制剂及制备方法 发明领域 [0001] 本发明涉及用于人类或动物施用的制剂及其制备方法。特别地，本发明涉及更稳定的药物制剂，诸如用于静脉内施用的药物制剂及其制备方法。 [0002] 背景 [0003] WO2008/139207(通过引用并入本文)描述了适于体内光学成像的标记的cMet结合肽。用适于在红色至近红外区域成像的光学报告物基团将肽标记。还描述了静脉内施用的光学分子成像cMet结合肽，诸如可以用于结肠直肠癌(CRC)早期诊断的那些。 [0004] 更详细地，WO2008/139207描述了一种对人类cMet具有高亲和力的水溶性26-氨基酸环肽，该环肽包含适于对哺乳动物的身体进行体内成像的荧光光学报告物成像部分。该环肽显示出强荧光信号，具有653nm处的激发峰，和675nm处的发射峰，这被认为是用于对浅表病变(superficial lesion)进行成像的最佳波长区域。 [0005] 然而，本发明人已经观察到，所描述的成像剂在溶液中具有差的货架寿命(shelf life)，并且因此该成像剂在静脉内注射前的储存和降解可能是个问题。此外，对于静脉内使用，成像剂有利地处于用于静脉内施用的适当pH和张力。 [0006] 因此，本发明的一个目的是提供一种成像剂的更稳定制剂，特别地光学成像剂的更稳定制剂，更特别地包含肽诸如WO2008/139207中描述的肽的光学成像剂的更稳定制剂。 本发明的另外的目的是提供一种成像剂的制剂，特别地光学成像剂的制剂，更特别地包含肽诸如WO2008/139207中描述的肽并且显示更好的重构、特别地在用于静脉内使用的适当pH和/或张力显示更好的重构的光学成像剂的制剂。 [0007] 发明的公开内容 [0008] 根据本发明的第一方面，提供了一种冻干制剂，该冻干制剂包含： [0009] (i)活性药物成分(API)； [0010] (ii)缓冲剂；和 [0011] (iii)冻干保护剂； [0012] 其中API是适于对哺乳动物的身体进行体内光学成像的成像剂，包含至少一种cMet结合肽。 [0013] 哺乳动物的身体的光学成像可以是体内的。 [0014] 术语“缓冲剂”意指pH调节剂。缓冲剂可以是在溶解时形成缓冲液的化合物或组合物(例如盐)。缓冲剂可以是脱水缓冲盐。缓冲剂可以是以下中的至少一种：酸(通常是弱酸)及其的一种盐、以及碱(通常是弱碱)及其的一种盐。 [0015] 任何对“冻干保护剂”的提及都包括“冷冻保护剂”，且反之亦然，因为该术语在本发明的领域中通常可互换使用。 [0016] 成像剂可以包含适于使用紫色至近红外波长(400nm至1,200nm)的光进行成像的至少一种光学报告物。 [0017] 成像剂可以包含式I的化合物： [0018] [0019] 其中： [0020] Z1被附接至cMBP的N-末端，并且是H或MIG； [0021] Z2被附接至cMBP的C-末端，并且是OH、NH2、OBc或MIG； [0022] 其中Bc是生物相容性阳离子； [0023] cMBP是17个至30个氨基酸的cMet结合环肽，该cMBP包含氨基酸序列(SEQ-1)： [0024] Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6； [0025] 其中：Xaa1是Asn、His或Tyr； [0026] Xaa2是Gly、Ser、Thr或Asn； [0027] Xaa3是Thr或Arg； [0028] Xaa4是Ala、Asp、Glu、Gly或Ser； [0029] Xaa5是Ser或Thr； [0030] Xaa6是Asp或Glu； [0031] 并且Cysa-d各自是半胱氨酸残基，使得残基a与残基b以及残基c与残基d环化形成两个单独的二硫键； [0032] MIG是代谢抑制基团，是抑制或阻遏肽的体内代谢的生物相容性基团； [0033] L是式-(A)m-的合成接头基团，其中A各自独立地是-CR2-、-CR＝CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C＝O)NR-、-NR(C＝S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、CR2OCR2-、-CR2SCR2-、CR2NRCR2-、C4-8亚杂环烷基基团、C4-8亚环烷基基团、C5-12亚芳基基团、C3-12亚杂芳基基团、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)构建单元； [0034] R各自独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟烷基； [0035] m是1至20的值的整数； [0036] n是0或1的值的整数； [0037] IM是适于使用绿色至近红外波长(400nm至1,200nm)的光对哺乳动物的身体进行成像的光学报告物成像部分。 [0038] 术语“成像剂”意指适于对哺乳动物的身体进行体内或离体成像的化合物。离体成像仍然需要向哺乳动物的身体施用，但也可能涉及取出组织样品等，并对身体外部的样品进行成像。在这样的实例中，制剂在被施用至哺乳动物的身体的情况下被体内使用，并且制剂在成像发生在哺乳动物的身体外部的情况下被离体使用。哺乳动物可以是人类受试者。 成像可以是侵入性的(例如，手术中的或内窥镜检查的)或非侵入性的。成像方法可以是内窥镜检查。虽然式I的化合物适于体内成像，但它也可以具有体外应用(例如，对生物样品中的cMet定量或使组织样品中的cMet可视化的测定)。成像剂可以用于体内成像。 [0039] Z1基团取代最后一个氨基酸残基的胺基团。因此，当Z1是H时，cMBP的氨基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离NH2基团。Z2基团取代最后一个氨基酸残基的羰基基团。因此，当Z2是OH时，cMBP的羧基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离CO2H基团，并且当Z2是OBc时，该末端羧基基团被电离为CO2Bc基团。 [0040] 术语“代谢抑制基团”(MIG)意指抑制或阻遏cMBP肽在氨基末端(Z1)或羧基末端(Z2)的体内代谢的生物相容性基团。这样的基团是本领域技术人员熟知的，并且对于肽胺G G 末端，合适地选自N-酰化基团-NH(C＝O)R ，其中酰基基团-(C＝O)R具有选自C1-6烷基、C3-10芳基基团的RG或包含聚乙二醇(PEG)构建单元。合适的PEG基团在下文描述为接头基团(L)。 这样的PEG基团可以是式IA或IB的生物改性剂。这样的氨基末端MIG基团可以是乙酰基、苄氧基羰基或三氟乙酰基，通常是乙酰基。 [0041] 合适的用于肽羧基末端的代谢抑制基团包括：甲酰胺、叔丁基酯、苄基酯、环己基酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)构建单元。合适的用于cMBP肽的羧基末端氨基酸残基的M基团是其中氨基酸残基的末端胺被C1-4烷基基团N-烷基化，任选地被甲基基团N-烷基化的。这样的MIG基团可以是甲酰胺或PEG，并且可以是甲酰胺。 [0042] 式I表示-(L)n[IM]部分可以被附接在Z1、Z2或cMBP的任何合适的位置处。对于Z1或Z2，当Z1/Z2中的任一个是MIG时，-(L)n[IM]部分可以被附接至MIG基团。当Z1是H或Z2是OH时，-(L)n[IM]部分附接在Z1或Z2位置处分别产生式[IM]-(L)n-[cMBP]-Z2或Z1-[cMBP]-(L)n-[IM]的化合物。对任一肽末端处cMBP代谢的抑制也可以通过以这种方式附接-(L)n[IM]部分来实现，但是-(L)n[IM]不在本文MIG的定义内。 [0043] 式I的-(L)n-部分可以被附接在IM的任何合适的位置处。-(L)n-部分代替IM的现有取代基，或被共价附接至IM的现有取代基。-(L)n-部分任选地经由IM的羧基烷基取代基附接。 [0044] 术语“cMet结合环肽”(cMBP)意指与也称为cMet(c-Met或肝细胞生长因子受体)的肝细胞生长因子(HGF)高亲和力受体结合的肽。合适的cMBP肽具有小于约2μM的针对cMet/HGF复合物中的cMet的表观Kd。cMBP肽包含脯氨酸残基，并且已知这样的残基可以显示出骨架酰胺键的顺式/反式异构化。本文描述的cMBP肽包括任何这样的异构体。 [0045] 术语“生物相容性阳离子”(Bc)意指与离子化的带负电荷的基团形成盐的带正电荷的反离子，其中所述带正电荷的反离子也是无毒的，并且因此适于施用至哺乳动物的身体，特别地人类的身体。合适的生物相容性阳离子的实例包括：碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；以及铵离子。典型的生物相容性阳离子是钠和钾，通常是钠。 [0046] 术语“氨基酸”意指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，其可以是天然存在的或完全合成来源的，并且可以是光学上纯的，即单一的对映异构体，并且因此是手性的，或者是对映异构体的混合物。本文使用常规3字母或单字母氨基酸缩写。所使用的氨基酸可以是光学上纯的。术语“氨基酸模拟物”意指天然存在的氨基酸的合成类似物，其是等排体，即已经被设计成模拟天然化合物的空间和电子结构。这样的等排体是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于酯肽(depsipeptide)、逆转肽(retro-inverso peptide)、硫代酰胺、环烷烃或1,5-二取代的四唑[参见M.Goodman,Biopolymers, 24,137,(1985)]。 [0047] 术语“肽”意指包含通过肽键(即连接一个氨基酸的胺和另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的如以上定义的两个或更多个氨基酸的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”是指模拟肽或蛋白质的生物活性但在化学本质上不再是肽即它们不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的生物活性化合物。在此，术语肽模拟物以更广泛的意义使用，以包括本质上不再完全是肽的分子，诸如假肽(pseudo-peptide)、半肽(semi-peptide)和类肽(peptoid)。 [0048] 术语“光学报告物成像部分”(IM)意指能够在使用绿色至近红外波长(400-1, 200nm，任选地600-1,000nm)的光的光学成像程序中直接或间接检测的荧光染料或发色团。 IM可以具有荧光特性。 [0049] 式I的接头基团-(A)m,-的作用之一可能是将IM与cMBP肽的活性位点隔开。当成像部分相对庞大时，这是特别重要的，使得与酶的相互作用不受损。这可以通过使得庞大的基团具有使本身远离活性位点定位的自由的柔性(例如单纯的烷基链)和/或刚性(诸如使IM远离活性位点定位的环烷基或芳基间隔物)的组合实现。接头基团的性质还可以用于改变成像剂的生物分布。因此，例如，在接头中引入醚基团将有助于改变血浆蛋白结合。当-(A)m-包含聚乙二醇(PEG)构建单元或1个至10个氨基酸残基的肽链时，接头基团可以起作用来改变成像剂在体内的药代动力学和血液清除率。这样的“生物改性剂”接头基团可以加速成像剂从背景组织(诸如肌肉或肝)中和/或从血液中的清除，从而由于更少的背景干扰而给出更好的诊断图像。生物改性剂接头基团还可以用于促进特定排泄途径，例如经由肾，而不是经由肝。 [0050] 术语“糖”意指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。任选地，糖可以被官能化以允许易与氨基酸偶联。因此，例如，氨基酸的葡糖胺衍生物可以经由肽键与其他氨基酸缀合。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(从NovaBiochem商购可得)就是这种情况的一个实例： [0051] [0052] 成像剂的分子量合适地最多8,000道尔顿。任选地，分子量在2,800道尔顿至6,000道尔顿的范围内，通常为3,000道尔顿至4,500道尔顿，最通常为3,200道尔顿至4,000道尔顿。 [0053] 本发明的成像剂可以具有被MIG基团保护的两个肽末端，即任选地Z1和Z2二者均是MIG，它们通常将是不同的。如以上提到的，Z1/Z2中的任一个可以任选地等于-(L)n[IM]。以这种方式保护两个肽末端对于体内成像应用是重要的，因为否则预计将快速代谢，结果使对cMet的选择性结合亲和力损失。当Z1和Z2二者均是MIG时，任选地Z1是乙酰基，并且Z2是伯酰胺。Z1可以是乙酰基，并且Z2可以是伯酰胺，并且-(L)n[IM]部分可以被附接至cMBP的赖氨酸残基的ε胺侧链。 [0054] 本发明的cMBP肽可以具有小于约10nM的cMet与cMet/HGF复合物结合的KD(基于荧光偏振测定测量)，最通常在1nM至5nM的范围内，小于3nM是理想的。 [0055] 式I的cMBP的肽序列(SEQ-1)： [0056] Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6 [0057] (SEQ-1) [0058] 是17-mer肽序列，主要负责与cMet的选择性结合。当本发明的cMBP肽包含多于17个氨基酸残基时，剩余的氨基酸可以是除半胱氨酸之外的任何氨基酸。此外，未保护的半胱氨酸残基可能引起对已定义的Cysa-Cysb和Cysc-Cysd二硫桥的不期望的打乱 (scrambling)。另外的肽优选地包含具有适于容易缀合-(L)n[IM]部分的侧链的至少一个氨基酸残基。合适的这样的残基包括用于与胺官能化-(L)n[IM]基团缀合的Asp或Glu残基，或用于与羧基或活性酯官能化-(L)n[IM]基团缀合的Lys残基。用于缀合-(L)n[IM]的氨基酸残基适当地远离cMBP肽(SEQ-1)的17-mer结合区域定位，并且任选地位于C-末端或N-末端处。任选地，用于缀合的氨基酸残基是Lys残基。 [0059] 用已知的氨基酸取代物苯丙氨酸和萘基丙氨酸来评估SEQ-1的色氨酸残基的取代。然而，发现cMet亲和力损失，表明色氨酸残基对活性是重要的。