[0001] 本发明属于精细化工合成技术领域，特别是涉及一种稳定同位素标记的展青霉素及其合成方法。

[0002] 展青霉素又称展青霉毒素、棒曲霉素、珊瑚青霉毒素，它是一由曲霉和青霉等真菌产生的一种次级代谢产物，首先在霉烂苹果和苹果汁中发现，广泛存在于各种霉变水果和青贮饲料中。毒理学试验表明，展青霉素具有影响生育、致癌和免疫等毒理作用，同时也是一种神经毒素。展青霉素具有致畸性，对人体的危害很大，导致呼吸和泌尿等系统的损害，使人神经麻痹、肺水肿、肾功能衰竭。

[0003] 稳定同位素稀释质谱法(Isotope Dilution Mass Spectrometry，IDMS)利用同位素内标能准确定量分析展青霉素。但是，目前市场上的稳定同位素标记的展青霉素产品主要来自国外，其制备方法也未见报道。非同位素标记的展青霉素的合成文献报道的也较少，文献Tetrahedron Letters，1995，36(40)，7175‑7176.报道了展青霉素的全合成，合成路线如下式：

[0004]

[0005] a)BF3·Et2O(0.6equiv)，CH2Cl2，‑78℃，10h(94％).b)t‑BuCOCl(1.5equiv)，DMAP(0.5equiv)， py，0→25℃，24h(91％).c)aq.6N HCl，MeOH，25℃，4h(90％).d)TEMPO(0.01equiv)，KBr (0.1equiv)，NaOCl(1.1equiv)，pH≈9，CH2Cl2，0℃(97％).e)BCl3(2equiv)，CH2Cl2，‑78℃then Et3N(1equiv)/MeOH(79％).f)DBU(2equiv)，CH2Cl2，0→25℃，45min(70％).

[0006] 作者以双保护呋喃衍生物和苄氧基乙醛为原料，经过向山反应、和特戊酰氯的酯化反应、羟基脱保护反应、羟基氧化成醛基反应、脱苄基反应、羟醛缩合反应和脱酰基反应得到了展青霉素，但是经过实验发现，该合成方案存在两个问题：一、双保护呋喃衍生物结构不稳定，酮羰基的保护基团极易脱去，导致向山反应无法进行；二、羟基氧化成醛基反应，需要控制pH≈9，不易操作。本发明根据此方案并修改完善存在的问题，设计合成了稳定同位素标记的展青霉素。

[0050] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但不应理解为是对本发明的限制。

[0051] 实施例

[0052] 1：化合物1的合成

[0053] 将丙三醇‑13C3(31.5mmol，3g)溶解在二氯甲烷(150mL)和吡啶(20mL)混合溶剂中，依次加入4‑二甲氨基吡啶(3mmol，370mg)和三苯基氯甲烷(63mmol， 17.5g)，在20～30℃温l度下，搅拌反应24小时，浓缩后柱层析分离纯化，以85％的产率得到化合物1，H‑NMR(400MHz,CDC13)δppm 2.26～2.30(dm,J＝2.6Hz,lH), 3.25(dm,J＝142.9Hz,lH),3.30(dm,J＝143.1Hz,2H),3.95(dm,J＝142.9Hz,lH), 7.20～7.40(m,30H)。

[0054] 2：化合物2的合成

[0055] 将化合物1(27.6mmol，16g)溶解在二氯甲烷(400mL)中，加入重铬酸吡啶鎓(47.8mmol，18g)，在20～30℃温度下，搅拌反应24小时，浓缩后柱层析分离纯化，以72％的1
产率得到化合物2，H‑NMR(400MHz,CDCl3)δppm 3.97(ddt,J＝4.6, 7.0,143.0Hz,4H),7.22～7.39(m,30H)。

[0056] 3：化合物3的合成

[0057] 将化合物2(20mmol，11.5g)溶解在二氯甲烷(500mL)中，加入对甲苯磺酸 (2.6mmol，500mg)，在20～30℃温度下，搅拌反应24小时，减压旋蒸去除二氯甲烷，以88％的产率得到化合物3，直接进行下一步反应。

