。 [0137] 表7.肺部给药穿心莲内酯脂质体不同时刻血液中游离穿心莲内酯浓度值[0138] [0139] 表8.肺部给药穿心莲内酯脂质体不同时刻ELF中游离穿心莲内酯浓度值 [0140] [0141] [0142] PLI＝(AUEELF/AUCBlood)i.t/(AUEELF/AUCBlood)i.v [0143] PLI值大于1表明具有肺定位性，PLI值越大，肺定位作用就越大，局部作用就越强。 由结果可知，肺部给药后，穿心莲内酯脂质体的AUCELF为481.9mg.h/mL、AUCblood为 16.71mg.h/mL，与静脉注射喜炎平相比都具有显著性的差别(p<0.05)。这说明肺部给药后，增加了穿心莲内酯在ELF中的浓度，穿心莲内酯脂质体雾化吸入剂的PLI远远大于1，有显著的肺定位性。 [0144] 利用统计矩计算血液和ELF中穿心莲内酯的药动学参数，并用SPSS13.0统计软件对各组参数进行方差分析(One‑Way ANOVA),用Newman‑Keal post hoc命令进行比较。MRT代表穿心莲内酯在肺黏液中的平均滞留时间，穿心莲内酯脂质体雾化吸入剂显著地增加了穿心莲内酯在肺粘液中的滞留时间，减小了穿心莲内酯的清除率和表观分布容积，进而增加了单位剂量的AUC和Cmax(p<0.01)，具有明显的缓释作用。