任选地，cMBP肽还包含N-末端丝氨酸残基，给出了18-mer(SEQ-2)： [0060] Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6。 [0061] (SEQ-2) [0062] 除了SEQ-1或SEQ-2之外，cMBP还可以： [0063] (i)在cMBP肽的C-肽末端或N-肽末端的4个氨基酸残基内包含Asp或Glu残基、或其类似物，并且-(L)n[IM]被用胺基团官能化，该胺基团与所述Asp或Glu残基、或其类似物的羧基侧链缀合，以产生酰胺键； [0064] (ii)在cMBP肽的C-肽末端或N-肽末端的4个氨基酸残基内包含Lys残基或其类似物，并且-(L)n[IM]被用羧基基团官能化，该羧基基团所述Lys残基或其类似物的ε胺侧链缀合，以产生酰胺键。 [0065] Asp和/或Glu的类似物可以包括以下中的一种或更多种：2-氨基丁二酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸、2-氨基壬二酸、2-氨基癸二酸、2-氨基十一烷二酸和2-氨基十二烷二酸。 [0066] Lys的类似物可以包括以下中的一种或更多种：2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸、2,7-二氨基庚酸、2,8-二氨基辛酸、2,9-二氨基壬酸、2,10-二氨基癸酸、2,11-二氨基十一烷酸、2,12-二氨基十二烷酸。 [0067] cMBP肽可以包含22-mer氨基酸序列(SEQ-3)： [0068] Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Thr。 [0069] (SEQ-3) [0070] cMBP肽可以具有等于Arg的Xaa3。 [0071] 除了SEQ-1、SEQ-2或SEQ-3之外，cMBP肽还可以在N-末端或C-末端处包含接头肽，该接头肽选自：-Gly-Gly-Gly-Lys-(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5)或-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys-(SEQ-6)。 [0072] 接头肽的Lys残基是用于缀合-(L)n[IM]部分的典型位置。一些cMBP肽包含SEQ-3以及SEQ-4的接头肽，具有26-mer氨基酸序列(SEQ-7)： [0073] Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。 [0074] (SEQ-7) [0075] SEQ-1、SEQ-2、SEQ-3和SEQ-7的cMBP肽可以具有Z1＝Z2＝MIG，并且可以具有Z1＝乙酰基且Z2＝伯酰胺。 [0076] -(L)n[IM]部分合适地被附接至Z1或Z2基团或与SEQ-1的cMet结合序列不同的cMBP肽的氨基酸残基。可能的氨基酸残基和缀合位点如以上描述的。当-(L)n[IM]部分被附接至Z1或Z2时，它可以通过与N-末端或C-末端缀合来代替Z1或Z2，并以该方式阻断体内代谢。 [0077] 典型的IM基团具有广泛的离域电子系统，例如花菁、部花菁、吲哚菁、酞菁、萘酞菁(naphthalocyanine)、三苯基次甲基(triphenylmethine)、卟啉、吡喃鎓染料(pyrilium dye)、硫代吡喃鎓染料、方酸菁(squarylium)染料、克酮酸(croconium)染料、azulenium染料、吲哚苯胺(indoaniline)、benzophenoxazinium染料、苯并噻吩噻嗪 (benzothiaphenothiazinium)染料、蒽醌、萘醌、阴丹士林(indanthrene)、 phthaloylacridones、三苯醌类(trisphenoquinones)、偶氮染料、分子内和分子间电荷转移染料和染料配合物、环庚三烯酮、四嗪、双(二硫烯)配合物、双(苯-二硫酯)配合物、碘苯胺(iodoaniline)染料、双(S,O-二硫烯)配合物。荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)和具有不同吸收/发射特性的GFP的修饰形式也是有用的。在某些情况下，使用某些稀土金属(例如，铕、钐、铽或镝)的配合物，也使用荧光纳米晶体(量子点)。 [0078] 可以使用的发色团的实例包括：Atto 647、CF640R、Atto 647N、SiR650、CF633、磺基Cy5(Sulfo Cy5)、T700-H、T700-F、CF647 SE、Quasar 670、Chromeo 642、Oyster 645、Oyster 647、Oyster 650、Iris 5、CyAL 5、IRDye 650、NIR4、AOI987、 650/665、DyLight 633、DyLight 650、DDAO(7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)、Chromis 645C、Chromis 645Z、Chromis 645A、HiLyte 647、PromoFluor 647P、Dy-630、Dy-631、Dy- 632、Dy-633、Dy-636、Dy-650、Dy-651、Dy-652、Dy-654、Tracy 645、Tracy 652、荧光红NIR 782、Atto 655、Atto 680、CF660 C、CF660 R、Quasar 705、CF680、IRDye680RD、NIR2、IRDye680LT、HiLyte 680、IRDye700DX、Oyster 680、Iris 5.5、HROMIS LSS 670Z、CHROMIS LSS 690Z、DyLight 680(Pierce)、酞菁镁、Oxazin 750、SeTa-665、SeTa-667、SeTa-670、PromoFluor 670(Promo Kine)、Dy-682、PromoFluor 680、PromoFluor 700P、亚甲蓝、荧光红NIR 730反应性(Fluorescent Red NIR 730 Reactive)、荧光红NIR 781反应性、BM104、BM105(BM104的NHS酯)、SiR720、Atto 740、CF750、磺基Cy7、IRDye750、NIR3、DyLight 755、DY-732、DY-734、DY-752、PromoFluor 750P、HiLyte 750、DY-776、NIR1、IRDye800RS、PromoFluor 770P、DY-778、CHROMIS 770C、ZW800-1、ZW800-3、IRIS 7G-WS、IR 780、ESNF31、CF770、Vivotag 800、IRDye800CW、Alexa Fluor 790、CF790、Oyster 800、CHROMIS 770A、CHROMIS 800C、CHROMIS 800A、CHROMIS 830C、CHROMIS 830A、DyLight 800、DY-777、DY- 782、DY-800、PromoFluor 780P、NIR-797、PromoFluor 840P、萤光素(fluorescein)、磺酰罗丹明(sulforhodamine)101(Texas Red)、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、吲哚菁绿(indocyanine green)、Cy2、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、滨蓝(Marina Blue)、海水蓝(Pacific Blue)、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿514、TAMRA(四甲基罗丹明)、TMR、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750。通常可以使用花菁染料及其衍生物和类似物。 [0079] 可以使用的发色团的特定实例包括：Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750、Atto 647、CF640R、Atto 647N、SiR650、CF633、磺基Cy5、T700-H、T700-F、CF647 SE、Quasar 670、Chromeo 642、Oyster 645、Oyster 647、Oyster 650、Iris 5、CyAL 5、IRDye 650、NIR4、AOI987、 650/665、DyLight 633、DyLight 650、DDAO(7-羟基-9H-(1, 3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)、Chromis 645C、Chromis 645Z、Chromis 645A、HiLyte 647、PromoFluor 647P、Dy-630、Dy-631、Dy-632、Dy-633、Dy-636、Dy-650、Dy-651、Dy-652、Dy-654、Tracy 645、Tracy 652、荧光红NIR 782、Atto 655、Atto 680、CF660 C、CF660 R、Quasar 705、CF680、IRDye680RD、NIR2、IRDye680LT、HiLyte 680、IRDye700DX、Oyster 680、Iris 5.5、HROMIS LSS 670Z、CHROMIS LSS 690Z、DyLight 680(Pierce)、酞菁镁、Oxazin 750、SeTa-665、SeTa-667、SeTa-670、PromoFluor 670(Promo Kine)、Dy-682、PromoFluor 680、PromoFluor 700P、亚甲蓝、荧光红NIR 730反应性、荧光红NIR 781反应性、BM104、BM105(BM104的NHS酯)、SiR720、Atto 740、CF750、磺基Cy7、IRDye750、NIR3、DyLight 755、DY-732、DY-734、DY-752、PromoFluor 750P、HiLyte 750、DY-776、NIR1、IRDye800RS、PromoFluor 770P、DY-778、CHROMIS 770C、ZW800-1、ZW800-3、IRIS 7G-WS、IR 780、ESNF31、CF770、Vivotag 800、IRDye800CW、Alexa Fluor 790、CF790、Oyster 800、CHROMIS 770A、CHROMIS 800C、CHROMIS 800A、CHROMIS 830C、CHROMIS 830A、DyLight 800、DY-777、DY- 782、DY-800、PromoFluor 780P、NIR-797、PromoFluor 840P和吲哚菁绿。Licha等人已经综述了用于体内光学成像的染料和染料缀合物[Topics Curr.Chem.,222,1-29(2002)； Adv.Drug Deliv.Rev.,57,1087-1108(2005)]。 [0080] 可以使用的发色团的更特定实例包括：Cy5、Cy5**、Alexa Fluor 647、 630、Atto 647、Oyster 647、IRDye650、 650、DY631、DY632、Cy5.5、 IRDye 680RD、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680。 [0081] 花菁染料可以是式II的荧光团： [0082] [0083] 其中： [0084] X'各自独立地选自：-C(CH3)2-、-S-、-O-或-C[(CH2)aCH3][(CH2)bM]-，其中a是0至5 1 的值的整数，b是1至5的值的整数，并且M是基团G或选自SO3M或H；Y'各自独立地表示1个至4个选自由以下组成的组的基团：H、-CH2NH2、-SO3M1、-CH2COOM1、-NCS和F，其中Y'基团被置于芳族环的任何位置； [0085] Q’独立地选自由以下组成的组：H、SO3M1、NH2、COOM1、铵、酯基团、苄基和基团G； [0086] M1是H或Bc； [0087] I是1至3的整数； [0088] 并且m是1至5的整数； [0089] 其中X'、Y'和Q'中的至少一个包括基团G； [0090] G是适于附接至cMBP肽的反应性或官能基团。 [0091] G基团与cMBP肽的互补基团反应，在花菁染料荧光团和cMBP肽之间形成共价键。G可以是可与肽的互补官能基团反应的反应性基团，或者可选地可以包括可与cMBP肽的反应性基团反应的官能基团。反应性基团和官能基团的实例包括：活性酯；异硫氰酸酯；马来酰亚胺；卤代乙酰胺；酰卤(acid halide)；酰肼；乙烯基砜(vinylsulphone)；二氯三嗪；亚磷酰胺；羟基；氨基；巯基；羰基；羧酸和硫代磷酸酯。G可以是活性酯。 [0092] 术语“活化酯”或“活性酯”意指相关羧酸的被设计成包含更好的离去基团并且因此允许更容易与亲核剂诸如胺反应的酯衍生物。合适的活性酯的实例是：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚、羟基苯并三唑和PyBOP(即六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基鏻(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate))。活性酯可以是N-羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺酯。 [0093] 在式II的一种实施方案中： [0094] X'各自选自-C(CH3)2-和-C(CH3)[(CH2)4M]-的组， [0095] 其中M是G基团或-SO3M1； [0096] Y'各自表示SO3M1、H或1个至4个F原子； [0097] Q'各自选自G基团和SO3M1； [0098] I优选地是2，并且m优选地是3、4或5； [0099] 其中当X'或Q’是G基团时，它可以是琥珀酰亚胺酯。 [0100] 花菁染料可以具有式III： [0101] [0102] 其中： [0103] R1和R2独立地是H或SO3M1，并且R1和R2中的至少一个是SO3M1，其中M1是H或Bc； [0104] R3和R4独立地是C1-4烷基或C1-6羧基烷基； [0105] R5、R6、R7和R8独立地是Ra基团； [0106] 其中Ra是C1-4烷基、C1-6羧基烷基或–(CH2)kSO3M1，其中k是3或4的值的整数； [0107] 条件是花菁染料在R1、R2和Ra基团中具有总计1个至4个SO3M1取代基。 [0108] 可以选择式III的染料，使得存在至少一个C1-6羧基烷基，以促进与cMBP缀合。 [0109] 可能的式III的个体染料总结于表1中： [0110] [0111] 其中Rf＝-(CH2)5COOH。 [0112] 表1：个体花菁染料的化学结构 [0113] 通常使用的式II的染料是Cy5**和Alexa647，Cy5**是最典型的。 [0114] 当存在合成接头基团(L)时，合成接头基团(L)可以包含促进与[IM]和Z1-[cMBP]-Z2缀合的末端官能基团。当L包含1个至10个氨基酸残基的肽链时，氨基酸残基可以选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。当L包含PEG部分时，L可以包含来源于式IA(17-氨基-5-氧代-6-氮杂3,9,12,15-四氧杂十七烷酸)或IB的单分散PEG样结构的低聚的单元： [0115] [0116] 其中p是1至10的整数。可选地，可以使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG样结构： [0117] [0118] 其中p如对于式IA所定义的，并且q是3至15的整数。在式IB中，p可以是1或2，并且q可以是5至12。 [0119] 当接头基团不包含PEG或肽链时，L基团可以具有连接原子的骨架链，该连接原子构成2个至10个原子、最优选地2个至5个原子(其中2个或3个原子是特别优选的)的-(A)m-部分。2个原子的最小接头基团骨架链赋予以下优点：成像部分被充分分开使得任何不期望的相互作用最小化。 [0120] 在式I中，n可以是0或1，通常是0，即不存在接头基团。 [0121] 如本文描述的成像剂可以具有式IV(包含SEQ-7)： [0122] [0123] 其中(L)n[IM]基团被附接至Lys残基的ε氨基基团。式IV的成像剂可以具有等于乙酰基的M(N-末端Ala)和等于伯酰胺的MIG(C-末端Lys)。在式IV中，n可以是零，并且IM可以是花菁染料，通常是式II的花菁染料。可以使用式IV的成像剂，其中所述式IV具有IM＝Cy5**或Alexa647(最通常为Cy5**)。 [0124] 式Z1-[cMBP]-Z2的肽可以通过包括以下步骤的制备方法获得： [0125] (i)线性肽的固相肽合成，该线性肽具有与所期望的cMBP肽相同的肽序列，并且其中Cysa和Cysb未被保护，并且Cysc和Cysd残基具有硫醇保护基团； [0126] (ii)将来自步骤(i)的肽从固体支持物上裂解，并用呈溶液的水性碱处理，以产生具有连接Cysa和Cysb的第一个二硫键的单环肽； [0127] (iii)去除Cysc和Cysd硫醇保护基团并环化，以产生连接Cysc和Cysd的第二个二硫键，这是所期望的双环肽产物Z1-[cMBP]-Z2。 [0128] 术语“保护基团”意指抑制或阻遏不期望的化学反应的基团，但是该基团被设计成是有足够反应性的，使得它可以在不改变分子的其余部分的足够温和的条件下从所讨论的官能基团上裂解。去保护后，获得所期望的产物。胺保护基团是本领域技术人员熟知的，并且合适地选自：Boc(其中Boc是叔丁氧羰基)、Fmoc(其中Fmoc是芴甲氧羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧羰基、Dde[即1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys(即3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(3-nitro-2-pyridine sulfenyl))。合适的硫醇保护基团是Trt(三苯甲基)、Acm(乙酰胺甲基)、t-Bu(叔丁基)、叔丁基硫代、甲氧基苄基、甲基苄基或Npys(3-硝基-2-吡啶亚磺酰基)。另外的保护基团的使用在‘Protective Groups in Organic Synthesis',Theorodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，(John Wiley&Sons,1991)中描述。典型的胺保护基团是Boc和Fmoc，最通常是Boc。其他典型的硫醇保护基团是Trt和Acm。 [0129] 实施例1和2提供了进一步的具体细节。固相肽合成的进一步的细节在P.Lloyd-Williams、F.Albericio和E.Girald；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，CRC Press，1997中描述。cMBP肽最好储存在惰性气氛下，并保存在冰箱中。当在溶液中使用时，最好避免高于7的pH，因为这有打乱二硫桥的风险，并且最好避免低pH，因为这触发肽的聚集。 [0130] 制备第一方面的成像剂的一般方法包括步骤(i)至(iv)之一： [0131] (i)使式Z1-[cMBP]-Z2(其中Z1是H并且Z2是MIG)的cMBP肽与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，以产生式I的成像剂，其中[IM]缀合在Z1位置处； [0132] (ii)使式Z1-[cMBP]-Z2(其中Z1＝Z2＝MIG，并且cMBP在C-cMBP肽末端或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基内包含Asp或Glu残基，并且cMBP肽的所有其他Asp/Glu残基被保护)的cMBP肽与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，以产生式I的成像剂，其中[IM]被缀合在cMBP肽的所述Asp或Glu残基处； [0133] (iii)使式Z1-[cMBP]-Z3(其中Z1是MIG并且Z3是Z2基团或活化酯，并且cMBP肽的所有其他Asp/Glu残基被保护)的cMBP肽与式Y2-(L)n-[IM]的化合物反应，以产生式I的成像 2 剂，其中[IM]被缀合在Z位置处； [0134] (iv)使式Z1-[cMBP]-Z2(其中Z1＝Z2＝MIG，并且cMBP在C-cMBP肽末端或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基内包含Lys)的cMBP肽与式Y1-(L)n-[IM]的化合物反应，以产生式I的成像剂，其中[IM]被缀合在cMBP肽的Lys残基处； [0135] 其中Z、cMBP、Z、M、L、n和IM如以上定义，并且Z3是Z2基团或活化酯； [0136] Y1是羧酸、活化酯、异硫氰酸酯或硫氰酸酯基团； [0137] Y2是胺基团。 [0138] 术语“活化酯”或“活性酯”及其实施方案如以上描述。Y2任选地是伯胺或仲胺基团，通常是伯胺基团。 [0139] 化合物Z1-[cMBP]-Z2可以具有等于MIG的Z1和Z2二者。典型的cMBP肽和Z1/Z2基团如以上描述。特别地，典型的是cMBP肽包含Asp、Glu或Lys残基，以促进对于以上描述的典型cMBP肽的如以上描述的缀合。最典型的是cMBP肽包含Lys残基，如步骤(iv)中描述的。 [0140] Z1-[cMBP]-Z2的制备如以上描述。Z1-[cMBP]-Z3肽(其中Z3是活性酯)可以通过常规方法由Z1-[cMBP]-Z2(其中Z2是OH或生物相容性阳离子(Bc))制备。 [0141] 适于与肽缀合的官能化的光学报告物染料(IM)从GE Healthcare Limited、Atto-Tec、Dyomics、Molecular Probes和其他公司商购可得。大多数这样的染料都是以NHS酯的形式可得。 [0142] 将合适的光学报告物(IM)(特别地，染料)与氨基酸和肽缀合的方法由Licha(见以上)以及Flanagan等人[Bioconj.Chem.,8,751-756(1997)]；Lin等人，[同上,13,605-610(2002)]和Zaheer[Mol.Imaging,1(4),354-364(2002)]描述。将接头基团(L)与cMBP肽缀合的方法使用与单独的染料的方法类似的化学方法(见以上)，并且是本领域已知的。 [0143] 其中除了SEQ-1之外，cMBP还可以在C-cMBP肽末端或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基内包含Asp或Glu残基，并且–(L)nIM可以用胺基团官能化，该胺基团与所述Asp或Glu残基的羧基侧链缀合，以产生酰胺键。 [0144] 除了SEQ-1之外，cMBP可以在C-cMBP肽末端或N-cMBP肽末端的4个氨基酸残基内包含Lys残基，并且–(L)nIM可以用羧基基团官能化，该羧基基团与所述Lys残基的ε胺侧链缀合，以产生酰胺键。 [0145] cMBP可以包含SEQ-2或SEQ-3的氨基酸序列： [0146] Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4- 5 6 Xaa-Xaa(SEQ-2)； [0147] Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Thr(SEQ-3)。 [0148] Xaa3可以是Arg。 [0149] 除了SEQ-1、SEQ-2或SEQ-3之外，cMBP还可以在N-末端或C-末端处包含接头肽，该接头肽选自-Gly-Gly-Gly-Lys(SEQ-4)、-Gly-Ser-Gly-Lys-(SEQ-5)和-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys(SEQ-6)。 [0150] cMBP可以具有氨基酸序列(SEQ-7)： [0151] Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。 [0152] Z1和Z2二者均可以独立地是MIG。 [0153] Z1可以是乙酰基，并且Z2可以是伯酰胺。 [0154] n可以是0。 [0155] IM可以是具有在范围600nm至1,000nm内的最大吸光度的染料。 [0156] IM可以是花菁染料。 [0157] 花菁染料可以具有式III： [0158] [0159] 其中： [0160] R1和R2独立地是H或SO3M1，并且R1和R2中的至少一个是SO3M1，其中M1是H或Bc； [0161] R3和R4独立地是C1-4烷基或C1-6羧基烷基； [0162] R5、R6、R7和R8独立地是Ra基团； [0163] 其中Ra是C1-4烷基、C1-6羧基烷基或–(CH2)kSO3M1，其中k是3或4的值的整数； [0164] 条件是花菁染料在R1、R2和Ra基团中具有总计1个至4个SO3M1取代基。 [0165] cMBP可以具有氨基酸序列(SEQ-7)： [0166] Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys； [0167] Z1可以是乙酰基，并且Z2可以是伯酰胺；并且 [0168] IM可以是具有在范围600nm至1,000nm内的最大吸光度的染料，任选地是花菁染料，任选地是具有式III的花菁染料： [0169] [0170] 其中： [0171] R1和R2独立地是H或SO3M1，并且R1和R2中的至少一个是SO3M1，其中M1是H或Bc； [0172] R3和R4独立地是C1-4烷基或C1-6羧基烷基； [0173] R5、R6、R7和R8独立地是Ra基团； [0174] 其中Ra是C1-4烷基、C1-6羧基烷基或–(CH2)kSO3M1，其中k是3或4的值的整数； [0175] 条件是花菁染料在R1、R2和Ra基团中具有总计1个至4个SO3M1取代基。 [0176] 制剂在重构时可以具有以下pH：约pH 6.3和约pH 9之间，任选地约pH 6.3和约pH 9之间、任选地约pH 6.5和约pH 8.5之间、任选地约pH 6.8和约pH 8.2之间、任选地约pH 6.8和约pH 8之间、任选地约pH 7和约pH 8之间。 [0177] 缓冲剂可以以在重构时提供具有以下pH的溶液的量存在：约pH 6.3和约pH 9之间，任选地约pH 6.3和约pH 9之间、任选地约pH 6.5和约pH 8.5之间、任选地约pH 6.8和约pH 8.2之间、任选地约pH 6.8和约pH 8之间、任选地约pH 7和约pH 8之间。 [0178] API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约17摩尔至约47摩尔的缓冲剂。API: 缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约27摩尔至约47摩尔的缓冲剂。API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约30摩尔至约47摩尔的缓冲剂。API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约34摩尔至约47摩尔的缓冲剂。 [0179] API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约27摩尔至约38摩尔的缓冲剂。API: 缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约30摩尔至约38摩尔的缓冲剂。API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约34摩尔至约38摩尔的缓冲剂。 [0180] API:缓冲剂的摩尔比可以是约1摩尔的API:约38摩尔的缓冲剂。 [0181] API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约216摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约163摩尔的冻干保护剂。 