[0058] 4：化合物4的合成

[0059] 将化合物3(17mmol，1.6g)溶解在吡啶(20mL)中，加入乙酸酐(34mmol， 3.5g)，在20～30℃温度下，搅拌反应3小时，减压旋蒸去除吡啶后柱层析分离纯化，以96％的产率得
1
到化合物4，H‑NMR(400MHz,CDCl3)δppm 2.17(s,6H),4.75(s, 4H)。

[0060] 5：化合物5的合成

[0061] 将三苯基膦(38mmol，10g)溶解在甲苯(50mL)中，以1～2滴/秒的速度滴加溴乙酸13
乙酯‑ C2(23.7mmol，4g)，滴加完成后，在20～30℃温度下，搅拌反应16 小时，减压旋蒸去除甲苯，加入50mL二氯甲烷溶解，再加入10wt％氢氧化钠溶液，调节pH≈10，搅拌分层，分出
1
二氯甲烷相，无水硫酸钠干燥后，减压旋蒸去除二氯甲烷，以87％的产率得到化合物5，H‑NMR(400MHz,CD3OD)δppm 1.06(m,3H), 2.88(s,1H),3.96(m,2H),7.56～7.42(m,9H),7.69～7.62(m,6H)。

[0062] 6：化合物6的合成

[0063] 将化合物4(17mmol，3g)和化合物5(23mmol，8g)溶解在甲基叔丁基醚(50mL) 中，升高温度至50～60℃，搅拌反应8小时，然后在20～30℃温度下搅拌反应12小时，减压旋蒸1
去除甲基叔丁基醚，柱层析分离纯化，以83％的产率得到化合物6，H‑NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.30(t,J＝7Hz,3H),2.08(s,3H),2.12(s,3H),4.20(q, J＝7Hz,2H),4.72(s,2H),
5.26(s,2H),6.00(quint,J＝1.6Hz,1H)。

[0064] 7：化合物7的合成

[0065] 将化合物6(14mmol，3.5g)溶解在甲醇(30mL)中，以1～2滴/秒的速度滴加乙酰氯(127mmol，10g)，滴加完成后，在20～30℃温度下，搅拌反应4小时，减压旋蒸去除甲醇，柱层1
析分离纯化，以87％的产率得到化合物7，H‑NMR(400MHz, CDCl3)δppm 2.55(t,J＝5Hz,
1H),4.60(d,J＝5Hz,2H),4.88(s,2H),6.04(t,1H)。

[0066] 8：化合物8的合成

[0067] 氮气保护下，将化合物7(12mmol，1.4g)溶解在干燥无水的二氯甲烷(30mL) 中，温度降至0～5℃，加入三乙胺(18.5mmol，1.87g)，在0～5℃温度下保持20分钟，以1～2滴/秒的速度滴加叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯(20mmol，5.3g)，滴加完成后，升高温度至20～30℃，搅拌6小时，加入10mL水，二氯甲烷萃取，有机相浓缩后柱层析分离纯化，以83％的产率得到化合物8，立刻进行下一步化合物10 的合成反应。

[0068] 9：化合物9的合成

[0069] 将氢氧化钾(8.05mmol，452mg)加入到乙二醇‑13C2(16.1mmol，1g)中，在 20～30℃温度下，搅拌40分钟使固体溶解，以1～2滴/秒的速度滴加苄溴(16.1mmol， 2.7g)，滴加完成后，在20～30℃温度下，搅拌8小时，柱层析分离纯化，以80％的产率得到2‑苄氧基乙醇‑13 13
C2，将2‑苄氧基乙醇‑ C2(12.8mmol，1.97g)溶解在干燥无水的二氯甲烷(30mL)中，温度降至0～5℃，在氮气保护下加入戴斯‑马丁氧化剂 (25.6mmol，10.9g)，加入完成后，升高温度至20～30℃，搅拌4小时，柱层析分离纯化，以70％的产率得到化合物9，立刻进行下一步化合物10的合成反应。