API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约154摩尔的冻干保护剂。API: 冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约145摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约141摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约132摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约105摩尔至约129摩尔的冻干保护剂。 [0182] API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约216摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约163摩尔的冻干保护剂。 API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约154摩尔的冻干保护剂。API: 冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约145摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约141摩尔的冻干保护剂。API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔至约132摩尔的冻干保护剂。 [0183] API:冻干保护剂的摩尔比可以是约1摩尔API:约129摩尔的冻干保护剂。 [0184] 制剂可以包含按重量计约4％至约12％的API，任选地按重量计约8％至约10％的API、任选地按重量计约9％的API。 [0185] 制剂可以包含按重量计约3％至约35％的缓冲剂，任选地按重量计约7％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约12％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约15％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约18％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约25％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约32％至约35％的缓冲剂、任选地按重量计约32％的缓冲剂。 [0186] 制剂可以包含按重量计约56％至约91％的冻干保护剂，任选地按重量计约56％至约82％的冻干保护剂、任选地按重量计约56％至约77％的冻干保护剂、任选地按重量计约 56％至约75％的冻干保护剂、任选地按重量计约56％至约72％的冻干保护剂、任选地按重量计约56％至约66％的冻干保护剂、任选地按重量计约56％至约58％的冻干保护剂、任选地按重量计约58％的冻干保护剂。 [0187] 应当理解，选择制剂的组分，使得总量是按重量计100％。 [0188] 制剂可以包含至少40mM的缓冲剂。 [0189] 缓冲剂可以是磷酸盐缓冲剂和醇胺缓冲剂中的至少一种。磷酸盐缓冲剂可以包含磷酸氢盐和磷酸二氢盐。磷酸盐缓冲剂可以是水合的。 [0190] 醇胺缓冲剂可以包含三(羟甲基)氨基甲烷。醇胺缓冲剂可以包含2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇。 [0191] 冻干保护剂可以是糖、醇和糖醇、及其衍生物中的至少一种。任选地，冻干保护剂是糖和糖醇、及其衍生物中的至少一种。任选地，冻干保护剂是单糖、二糖、寡糖、多糖、及其衍生物中的至少一种。冻干保护剂可以是蔗糖和甘露醇、及其衍生物中的至少一种。冻干保护剂可以是甘露醇或其衍生物。 [0192] 制剂还可以包含张力调节剂。 [0193] 冻干保护剂也可以充当张力调节剂，在这种情况下，它是合二为一的冻干保护剂和张力调节剂。 [0194] 根据本发明的第二方面，提供了一种制备冻干制剂的方法，该方法包括以下步骤： [0195] a)向冻干容器中提供活性药物成分(API)、缓冲剂和冻干保护剂； [0196] b)进行第一除水步骤；和 [0197] c)进行第二除水步骤； [0198] 其中在进行冻干前添加冻干保护剂。 [0199] 第一除水步骤可以在约-30℃或更低，任选地约-35℃或更低、任选地约-38℃或更低的温度进行。 [0200] 第二除水步骤可以在约10℃或更高，任选地约15℃或更高、任选地约20℃或更高的温度进行。 [0201] 第一除水步骤和第二除水步骤中的至少一个可以在50μ巴或更低的压力进行。任选地，第一除水步骤和第二除水步骤二者均可以在50μ巴或更低的压力进行。 [0202] 冻干制剂可以是本发明的第一方面的冻干制剂。 [0203] 根据本发明的一个方面，提供了一种通过本发明的第二方面制备的冻干制剂。 [0204] 根据本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的第一方面的制剂和生物相容性载体，该药物组合物呈适于哺乳动物施用的形式。 [0205] 生物相容性载体可以是溶剂，通常是水性溶剂，通常是水。溶剂可以是流体。 [0206] “生物相容性载体”可以是其中可以悬浮或溶解成像剂，使得组合物在生理上是可耐受的，即可以在没有毒性或过度不适的情况下施用至哺乳动物身体的流体，特别地是液体。生物相容性载体合适地是可注射载体液体，诸如无菌、无热原的注射用水；水性溶液诸如盐水(其可以有利地被平衡，使得最终的注射产品是等渗的)；一种或更多种张力调节物质(例如血浆阳离子与生物相容性反离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇类(例如甘油)或其他非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水性溶液。生物相容性载体可以是无热原的注射用水或等渗盐水。成像剂和生物相容性载体各自在合适的小瓶或容器中提供，该小瓶或容器包括这样的密封容器，其允许维持无菌完整性和/或放射性安全性、加上任选的惰性顶部空间气体(例如氮气或氩气)、同时允许通过注射器或套管添加和抽取溶液。优选的这样的容器是隔膜密封的小瓶，其中气密封闭件用顶封件(overseal)(通常是铝制的)压接。封闭件适于用皮下注射针单次或多次穿刺(例如，压接的隔膜密封封闭件)，同时维持无菌完整性。这样的容器具有另外的优点，即如果需要，封闭件可以承受真空(例如，改变顶部空间气体或脱气溶液)，并承受压力改变，诸如压力降低，而不允许外部大气气体诸如氧气或水蒸气进入。 [0207] 药物组合物可以具有适于单个患者的剂量，并且可以在合适的注射器或容器中提供。 [0208] 多剂量容器包括含有多个患者剂量的单个大容量小瓶(例如，10cm3至30cm3体积)，由此单个患者剂量可以因此在制剂的有效寿命期间以不同的时间间隔抽取到临床级注射器中以适应临床情况。预填充注射器被设计成含有单个人类剂量或“单位剂量”，并且因此优选地是一次性注射器或其他适于临床使用的注射器。如以上描述的，药物组合物可以具有适于单个患者的剂量，并且可以在合适的注射器或容器中提供。 [0209] 药物组合物可以具有以下pH：约pH 6.3和约pH 9之间，任选地约pH 6.3和约pH 9之间、任选地约pH 6.5和约pH 8.5之间、任选地约pH 6.8和约pH 8.2之间、任选地约pH 7和约pH 8之间。 [0210] 根据本发明的第四方面，提供了一种用于制备本发明的第三方面的药物组合物的试剂盒，该试剂盒包含呈无菌固体形式的本发明的第一方面的制剂，使得在用本发明的第三方面的生物相容性载体的无菌供应物重构后，发生溶解以给出所期望的药物组合物。 [0211] 无菌固体形式可以是冻干固体。 [0212] 根据本发明的第五方面，提供了一种对哺乳动物的身体进行成像的方法，该方法包括使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种。 [0213] 应当理解，对于体内使用，制剂通过例如用生物相容性载体重构而制成适于哺乳动物施用的形式。 [0214] 成像可以是体内的。 [0215] 成像可以是光学成像。 [0216] 术语“光学成像”意指基于与红色至近红外区域(波长400-1,200nm)的光的相互作用，形成用于疾病的检测、分期或诊断、疾病发展的跟踪或疾病治疗的跟踪的图像的任何方法。光学成像还包括在不使用任何装置的情况下直接可视化以及涉及使用装置诸如多种内窥镜、导管和光学成像设备，例如用于断层成像呈现的计算机辅助硬件的所有方法。模式和测量技术包括但不限于：荧光成像、发光成像；内窥镜检查；荧光内窥镜检查；光学相干断层成像；透射成像；时间分辨透射成像；共聚焦成像；非线性显微术；光声成像(phoacoustic imaging)；声光成像(acousto-optical imaging)；光谱术；反射光谱术；干涉测量术；相干干涉测量术；扩散光学断层成像和荧光介导的扩散光学断层成像(连续波、时域和频域系统)，以及光散射、吸收、偏振、发光、荧光寿命、量子产率和猝灭的测量。这些技术的更多细节提供自：(Tuan Vo-Dinh(编者)："Biomedical Photonics Handbook"(2003),CRC Press LCC；Mycek&Pogue(编者)："Handbook of Biomedical Fluorescence"(2003),Marcel Dekker,Inc.；Splinter&Hopper："An Introduction to Biomedical Optics"(2007),CRC Press LCC。 [0217] 成像可以获得cMet过表达或定位的部位的图像。 [0218] 本发明的第一方面的制剂或本发明的第三方面的药物组合物可以已经被先前施用至哺乳动物体。 [0219] 光学成像方法可以使用荧光反射成像(FRI)。在FRI中，将本发明的成像剂施用至待诊断的受试者，并且随后用激发光(通常是连续波(CW)激发)照射受试者的组织表面。光使报告物分子(IM)激发。使用荧光检测器检测由激发光产生的来自成像剂的荧光。返回的光可以被过滤以使荧光组分(单独或部分)分开。图像由荧光形成。通常进行最少的处理(没有处理器来计算光学参数诸如寿命、量子产率等)并且图像映射了荧光强度。成像剂被设计成集中在疾病区域，产生更高的荧光强度。因此，疾病区域在荧光强度图像中产生阳性对比。图像可以使用CCD照相机或芯片获得，使得实时成像是可能的。 [0220] 激发波长根据所使用染料的类型而变化。用于产生激发光的设备可以是常规激发光源，诸如：激光器(例如，离子激光器、染料激光器或半导体激光器)；卤素光源或氙光源。 多种光学滤光片可以任选地用于获得最佳激发波长。 [0221] 该方法可以包括以下步骤： [0222] a)用激发光照射感兴趣的组织表面； [0223] b)检测来自成像剂的荧光，该荧光由成像剂的激发产生； [0224] c)任选地过滤由荧光检测器检测到的光，以将荧光组分分开；和 [0225] d)由步骤(b)或(c)的荧光形成感兴趣的组织表面的图像。 [0226] 步骤(a)的激发光本质上可以是连续波(CW)。 [0227] 步骤(a)可以在哺乳动物的身体内进行。 [0228] 可选的成像方法使用FDPM(频域光子迁移)。这种方法比连续波(CW)方法具有优势，在连续波(CW)方法中，更大的组织内IM检测深度是重要的[Sevick-Muraca等人，Curr.Opin.Chem.Biol.,6,642-650(2002)]。对于这样的频域/时域成像，如果IM具有荧光特性，则是有利的，该荧光特性可以根据待成像的病变的组织深度和所采用的仪器类型进行调制。 [0229] 该方法可以包括以下步骤： [0230] a)使具有异质组成的所述哺乳动物的身体的光散射生物组织暴露于来自具有预定时变强度的光源的光，以激发成像剂，组织使激发光多重散射； [0231] b)检测响应于所述暴露而来自组织的多重散射的光发射； [0232] c)通过用处理器建立许多值来定量遍及组织的来自发射的荧光特征，所述值各自对应于组织内不同位置处的荧光特征的水平，荧光特征的水平随组织的异质组成而变化； 和 [0233] d)通过根据步骤(c)的值映射组织的异质组成来产生组织的图像。 [0234] 光学成像方法可以包括荧光成像，任选地荧光内窥镜检查。 [0235] 该方法可以用来辅助于检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测疗法。 [0236] 该方法可以用来辅助于检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测癌症的疗法，任选地结肠直肠癌的疗法。 [0237] 根据本发明的另外的方面，提供了一种检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测疗法的方法，该方法包括本发明的第五方面的成像方法。 [0238] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于作为对哺乳动物的身体进行成像中的成像剂使用。 [0239] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于作为药物使用。 [0240] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测疗法中使用。 [0241] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测以下的疗法中使用：癌前状况和癌症中的一种或更多种，任选地结肠直肠癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌和肉瘤中的一种或更多种。 [0242] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测cMet过表达或定位的部位的疗法中使用。 [0243] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种，用于在获得，任选地体内获得cMet过表达或定位的部位的图像中使用。 [0244] 根据本发明的另外的方面，提供了一种使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测疗法的方法。 [0245] 根据本发明的另外的方面，提供了一种使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种对哺乳动物的身体进行成像的方法。 [0246] 根据本发明的另外的方面，提供了一种使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测以下的疗法的方法：癌前状况和癌症中的一种或更多种，任选地结肠直肠癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌和肉瘤中的一种或更多种。 [0247] 根据本发明的另外的方面，提供了一种使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测cMet过表达或定位的部位的疗法的方法。 [0248] 根据本发明的另外的方面，提供了一种使用本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种获得，任选地体内获得cMet过表达或定位的部位的图像的方法。 [0249] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种的用途。 [0250] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测疗法中的用途。 [0251] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种作为成像剂的用途。 [0252] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测以下的疗法中的用途：癌前状况和癌症中的一种或更多种，任选地结肠直肠癌、食道癌、乳腺癌、前列腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胃癌和肉瘤中的一种或更多种。 [0253] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、监测疾病进展或监测cMet过表达或定位的部位的疗法中的用途。 [0254] 根据本发明的另外的方面，提供了本发明的第一方面的制剂和本发明的第三方面的药物组合物中的至少一种在获得，任选地体内获得cMet过表达或定位的部位的图像中的用途。 [0255] 如所描述的可选的特征和不同的实施方案适用于各个和每个方面及其各种和每种实施方案(加以必要的变更)。 [0256] 附图简述 [0257] 现将参考附图、以实例的方式描述本发明的实施方案，在附图中： [0258] 图1描绘了API(EMI-137)。 [0259] 详述 [0260] 如WO2008/139207中描述的光学成像剂用于进行一系列实验，以发现更稳定的制剂，所述更稳定的制剂显示出更好的重构，特别地在用于静脉内使用的适当pH值和/或张力显示出更好的重构。使用的化合物是如图1中示出的EMI-137。 [0261] 下文讨论的实验使用EMI-137的乙酸盐，但所有的重量和计算都使用游离离子进行。 [0262] 重构后，静脉内药物产品应是等渗溶液，并且具有使其适于静脉内施用的生理pH。 它也应是同质的，并且应溶解而不形成团聚物。然而，当溶解在水中时，EMI-137具有4.6的pH，并且显示出形成明显程度的较大结构或团聚物。在溶液的pH增加后，这种团聚仅是部分可逆的，因此使其不适于静脉内施用。因此，需要在重构时将处于适于静脉内施用的pH并且基本上是同质的且基本上没有团聚物或颗粒的制剂。此外，EMI-137具有相当短的货架寿命，并且因此出于实用和安全性的目的，其分离的形式不是太可用。因此，需要延长EMI-137的稳定性和货架寿命的制剂。 [0263] EMI-137的制备及使用其成像 [0264] 实施例1提供了cMBP肽(化合物1(包含SEQ-7))的合成。实施例2提供了作为阴性对照的相关肽的合成，其中化合物1的肽序列被打乱，产生化合物2，化合物2具有肽序列： [0265] Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys [0266] (SEQ-8)。 [0267] 实施例3提供了花菁染料Cy5**的合成。实施例4提供了Cy5**的活性酯的合成。实施例5提供了花菁染料与肽(cMBP肽和对照)的缀合。以这种方式比较了化合物3(包含SEQ- 7)、化合物4(包含SEQ-8)、化合物5(包含SEQ-7)、化合物6(包含SEQ-7)和化合物7(包含SEQ- 8)。实施例6提供了体外确定肽对cMet的亲和力的方法。结果显示，即使在附接了光学报告物成像部分(花菁染料)时，结合也是选择性的。实施例7提供了化合物5和化合物7在癌症动物模型中的体内测试数据。用化合物5观察到较高的肿瘤:背景比，而化合物7(阴性对照)无法区分肿瘤和背景。 [0268] 化合物的结构提供在下表2中。 [0269] [0270] [0271] 表2：化合物的结构 [0272] 实施例1：化合物1的合成 [0273] 步骤(a)：合成被保护的前体线性肽。 [0274] 前体线性肽具有以下结构： [0275] Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2(包含SEQ-7)。 [0276] 在Applied Biosystems 433A肽合成仪上使用Fmoc化学法从0.1mmol Rink Amide Novagel树脂开始组装肽基树脂H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物(包含SEQ-7)。在偶联步骤中应用过量的1mmol预活化氨基酸(使用HBTU)。将Glu-Thr假脯氨酸(Novabiochem 05-20-1122)掺入到序列中。将树脂转移至氮气鼓泡(bubbler)设备中，并且用溶解在DCM(5mL)中的乙酸酐(1mmol)和NMM(1mmol)的溶液处理60min。通过过滤去除酸酐溶液，并且将树脂用DCM洗涤，并在氮气流下干燥。 [0277] 同时去除侧链保护基团并从树脂中裂解肽，在含有2.5％TIS、2.5％4-硫代甲酚和 2.5％水的TFA(10mL)中进行2小时又30min。通过过滤去除树脂，在真空去除TFA，并且将乙醚添加至剩余物中。将形成的沉淀用乙醚洗涤，并风干，得到264mg的粗肽。 [0278] 通过制备型HPLC(梯度：40min内20-30％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/ 0.1％TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)50×21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：30min)纯化粗肽，得到100mg纯的化合物1线性前体。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：10min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1464.6，MH22+实测：1465.1)。 [0279] 步骤(b)：单环Cys4-16二硫桥的形成 [0280] Cys4-16； [0281] Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2(包含SEQ-7)。 [0282] 将来自步骤(a)的线性前体(100mg)溶解在5％DMSO/水(200mL)中，并且使用氨将溶液调节至pH 6。将反应混合物搅拌5天。然后使用TFA将溶液调节至pH 2，并且通过真空蒸发去除大部分溶剂。将剩余物(40mL)分批注射到制备型HPLC柱上，用于产物纯化。 [0283] 通过制备型HPLC(梯度：10min内0％B，然后40min内0-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250× 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：44min)纯化剩余物，得到72mg纯的化合物1单环前体。纯的产物(作为异构体P1至P3的混合物)通过分析型HPLC(梯度：10min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：5.37min(P1)；5.61min(P2)；6.05min(P3))分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1463.6，MH22+实测：1464.1(P1)； 1464.4(P2)；1464.3(P3))。 [0284] 步骤(c)：第二个Cys6-14二硫桥的形成(化合物1) [0285] 将来自步骤(b)的单环前体(72mg)在氮气覆盖(blanket of nitrogen)下溶解在 75％AcOH/水(72mL)中。将1M HCl(7.2mL)以及AcOH(4.8mL)中的0.05M I2以该顺序添加，并将混合物搅拌45min。添加1M抗坏血酸(1mL)，产生无色混合物。在真空蒸发掉大部分溶剂，并且将剩余物(18mL)用水/0.1％TFA(4mL)稀释，并且使用制备型HPLC将产物纯化。 [0286] 通过制备型HPLC(梯度：10min内0％B，然后40min内20-30％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250× 21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：43-53min)纯化剩余物，得到52mg纯的化合物1。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：10min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B ＝ ACN/ 0.1％ TFA，流速：0.3 mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μ C18 (2)50×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1391.5，MH22+实测：1392.5)。 [0287] 实施例2：化合物2的合成 [0288] Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2 [0289] 化合物2(包含SEQ-8)是其中化合物1的肽序列被打乱的阴性对照。 [0290] 步骤(a)：被保护的前体线性肽的合成 [0291] 在Applied Biosystems 433A肽合成仪上使用Fmoc化学法从0.1mmol Rink Amide Novagel树脂开始组装肽基树脂H-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Pro-Tyr(tBu)-Trp(Boc)-Glu(OtBu)-Phe-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(ΨMe,Mepro)-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物(包含SEQ-8)。在偶联步骤中应用过量的1mmol预活化氨基酸(使用HBTU)。将Tyr-Ser假脯氨酸(Novabiochem 05-20-1014)掺入到序列中。将树脂转移至氮气鼓泡设备中，并且用溶解在DCM(5mL)中的乙酸酐(1mmol)和NMM(1mmol)的溶液处理60min。通过过滤去除酸酐溶液，并且将树脂用DCM洗涤，并在氮气流下干燥。 [0292] 同时去除侧链保护基团并从树脂中裂解肽，在含有2.5％TIS、2.5％4-硫代甲酚和 2.5％水的TFA(10mL)中进行2小时又10min。通过过滤去除树脂，在真空去除TFA，并且将乙醚添加至剩余物中。将形成的沉淀用乙醚洗涤，并风干，得到216mg的粗肽。 [0293] 通过制备型HPLC(梯度：40min内20-30％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/ 0.1％TFA，流速：50mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250×50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：34.1min)纯化粗肽，得到溶解在200mL的ACN/水中的纯的DX-1662阴性对照线性前体。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：5min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.6mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)20×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.52min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1464.6，MH22+实测：1464.9)。 [0294] 步骤(b)：单环Cvs4-16二硫键的形成。 [0295] Cys4-16； [0296] Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys(Acm)-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys(Acm)-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2(包含SEQ-8)。 [0297] 将DMSO(10mL)添加至来自步骤(a)的阴性对照线性前体溶液中(200mL)，并且使用氨将溶液调节至pH 7。将反应混合物在40℃加热18小时，然后在60℃加热60min。使用TFA将溶液调节至pH 2，并且通过真空蒸发去除ACN。使剩余物经历制备型HPLC纯化。 [0298] 通过制备型HPLC(梯度：5min内0％B，然后60min内20-30％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：50mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250×50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：29.6min)纯化剩余物，得到溶解在100mL的ACN/水中的纯的阴性对照单环前体。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：5min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.6mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)20×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：3.46min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1463.6，MH22+实测：1463.7)。 [0299] 步骤(c)：第二个Cvs6-14二硫桥的形成(化合物2) [0300] Cys4-16，6-14； [0301] Ac-Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2(包含SEQ-8)。 [0302] 将来自步骤(b)的阴性对照单环前体溶液(100mL)用AcOH(100mL)稀释。在氩气覆盖下将1M HCl(5mL)以及AcOH(7mL)中的0.05M I2以该顺序添加，并将混合物搅拌20min。添加1M抗坏血酸(1mL)，产生无色混合物。在真空蒸发掉大部分溶剂，并且将剩余物(30mL)用水/0.1％TFA(100mL)稀释，并且使用制备型HPLC将产物纯化。通过制备型HPLC(梯度：10min内0％B，然后60min内20-30％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：50mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250×50mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：32.8min)纯化剩余物，得到30mg纯的化合物2。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：10min内10-40％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，并且B＝ACN/0.1％TFA，流速：0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：6.54min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH22+计算：1391.5，MH22+实测：1392.5)。 [0303] 实施例3：花菁染料2-{(1E,3E,5E)-5-[1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-5-磺基-1, 3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1,3-二烯基}-3-甲基-1,3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸酯(Cy5**)的合成 [0304] [0305] (3a)5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸 [0306] [0307] 将DMF(25ml)中的2-甲基乙酰乙酸乙酯(50g)逐滴添加至DMF(100ml)中的氢化钠(在矿物油中的12.0g的60％NaH)的悬浮液中，在冰浴情况下冷却1小时，(内部温度0-4℃)。 允许该混合物在搅拌下升温至环境温度持续45分钟，然后再次冷却。然后在15分钟内逐滴添加DMF(25ml)中的1,4-丁磺酸内酯(45g)溶液。将最终混合物在60℃加热18小时。通过旋转蒸发去除溶剂，并且将剩余物分配在水和乙醚之间。收集水性层，用新鲜乙醚洗涤，并且旋转蒸发，以得到粘性泡沫状物。将该中间体溶解在水(100ml)中，并且在搅拌下在15分钟内添加氢氧化钠(17.8g)。将混合物在90℃加热18小时。通过添加浓盐酸(～40ml)将冷却的反应混合物调节至～pH2。将溶液旋转蒸发，并且在真空下干燥。将黄色固体用含有2％盐酸的乙醇(3×150ml)洗涤。将乙醇溶液过滤，旋转蒸发，并且在真空下干燥，以得到黄色固体。 产量70g。 [0308] (3b)2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸,二钾盐 [0309] [0310] 将4-肼基苯磺酸(40g)、5-甲基-6-氧代庚烷-1-磺酸(来自3a；60g)和乙酸(500ml)混合并且在回流下加热6小时。将溶剂过滤，旋转蒸发，并且在真空下干燥。将固体溶解在甲醇(1L)中。向其中添加2M甲醇氢氧化钾(300ml)。将混合物搅拌3小时，并且然后使用旋转蒸发将溶剂体积降低50％。将所得沉淀过滤，用甲醇洗涤，并且在真空下干燥。产量60g。MS(LCMS)：MH+362。Acc.质量：实测，362.0729。MH+＝C14H2ONO6S2需要m/z 362.0732(-0.8ppm)。 [0311] (3c)2,3-二甲基-13-双(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸酯,二钾盐 [0312] [0313] 将2,3-二甲基-3-(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸(来自3b；60g)与1,4-丁磺酸内酯(180g)和四亚甲基砜(146ml)在140℃加热16小时。所得红色固体用乙醚洗涤，研磨成粉末，并且在真空下干燥。产量60g。 [0314] (3d)Cv5**，作为TFA盐 [0315] 将1-(5'-羧基戊基)-2,3,3-三甲基-溴化吲哚-5-磺酸，K+盐(2.7g)、丙二醛双(苯亚胺)单盐酸盐(960mg)、乙酸酐(36ml)和乙酸(18ml)在120℃加热1小时，以产生深棕红色溶液。将反应混合物冷却至环境温度。将2,3-二甲基-1,3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸酯(来自3c；8.1g)和乙酸钾(4.5g)添加至混合物中，将该混合物在环境温度搅拌18小时。将所得蓝色溶液用乙酸乙酯沉淀，并且在真空下干燥。粗染料通过液相色谱(RPC18.水+0.1％TFA/MeCN+0.1％TFA梯度)纯化。收集含有主染料峰的级分，汇集(pooled)并且在真空下蒸发，以产生标题染料2g。UV/Vis(水+0.1％TFA)：650nm。MS(MALDI-TOF)：MH+887.1。MH+＝C38H50N2O14S4需要m/z 887.1。 [0316] 实施例4：2-[(1E,3E,5E)-5-(1-{6-[2,5-二氧代吡啶-1-基)氧基]-6-氧代己基}- 3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基]戊-1,3-二烯基]-3-甲基-1,3-双(4-磺丁基)-3H-吲哚-5-磺酸酯，二异丙基乙胺盐(Cy5**的NHS酯)的合成 [0317] [0318] 将Cy5**(实施例3；10mg)溶解在无水DMSO(3ml)中；向其中添加HSPyU(20mg)和N,N'-二异丙基乙胺(80μl)。将所得溶液混合3小时，然后TLC(RPC18.水/MeCN)显示完全反应。 将染料通过在乙酸乙酯/二乙醚中沉淀进行分离，过滤，用乙酸乙酯洗涤，并且在真空下干+ + 燥。UV/Vis(水)650nm。MS(MALDI-TOF)MH983.5。MH＝C42H53N3O16S4需要m/z 984.16。 [0319] 实施例5：染料的缀合，化合物3至7的合成 [0320] Cys4-16，6-14； [0321] Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys(Cy5)-NH2(化合物3)(包含SEQ-7)。 [0322] 将化合物1(10mg)、NMM(4μL)和Cy5 NHS酯(5.7mg；GE Healthcare PAl 5104)中溶解在NMP(1mL)中，并且将反应混合物搅拌7小时。然后将反应混合物用5％ACN/水(8mL)稀释，并且使用制备型HPLC将产物纯化。 [0323] 通过制备型HPLC(梯度：40min内5-50％B，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，并且B＝ACN/ 0.1％HCOOH，流速：10mL/min，柱：Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，检测：UV 214nm，产物保留时间：35.5min)纯化粗肽，得到8.1mg纯的化合物3。纯的产物通过分析型HPLC(梯度：10min内5-50％B，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，并且B＝ACN/0.1％HCOOH，流速： 0.3mL/min，柱：Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测：UV 214nm，产物保留时间： 2+ 2+ 8.15min)分析。使用电喷雾质谱进行进一步的产物表征(MH2 计算：1710.6，MH2 实测： 1711.0)。 [0324] 以类似的方式制备化合物4—电喷雾质谱(MH22+计算：1710.6，MH22+实测：1710.9)。 [0325] 通过类似方法制备其他染料-肽缀合物(化合物5至7)。Alexa647从Molecular Probes(A20106)购买： [0326] 化合物5(MH22+计算：1825.7，MH22+实测：1825.9)， [0327] 化合物6(MH22+计算：1811.7，MH22+实测：1812.0)， [0328] 化合物7(MH22+计算：1825.7，MH22+实测：1826.2)。 [0329] 实施例6：体外荧光偏振测定 [0330] 荧光偏振方法的原理可以简述如下： [0331] 单色光通过水平偏振滤光片，并且使样品中的荧光分子激发。仅那些在垂直偏振面上正确取向的分子才会吸收光，受到激发，并且随后发射光。在水平面和垂直面二者上测量发射的光。各向异性值(A)是光强度之间的比率，遵循以下等式： [0332] A＝(水平偏振片的强度-垂直偏振片的强度)/(水平偏振片的强度+2*垂直偏振片的强度)。 [0333] 荧光各向异性测量使用Tecan Safire荧光偏振板读取仪(Tecan,US)在ex646/em678nm处在384孔微孔板中以结合缓冲液(PBS,0.01％Tween-20,pH 7.5)中的10μL的体积进行。染料标记的肽的浓度保持恒定(20nM)，并且人类或小鼠cMet/Fc嵌合体(R&D Systems)或Semaphorin 6A(R&D Systems)的浓度从0-150nM变化。将结合混合物在微孔板中在30℃平衡10分钟。将观察到的各向异性变化拟合至以下等式： [0334] [0335] 其中robs是观察到的各向异性，r游离是游离肽的各向异性，r结合是结合肽的各向异性，KD是解离常数，cMet是总cMet浓度，并且P是总的染料标记的肽浓度。该等式假设合成肽和受体在溶液中以1:1的化学计量形成可逆复合物。使用GraphPad Prism软件经由非线性回归进行数据拟合，以获得KD值(单位点结合)。 [0336] 测试化合物3和化合物4对人类和小鼠cMet(Fc嵌合体)的结合。结果显示化合物3与人类c-Met结合的KD为3+/-1nM。化合物4不与人类cMet结合。此外，化合物3和化合物4在测试范围内未显示出与小鼠cMet的结合。 [0337] 使用相同的方法，发现化合物5对于人类cMet具有1.1nM的KD。 [0338] 实施例7：化合物5和化合物7的体内测试 [0339] (a)动物模型 [0340] 在本研究中使用54只雌性BALB c/A裸(Bom)小鼠。动物的使用经当地伦理委员会批准。BALB c/A裸鼠是近交免疫受损小鼠系，与其他裸鼠系相比具有对人类肿瘤的高接纳率(take rate)。小鼠在到达时是4周龄，并且在研究开始时体重为约20克。将动物安置在具有HEPA过滤的空气的单独通风的笼子里(IVC,Scanbur BK)。动物不限制进食“大鼠和小鼠nr.3繁殖(Rat and Mouse nr.3Breeding)”饮食(Scanbur BK)和通过添加HCl酸化至1mM摩尔浓度(pH 3.0)的自来水。 [0341] 结肠 癌细胞H CT-1 5来源于 人类结 肠癌 ，并 且根据Ze ng等 人 [Clin.Exp.Metastasis,21,409-417.(2004)]报道，表达cMet。细胞系被证明在皮下接种到裸小鼠中时是致瘤性的[Flatmark等人，Eur.J.Cancer 40,1593-1598(2004)]。 [0342] 将HCT-15细胞在具有10％血清和青霉素/链霉素的RPMI(Sigma Cat#R0883)中生长和制备用于皮下接种。储备液在传代数四(P4)时制备，并且在液氮中在含有5％DMSO的培 7 养基中以3×10 个细胞/小瓶冷冻储存。