[0070] 10：化合物10的合成

[0071] 氮气保护下，将二异丙胺(9mmol，911mg)溶解在干燥无水的四氢呋喃(10mL) 中，温度降至‑80～‑75℃，以1～2滴/秒的速度滴加2.4mol/L正丁基锂的正己烷溶液 (9mmol，3.75mL)，滴加完成后，在‑80～‑75℃温度下搅拌20～30分钟，以1～2 滴/秒的速度滴加化合物8(8.8mmol，2.04g)的四氢呋喃溶液(10mL)，滴加完成后，在‑80～‑75℃温度下搅拌30～40分钟，以1～2滴/秒的速度滴加化合物9(9mmol， 1.36g)的四氢呋喃溶液(10mL)，滴加完成后，在‑80～‑75℃温度下搅拌50～60分钟，加入10mL饱和氯化铵溶液淬灭，二氯甲烷萃
1
取，有机相浓缩后柱层析分离纯化，以75％的产率得到化合物10，H‑NMR(400MHz,CDCl3)δppm 0.07～0.17(m,6H), 0.91～0.97(m,9H),2.50(d,J＝6.3Hz,1H),3.58～3.71(m,2H),
4.16(d,J＝4.4Hz,1H), 4.44～4.66(m,4H),5.12(t,J＝1.9Hz,1H),6.04(q,J＝1.8Hz,
1H),7.29～7.42(m,5H)。

[0072] 11：化合物11的合成

[0073] 将化合物10(6.6mmol，2.5g)溶解在吡啶(10mL)中，加入4‑二甲氨基吡啶 (3.3mmol，403mg)，搅拌溶解，温度降至0～5℃，以1～2滴/秒的速度滴加特戊酰氯(14mmol，1.7g)，滴加完成后，将反应瓶密封，升高温度至20～30℃，搅拌24 小时，减压旋蒸去除吡啶后，以90％的产率得到化合物11，直接进行下一步反应。

[0074] 12：化合物12的合成

[0075] 将化合物11(5.8mmol，2.7g)溶解在甲醇(30mL)中，加入30mL 10mol/L盐酸溶液，在20～30℃温度下，搅拌4小时，二氯甲烷萃取，减压旋蒸去除二氯甲烷，以95％的产率得到化合物12，直接进行下一步反应。

[0076] 13：化合物13的合成

[0077] 氮气保护下，将化合物12(5.5mmol，1.9g)溶解在干燥无水的二氯甲烷(30mL) 中，温度降至0～5℃，在氮气保护下加入戴斯‑马丁氧化剂(11mmol，4.7g)，加入完成后，升高温度至20～30℃，搅拌4小时，得到化合物13，不进行处理，不拆除反应装置，直接进行下一步反应。

[0078] 14：化合物14的合成

[0079] 保持上一步反应装置不变，将其置于‑80～‑75℃温度下，用注射器以1～2滴/秒的速度滴加1.0mol/L三氯化硼的二氯甲烷溶液(11mmol，11mL)，滴加完成后，在‑80～‑75℃温度下搅拌30分钟，然后升高温度至20～30℃，用注射器加入三乙胺 (5.5mmol，557mg)的甲醇溶液(20mL)，加入完成后，在20～30℃温度下，搅拌 30分钟，柱层析分离纯化，以60％的产率得到化合物14。

[0080] 15：展青霉素‑13C7的合成

[0081] 将化合物14(3.3mmol，868mg)溶解在二氯甲烷(10mL)中，温度降至0～5℃，加入1，8‑二氮杂二环十一碳‑7‑烯(6.6mmol，1g)，加入完成后，升高温度至20～30℃，搅拌45分钟，
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减压旋蒸去除二氯甲烷，柱层析分离纯化，以65％的产率得到展青霉素‑ C7，H‑NMR(400MHz,CDCl3)δppm 3.30(s,1H),4.43(ddd,J＝0.7,4.1,17.2Hz, 1H),4.73(ddd,J＝
1.0,3.0,17.2Hz,1H),5.94(ddd,J＝2.1,2.9,4.3Hz,1H),6.02(dd,J＝0.9, 1.8Hz,1H),
6.06(s,1H)。经液相色谱仪测得纯度99.0％，液相色谱‑质谱联用仪测得同位素丰度
98.4％，化学纯度和同位素丰度均在98％以上，满足同位素内标试剂要求。

[0082] 虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。