在移植当天，将细胞在37℃水浴中快速解冻(约 2min)，洗涤并重悬在PBS/2％血清中(以1200rpm离心10min)。每次将细胞吸入给药注射器时，确保小瓶中的细胞充分混合。当动物处于轻度气体麻醉下时，使用细孔针(25G)将0.1ml体积的细胞悬浮液皮下(s.c.)注射在肩部和背部处。然后将动物放回其笼子中，并且允许肿瘤生长13-17天。在接种程序前，允许动物有至少5天的适应时间段。 [0343] (b)程序 [0344] 所有测试物质都用PBS由冷冻干燥粉末重构。将一小叠白色打印纸成像，以获得用于校正照射不同质性(illumination inhomogeneity)的平场图像。在物理固定期间，将测试物质静脉内注射到外侧尾静脉中。注射体积是0.1ml，这对应于每只动物1nmol测试物质的剂量。注射后，将动物放回其笼子中。在成像前立即通过颈脱位处死动物。基于有限数目的动物(n＝1-6)中的皮肤和肌肉组织中洗出速率(wash out rate)的比较，估计每种测试物质的最佳成像时间点。化合物3和化合物4的成像时间点是注射后120分钟。对于每只动物，死后将皮下生长的肿瘤切下。从其中一个肿瘤的边缘切下约1.6mm厚且直径3-4mm的薄片。然后针对来自同一动物的正常结肠区域对肿瘤切片进行成像。 [0345] (c)成像 [0346] 通过临床腹腔镜进行成像，该临床腹腔镜适于使用光源来激发报告物并且使用过滤系统来提取荧光组分。635nm激光器用于使报告物分子激发。Hamamatsu ORCA ERG CCD相机用作检测器。相机以2×2合并模式(binning mode)操作，具有0增益。结肠成像的标准曝光时间是10s。系统校准测量表明，对动物成像系统的10s曝光时间对应于对临床相关光源、视场和离组织表面的距离的40毫秒曝光。通过系统校准数据，针对照射异质性校正图像中的强度分布。从置于肿瘤上的感兴趣区域和正常结肠背景计算靶与背景比。使用用于接收者操作特性分析的标准评分系统对图像进行视觉评分。 [0347] (d)结果 [0348] 化合物5具有1.46:1的肿瘤与正常比，并且对应的具有相同染料的打乱的对照肽(化合物7)具有1.04:1的比值。化合物5易于识别肿瘤，而用化合物7不可辨别除背景外的事物。 [0349] 冻干EMI-137制剂的制备 [0350] 制剂需要有效地冷冻干燥(例如，没有凸起(bumping)或塌缩)，以提供稳定的同质固体。如先前提到的，EMI-137在水中的pH是约4.6，这不适于静脉内施用。因此，对制剂的进一步要求是，在重构时，处于适于静脉内施用的pH。此外，重构时制剂的张力必须适于静脉内施用。另外的益处将是制剂可在室温储存，但冷藏也是可以接受的。 [0351] 初始制剂研究显示，具有小于约pH 6.8的pH的制剂倾向于团聚。因此，任何以低于 6.8的pH提供的制剂都被认为是不可接受的。此外，已知在多于约pH 8(在一些情况下高达约pH 9)的pH，存在二硫桥(在EMI-137中存在两个)降解的风险。因此，获得在重构时提供足够高以避免团聚但又足够低以减轻二硫桥降解的风险的pH的制剂将是有益的。 [0352] 因此，为了在重构时将EMI-137溶液的pH维持在可接受的范围内，在冷冻干燥前包含缓冲剂是必要的。研究显示，在富含氯化钾的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的存在下，EMI-137溶液的粘度增加，并且发展出大量凝胶形成。当EMI-137溶解在pH 7.4的磷酸钠缓冲液中时，未观察到这种胶凝作用。因此，NaCl和KCl的使用被认为不重要(由于胶凝问题)。 [0353] 冻干过程如表3中强调地进行。 [0354] [0355] [0356] 表3：冻干参数 [0357] 冻干如下进行。 [0358] 将如下文表4A至4F中强调的制剂成分添加至合适的冻干容器中。注意，所有列出的组分(包括缓冲剂)都在冻干前添加。 [0359] 装载阶段在约-40℃进行。然后将温度降低至约-55℃。冷却速率可以是约1.5℃/分钟。然后将混合物保持在稳态冷冻条件至少两小时。然后将压力降低至50μ巴，耗费约45分钟。然后将温度增加至约-38℃，进行初次干燥阶段。加热速率是约1℃/分钟。然后将混合物保持在稳态冷冻条件约9天。然后在至少10小时时间段(初次至二次干燥过渡阶段，或“缓变阶段”)内以约6.8℃/小时的速率将混合物加热至约30℃。然后将混合物保持在稳态二次干燥条件约6小时。然后，以约1℃/分钟的速率将混合物冷却至约20℃，然后添加顶部空间气体(即惰性气体，诸如氩气或氮气)，从而释放冻干容器中的真空。然后将产物在5℃卸载/储存。 [0360] 初次干燥步骤、缓变阶段和二次干燥步骤都通过将混合物置于约50μ巴的真空下进行。该压力可以在初次干燥阶段引入，并且然后维持到储存/卸载阶段。 [0361] 已知使用缓冲剂诸如磷酸钠会在冷冻期间引起pH向低pH移动，并且因此，由于冷冻浓缩物的玻璃化转变温度将较低，预期制剂在不塌缩的情况下冷冻干燥是有挑战的。因此，本发明包括一种合二为一的张力调节剂和冻干保护剂。甘露醇是冷冻干燥中最广泛使用和经记载的填充剂之一，但是已经报道了几个热问题(thermal issue)和结晶并发问题(complication)，这可能潜在地影响生产和产品稳定性。因此，使用单独的甘露醇通常被认为不利于冻干，并且已知会引起几个问题。 [0362] 由于本发明中的缓冲剂和冻干保护剂的组合难以在不经历冷冻干燥饼状物(cake)的塌缩的情况下冷冻干燥，因此需要定制的冷冻干燥循环。选择具有足够低的真空和货架温度的冷冻干燥循环，以达到低的冰温，以防止冷冻干燥饼状物的这种回融/塌缩。 必须避免冷冻干燥饼状物的塌缩，以防止EMI-137在冷冻干燥过程的干燥步骤期间形成较大的结构/团聚物(发现这在小于6.8的pH发生，并且不是完全可逆的)。 [0363] 一些初始制剂研究后，并且鉴于以上情况，选择以下变量用于进一步测试： [0364] ·缓冲剂：磷酸钠或Tris HCl(25mM、40mM和55mM)； [0365] ·冻干保护剂：蔗糖或甘露醇。 [0366] 冻干制剂的实例 [0367] 如表4A至4F中示出的，采用具有四变量的因素设计与混合水平设计的组合对制剂候选物进行研究。设计由以下构成：具有四变量(样品1至8)、四中心点(样品10至13)的部分两水平设计，以及具有活性药物成分(API)的三水平以及缓冲剂类型和冻干保护剂类型分类变量的两水平(样品14至21)的混合水平设计。此外，包括多种参考样品(样品22至24)。还研究了另外两个样品(样品25和26)。样品25是指在1mL水中冷冻干燥前的溶液的组成，并且样品26是指基于先前样品的结果制备的另外的典型制剂。 [0368] [0369] [0370] 表4A：制剂筛选设计(mg/ml) [0371] [0372] [0373] 表4B：制剂筛选设计(mg) [0374] [0375] 表4C：制剂筛选设计(mmol) [0376] [0377] 表4D：制剂筛选设计(摩尔比) [0378] [0379] [0380] 表4E：制剂筛选设计(冷冻干燥前的％w/w) [0381] [0382] [0383] 表4F：制剂筛选设计(冷冻干燥后的％w/w) [0384] 以上表4A至4F中提到的(1)、(2)、(3)和(4)如下： [0385] (1)0.25mg/mL无水NaH2PO4+3.25mg/mL无水Na2HPO4 [0386] (2)0.56mg/mL无水NaH2PO4+7.14mg/mL无水Na2HPO4 [0387] (3)0.41mg/mL无水NaH2PO4+5.19mg/mL无水Na2HPO4 [0388] (4)0.50877mg/mL无水NaH2PO4+6.49467mg/mL无水Na2HPO4 [0389] 使用的无水和水合的磷酸钠的量示于下文表5中。 [0390] [0391] 表5：等同量的水合磷酸钠 [0392] 制剂中使用的摩尔质量如下： [0393] ·磷酸二氢钠(无水)＝119.98g/mol [0394] ·磷酸氢二钠(无水)＝141.96g/mol [0395] ·Tris HCl＝121.14g/mol [0396] ·甘露醇＝182.17g/mol [0397] ·蔗糖＝342.29g/mol [0398] ·EMI-137＝3,650.3g/mol [0399] 由以上可知，磷酸钠缓冲剂范围在冷冻干燥前＝4.26-18.26％w/w，且在冷冻干燥后＝9.78-35.22％w/w，而Tris HCL缓冲剂范围在冷冻干燥前＝3.27-12.63％w/w，且在冷冻干燥后＝3.27-12.63％w/w。 [0400] 制剂中使用的物质列于下文表6中。 [0401] [0402] [0403] 表6：筛选制剂中使用的材料 [0404] 筛选研究之后是在25℃和40℃的4周预稳定性研究。这组实验被设计成实现对所选择的缓冲剂和冻干保护剂的筛选，和测试在产生在相关API浓度(靶浓度4.8mg/ml)周围的稳健性二者。研究了靶浓度周围±10％的范围。设计还会揭示EMI-137、缓冲剂和冻干保护剂之间的潜在相互作用。由于所有样品都制备为等渗的，缓冲剂浓度和冻干保护剂浓度是协变量。测试参数示于表7中。除了在冷冻干燥前对散装溶液进行过程中测试之外，测试还包括来自冷冻步骤的样品，以揭示潜在的不稳定性是否可归因于冷冻或干燥过程。 [0405] [0406] n.a.＝不适用 [0407] 表7：测试参数 [0408] 冻干制剂结果 [0409] 在2℃至8℃多达102个月、在30℃多达61个月和在40℃多达6个月的稳定性数据分别示于表8A至8C、表9A至9C和表10中(使用以下关键字/缩写：Amb＝环境湿度，未调节；NMT＝不多于；ND＝未检测到；---:未进行；*因暑假推迟的24个月取样点；**另外的取样点)。 [0410] [0411] [0412] 表8A：EMI-137制剂在5℃储存102个月的稳定性 [0413] [0414] [0415] 表8B：EMI-137制剂在5℃储存102个月的稳定性 [0416] [0417] [0418] 表8C：EMI-137制剂在5℃储存102个月的稳定性 [0419] [0420] [0421] 表9A：EMI-137制剂在30℃储存61个月的稳定性 [0422] [0423] [0424] 表9B：EMI-137制剂在30℃储存61个月的稳定性 [0425] [0426] [0427] 表9C：EMI-137制剂在30℃储存61个月的稳定性 [0428] [0429] [0430] 表10：EMI-137制剂在40℃储存6个月的稳定性 [0431] 测试参数示于以上(表7)。纯度通过HPLC在650nm处的UV/视觉检测进行测试，并表示为％面积单位。将团聚表示为通过光子相关光谱(PCS)测量的散射强度。冷冻干燥后重构和视觉外观的评估遵循被开发来描述冷冻干燥饼状物的多种特性的分级系统。 [0432] 冷冻干燥后的视觉外观 [0433] 通常，甘露醇的良好填充特性给予所有含甘露醇的制剂非常好的结构。与甘露醇-Tris-HCl制剂相比，含甘露醇-磷酸盐的饼状物看起来在瓶壁上具有不同质的蓝色/白色。 由于药物物质呈深蓝色，这些颜色梯度变得非常明显。不同质的外观预期部分源于冷冻固有的随机特性，且部分源于制剂的特性。当用水重构时，产品是同质的溶液。其他分析结果(无论是初始还是在预稳定性时间段期间)，均指示不同质的外观可以被认为是纯粹的表面问题。在冷冻干燥期间，蔗糖与Tris-HCl组合倾向于不同程度的塌缩/融化。观察到瓶与瓶之间有相当大的差异，因为50％的批次有冷冻干燥饼状物，没有明显的塌缩。在40℃储存后，七天后就已经观察到部分塌缩的塞状物(plug)逐渐发展成完全塌缩的物质。这可能是由于塌缩物质中水浓度升高。储存期间观察到的大量塌缩对纯度、重构和形成团聚物的趋势具有负面影响。 [0434] 冷冻干燥后的重构 [0435] 所有含有冻干保护剂的缓冲制剂采用非常温和的旋转几秒容易地重构。具有未塌缩和中度塌缩的塞状物的样品储存四周后(25℃和40℃)的结果不变。大量塌缩的冷冻干燥塞状物很难重构。这些产品还具有差的纯度，并且含有团聚物。不具有冻干保护剂的制剂(样品22至24)需要更多的混合进行重构，但仍被认为是可接受的。 [0436] pH [0437] 对于磷酸钠缓冲制剂，在冷冻干燥期间，pH是稳定的，但在40℃储存四周期间降低。Tris-HCl缓冲制剂在冷冻干燥期间具有pH降低，但在40℃储存期间通常更稳定。pH结果难以解释，并且化学计量分析没有给出清楚的解释(a clear picture)。没有可归因于甘露醇或蔗糖的趋势。然而，清楚的是，磷酸盐缓冲剂浓度的增加会减轻储存期间的pH下降。在低缓冲剂浓度，随着EMI-137浓度更高，pH下降会增加。Tris-HCl制剂对增加的EMI-137药物物质浓度甚至更敏感。这指示应选择较高测试范围内的缓冲剂浓度。 [0438] 团聚物(PCS) [0439] 在冷冻干燥前和后，以及在四周的预稳定性时间段结束时，通过PCS测试每种制剂中的大的结构/团聚物的存在。中心点制剂(样品10至13)也在一周和两周后测试。低于约 20ks/s的值被认为是背景，而不是判断为团聚物。冷冻干燥前，在任何散装溶液中都没有检测到团聚物。在冷冻干燥后，所有含有冻干保护剂的制剂都被判断没有较大的结构/团聚物。除了大量塌缩的样品(样品17)和在水中含有EMI-137的非缓冲样品24之外，在40℃储存四周后，所有样品仍然没有团聚物。后一种制剂具有4.2的pH。在低pH的团聚与先前的初始发现一致。然而，没有冻干保护剂(蔗糖或甘露醇)的磷酸盐缓冲制剂在冷冻干燥后确实含有团聚物(样品23)。对重构样品的分析显示存在约100nm的大结构。团聚物在干燥过程期间而非冷冻步骤期间形成，因为在冷冻后抽取的样品中未发现团聚物。已知，磷酸钠缓冲剂形成pH梯度，并且在冷冻期间由于磷酸盐的溶解度和结晶度的差异而使pH向低值变动。据报道，pH低至3.5。在该pH，EMI-137溶液中会形成团聚物。尽管是冷冻的，在冷冻干燥期间长时间处于该pH段可能潜在地导致团聚物形成。据信甘露醇和蔗糖防止这种情况发生。(Tris-HCl制剂中不需要冻干保护剂。在冷冻期间，Tris-HCl会使pH向高pH(>9)变动。)得出的结论是，显著的回融/塌缩影响药物产品的团聚物水平，且应予以避免。确认了在低pH会形成团聚物。当磷酸盐缓冲剂用作冷冻干燥期间的成分时，需要冻干保护剂来防止EMI-137在冷冻干燥过程的干燥步骤期间形成较大的结构/团聚物。 [0440] 差示扫描量热法(DSC) [0441] 将代表制剂设计中的中心点的制剂作为冷冻浓缩样品通过DSC进行分析。将约20μl样品包含在密封的铝坩埚中，并且使用Perkin Elmer Diamond DSC仪器分析。将样品以5℃/min冷却至-80℃，并且在-80℃保持10分钟，然后在氮气气氛下以5℃/min加热至24℃。 所有计算都基于加热时收集的数据进行。 [0442] 甘露醇制剂 [0443] Tris-HCl甘露醇制剂具有复杂的热谱图，显示三个不同的玻璃化转变和两个结晶峰。尽管一个玻璃化转变低于-60℃，但未观察到冷冻干燥饼状物的可见塌缩。这可能是由于结晶甘露醇的填充特性。磷酸盐-甘露醇制剂热谱图显示两个玻璃化转变和一个结晶峰。 其中一个玻璃化转变发生在-50℃和-60℃之间，这明显低于普通冷冻干燥机的实际操作温度。另一个玻璃化转变发生在约-41℃，这接近设计冷冻干燥循环时的操作极限。除了冷冻干燥饼状物的轻微收缩之外，不存在磷酸盐-甘露醇制剂的宏观回融/塌缩。预期甘露醇已经部分结晶，并且甘露醇的结晶部分足以给予冷冻干燥产品机械稳定性。在–27.6℃(Tcryst onset)观察到的放热结晶峰对应于甘露醇的潜在失透温度(potential devitrification temperature)，因为在加热制剂时，重结晶可能发生在稍高于甘露醇的Tg’(-33℃至-27℃)。 [0444] 蔗糖制剂 [0445] 含蔗糖制剂的热谱图显示与玻璃化转变一致的两个热事件，分别为远低于-50℃和在约-35℃至-37℃。未观察到任何含蔗糖制剂的结晶或共晶熔融峰(eutectic melting peak)，与蔗糖的含量一致。然而，如果与来自吸热融化水的低温侧的高得多的热流重叠，则会使来自非常小的结晶反应的热流不可辨别。在一些含TrisHCl-蔗糖的小瓶中观察到显著的可见塌缩，但在含磷酸盐-蔗糖的制剂中没有观察到。虽然DSC数据可以解释为有利于含磷酸盐-蔗糖制剂(样品13)，但得出的结论是，仅12个小瓶的分批规模太小，以至于无法确定是否可能预期磷酸盐-蔗糖制剂出现类似的问题。 [0446] 近红外分析(NIR) [0447] 熟知，甘露醇在冷却和再加热二者期间具有强的从冷冻水性溶液中结晶的趋势，并且还已经观察到在冷冻干燥后继续结晶，因为冷冻干燥过程可能产生部分未结晶、部分结晶的物质。冷冻干燥期间的结晶可能导致不同的无水多晶型物(α、β、δ)及其混合物，这为储存期间的多晶型转化留下了空间。 [0448] 结合主成分分析的初步NIR研究指示，小瓶之间存在结构差异，这归因于不同程度的结晶。 [0449] HPLC纯度 [0450] HPLC纯度谱显示，与纯的EMI-137相比，磷酸盐和Tris-HCl制剂两者具有非常相似的纯度谱并且还有相似的降解模式。此外，含蔗糖和甘露醇的制剂具有相似的纯度谱。发现了一些峰之间的一些小的比例差异。与EMI-137药物物质相比，在任何制剂中都未观察到新的峰。然而，在视觉外观分析期间，观察到蔗糖与Tris-HCl组合引起小瓶与小瓶之间关于塌缩小瓶的可变性，因为一些小瓶具有完美的外观，而其他小瓶具有明显塌缩的冷冻干燥饼状物。由于Tris HCl和磷酸钠二者都是具有低Tg’的物质，12个小瓶的分批规模被判断为太小，以至于无法揭示含磷酸盐-蔗糖制剂的潜在类似问题。 [0451] 化学计量分析总结 [0452] 化学计量建模集中于在40℃多达四周的时间段内随着多种冷冻干燥制剂变化的HPLC纯度变化、鉴定降解的对比未降解的冷冻干燥小瓶的显著变化的NIR光谱的化学变化，以及由PCS测量的团聚物变化。化学计量建模表明，与磷酸盐缓冲制剂相比，所有含Tris-HCl的制剂都会具有更多的降解，尽管从HPLC纯度数据的可视比较中可能不容易检测到这一点。化学计量分析的响应面(response surface)表明，Tris-HCl浓度的增加导致降解和化学相互作用的增加。通常，得出的结论是，在化学降解方面，含Tris HCl制剂比磷酸盐更难预测。这得到了从样品10至12(代表筛选研究中的中心点)获得的NIR光谱的主成分分析(PCA)以及NIR光谱和HPLC纯度之间的相关性的支持。 [0453] 用含磷酸钠制剂制成的化学计量模型是精确且可靠的。磷酸盐缓冲制剂与蔗糖组合因为几乎没有发生降解，在测试的制剂空间内是化学上非常稳定的。然而，需要更多的测试来确认冷冻干燥期间的塌缩不会是潜在问题。从所有分析的参数来判断，得出的结论是磷酸钠与甘露醇组合提供合适的制剂。 [0454] 稳健性/设计空间 [0455] 虽然HPLC追踪显示缓冲剂浓度似乎对降解谱并不重要，但化学计量分析表明，当制剂含有甘露醇时，可以预期增加的磷酸盐浓度产生化学上更稳定的产品。响应面显示特别稳定的区域高于40mM缓冲剂浓度，在此区域降解不受EMI-137浓度的显著影响。测试了EMI-137靶浓度周围±10％的设计空间。这包括药物物质含量的正常规格范围。发现，在较高的缓冲剂浓度，EMI-137浓度在该范围内的变化几乎不影响纯度，在制造期间为制剂提供了足够的稳健性。pH变化的响应面证明，磷酸钠缓冲剂浓度的增加降低储存期间的pH变化。 还确认，如果缓冲剂浓度太低，制剂会对EMI-137浓度的变化没有稳健性。当EMI-137浓度在与靶浓度(4.8mg/ml)相差±10％变化时，在高于40mM的缓冲剂浓度，pH变化小于0.2个pH单位。高于50mM，在储存期间预测的pH变化小，并且对EMI-137浓度和缓冲剂浓度二者的变化是稳定的，在制造期间为制剂提供良好的稳健性。多变量分析显示，缓冲剂浓度可以在40- 55mM之间变化，其中药物浓度在4.3mg/ml和5.3mg/ml之间变化，而不影响药物产品的质量。 [0456] cMet受体亲和力体外测试 [0457] 测试了样品11对c-Met受体的亲和力，并且显示出与纯的EMI-137药物物质的亲和力等同的结合数据。得出的结论是，甘露醇-40mM磷酸盐制剂不会不利地影响肽与靶受体的结合。 [0458] 冻干制剂结果的讨论 [0459] 如以上表中示出的，EMI-137制剂即使在升高的温度在长时间段(102个月)内仍然保持稳定，因此其具有延长的货架寿命。还值得注意的是，在测量的时间尺度内，产品不存在降解的趋势，这是异常稳定性的证据。此外，令人惊讶的是，在测量时间段内实际上没有有关物质(即杂质)形成，并且不存在这些物质形成的趋势。此外，在重构时，制剂具有适于静脉内施用的pH(约pH 7.5)，并且溶解时不团聚。此外，干燥的冻干固体保留异质的蓝色外观。还值得注意的是，重构的制剂在重构后多达24小时内仍然保持稳定并且基本上不含有关物质。因此，已经显示出EMI-137制剂在干燥(冻干)和重构形式二者时均非常稳定。 [0460] 基于分析结果和化学计量分析，得出以下结论。 [0461] 在制备和冷冻干燥期间，制剂中具有缓冲剂是必要的，以维持中性pH且避免团聚。 基于对所有结果的化学计量分析，磷酸钠缓冲制剂被判断为比TrisHCl制剂更稳健。最小的磷酸盐缓冲剂浓度应是40mM。为了将磷酸盐缓冲制剂冷冻干燥以防止干燥过程期间团聚物形成，需要冻干保护剂。甘露醇显示出具有良好的冻干保护剂活性。大量塌缩的冷冻干燥饼状物难以重构，具有差的纯度，并且有形成团聚物的趋势。这在具有中等但仍清晰可见的回融/塌缩的小瓶中未观察到。含磷酸钠-蔗糖制剂被认为是化学上最稳健的制剂，但从冷冻干燥的角度来看，可能不那么稳健。冷冻干燥的磷酸钠-甘露醇制剂具有异质的外观，并且由于在冷冻干燥饼状物中出现颜色梯度，因此不如Tris HCl-甘露醇制剂“药物上精美”。这被预测源于冷冻阶段，并且得出的结论为是可接受的，因为产品在重构后形成同质的溶液。 含Tris HCl制剂通常具有较少预测数据，并且基于化学计量分析，这些制剂被认为是潜在的有更大风险(尽管仍然有效)的选择。研究的总体结论是，基于可用的有限的预稳定性数据、分析数据的化学计量分析和稳健性考虑，尽管Tris HCl和蔗糖也可以独立地用作替代品，含磷酸钠-甘露醇制剂被认为提供风险、可预测性和可接受性的令人满意的平衡。 [0462] 总结 [0463] 本发明教导了，为了获得足够的API稳定性，需要冷冻干燥的药物产品制剂。重构后，药物产品应是等渗溶液，并且具有使其适于静脉内施用的生理pH。EMI-137在水中具有 4.6的pH，并且显示出形成显著程度的较大结构或团聚物。在溶液的pH增加后，这种团聚仅是部分可逆的，因此使其不适于静脉内施用。因此，大于6.8且小于9(或可能更低)的pH是有利的，因为在该pH范围内未观察到团聚物的形成。该pH范围应被始终维持，并且还应被应用在制造散装药品溶液期间。因此，为了将EMI-137溶液的pH维持在可接受的范围内，在冷冻干燥前在溶液中包含缓冲剂是有益的。还有利的是，包含冻干保护剂以确保EMI-137在冷冻干燥期间不降解，以及张力调节剂(其可以是与冻干保护剂相同的物质)以确保重构的产品是等渗的和/或适于静脉内施用。 [0464] 使用如以上描述的缓冲剂和冻干保护剂/张力调节剂提供稳定的并且在重构时处于适于静脉内施用的pH和张力的同质固体。此外，描述的制剂在冻干期间保持足够的pH，以防止团聚发生，并且不导致EMI-137中二硫桥的破坏。此外，制剂可在室温储存延长的时间段而不显著降解，并且在重构时和重构后保持稳定。 [0465] 如以上提到的，为了在重构时将EMI-137溶液的pH维持在可接受的范围内，在冷冻干燥前包含缓冲剂是必要的。 [0466] 在不偏离本发明的范围和精神的情况下，所描述的本发明的实施方案的多种修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。尽管本发明已经结合具体实施方案进行描述，应理解，如要求保护的本发明不应被过度限于这样的具体实施方案。事实上，对本领域技术人员明显的是，对实施本发明所描述的方式的各种修改意在被本发明涵盖。 [0467] 缩写 [0468] 使用常规单字母或三字母氨基酸缩写。 [0469] Acm：乙酰胺甲基 [0470] ACN(或MeCN)：乙腈 [0471] Boc：叔丁氧羰基 [0472] DCM：二氯甲烷 [0473] DMF：二甲基甲酰胺 [0474] DMSO：二甲基亚砜 [0475] Fmoc：9-芴甲氧羰基 [0476] HBTU：O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 [0477] HPLC：高效液相色谱 [0478] HSPyU：O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基六氟磷酸脲(O-(N- succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyleneuronium hexafluorophosphate) [0479] NHS：N-羟基-琥珀酰亚胺 [0480] NMM：N-甲基吗啉 [0481] NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮 [0482] Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基 [0483] PBS：磷酸盐缓冲盐水 [0484] tBu：叔丁基 [0485] TFA：三氟乙酸 [0486] TIS：三异丙基硅烷 [0487] Trt：三苯甲基 [0488] Tris HCl：2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇盐酸盐 [0489] 序列表自由文本 [0490] SEQ-1 [0491] Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6 [0492] Xaa1是Asn、His或Tyr； [0493] Xaa2是Gly、Ser、Thr或Asn； [0494] Xaa3是Thr或Arg； [0495] Xaa4是Ala、Asp、Glu、Gly或Ser； [0496] Xaa5是Ser或Thr；并且 [0497] Xaa6是Asp或Glu； [0498] 17-mer cMET结合肽。 [0499] SEQ-2 [0500] Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6 [0501] Xaa1是Asn、His或Tyr； [0502] Xaa2是Gly、Ser、Thr或Asn； [0503] Xaa3是Thr或Arg； [0504] Xaa4是Ala、Asp、Glu、Gly或Ser； [0505] Xaa5是Ser或Thr；并且 [0506] Xaa6是Asp或Glu； [0507] 18-mer cMET结合肽。 [0508] SEQ-3 [0509] Ala-Gly-Ser-Cysa-Xaa1-Cysc-Xaa2-Gly-Pro-Pro-Xaa3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Gly-Thr [0510] Xaa1是Asn、His或Tyr； [0511] Xaa2是Gly、Ser、Thr或Asn； [0512] Xaa3是Thr或Arg； [0513] Xaa4是Ala、Asp、Glu、Gly或Ser； [0514] Xaa5是Ser或Thr；并且 [0515] Xaa6是Asp或Glu； [0516] 22-mer cMET结合肽。 [0517] SEQ-4 [0518] Gly-Gly-Gly-Lys [0519] 是cMET结合肽的一部分的四肽序列。 [0520] SEQ-5 [0521] Gly-Ser-Gly-Lys [0522] 是cMET结合肽的一部分的四肽序列。 [0523] SEQ-6 [0524] Gly-Ser-Gly-Ser-Lys [0525] 是cMET结合肽的一部分的五肽序列。 [0526] SEQ-7 [0527] Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys [0528] 26-mer cMET结合肽。 [0529] SEQ-8 [0530] Thr-Gly-Glu-Cys-Thr-Cys-Pro-Tyr-Trp-Glu-Phe-Arg-Pro-Cys-Glu-Cys-Gly-Ser-Tyr-Ser-Gly-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys [0531] 26-mer打乱的cMET结合肽(阴性对照)。